Summary
分離したフローティング e10.5 膵前駆細胞と関連付けられて間充織から 3 D マウス pancreatoids を表現するインスリンを生成するプロトコルを紹介します。
Abstract
膵臓は、血液グルコースの恒常性と消化を調節する一緒に働く多くの異なったセルタイプから成る複雑な器官です。これらの細胞型には酵素分泌腺房細胞、腸、およびホルモン産生の内分泌細胞に酵素の輸送を担う葉状管システムが含まれます。
内分泌のベータ細胞は、血糖値を下げるインシュリンを作り出すボディの唯一のセル タイプです。糖尿病、損失または β-細胞の障害によって特徴づけられる病気大流行に達しています。したがって、スクリーニング目的のため使用して、薬物および細胞ベースの治療を派生できます β 細胞の開発を調査するためのプロトコルを確立することが不可欠です。マウス開発の実験的調査が不可欠ですが、生体内での研究は手間と時間がかかるです。培養細胞のスクリーニング; もっと便利なプラットフォームを提供します。しかし、彼らは細胞の多様性、建築の組織、および発見した細胞間相互作用を維持することは体内。したがって、膵の形態形成と生理学を調査するための新しいツールの開発が不可欠です。
細胞を整理して複雑な生理学的に有能な大人の臓器に分化膵上皮細胞器官形成の発症から間充織と密接に関連開発します。膵間充織は、多くのよく理解されていません、まだこうして体外培養中に要約することは困難内分泌の開発のための重要な信号を提供します。ここでは、pancreatoids と呼ばれる、間充織を保持文化複雑なマウスの立体化、細胞オルガノイドするプロトコルについて述べる.E10.5 マウス膵芽は解剖、解離、足場のない環境で養殖。浮遊細胞これらは自己開発の pancreatoid と堅牢な内分泌ベータ細胞、腺房と管細胞と一緒に開発数を包み込む間充織と組み合わせてください。このシステムは、器官形成中、や薬物、小さい分子、または遺伝学的スクリーニングの細胞運命決定、構造、形態形成、細胞間の相互作用を研究するために使用できます。
Introduction
正常な発達の生理機構の輪郭を描くは、疾患の病因を理解し、最終的に治療法を育成に重要です。養殖と幹細胞の差別化により、開発を迅速かつ高スループット分析、細胞の運命を制御するメカニズムに関する知識の既存のボディによって制限されます、人工的に開発を繰り返す、比較的均質な二次元の状態1,2。だけでなく、ニッチおよび環境の異なる細胞型と外因性の影響によって影響を受ける生体の開発は器官形成を導くためパラクリン シグナルと組織的支援を提供して、これらの細胞の機能にも依存、ガイダンス3,4、5の周辺。これらの外部の手がかりの重要性、差別化プロトコルの制限およびマウス モデル生体内での骨の折れる性質を考えると、新しいシステムが実験的基本的な発達過程および生理学を調査するため必要です。
3次元、複雑なオルガノイドを生成するプロトコルの出現も病態. 、薬効、生理器官形成研究に便利と合同システムを提供します。6腸胃7などさまざまなシステムが器官形成の私達の理解を拡大しているためマウス オルガノイドの確立、体内よりも少ない制限で発達の複雑性を研究するためのツールを提供します。生体外モデル。形成とひと多能性の出現により幹細胞、ひと腸8、網膜9, 腎10,11, マウス organoid のこれらの進歩のためと脳12オルガノイドを生産されているとこレパートリーは、開発のメカニズムに関する既存の知識によってのみ制限されます。
特定の関心は膵オルガノイドの世代として病気の無数の膵外分泌不全13、膵炎14、腺房細胞の腺房細胞、ダクトを含む種類の異なる膵細胞を悩ませていると糖尿病15のベータ細胞。これらの異なる細胞型の開発に関する知識を得る彼らの病理を理解することに役立つ可能性が、パーソナライズされた薬剤のスクリーニングまたは移植のためのプラットフォームとして使用できます、また。Greggioらが生体の形態形成を要約し、すべての主要な膵上皮細胞から成る組織、立体的で複雑な構造を開発するマウスの膵オルガノイドを作成する手法を開発する以前は、16,17 を種類します。これは膵の分野で主要な前進、体外特にとして作る細胞はベータ細胞の生物学的調査を有効にできます。ただし、内分泌細胞の不足は、ニッチが対話できるし、指導手掛かり17を提供する組織に、オルガノイドを移植しない限り、このプロトコルで結成。間充織が大きく内分泌はく離と分化3,4を含む後の段階に器官形成の初期段階から開発の上皮を包み込む、ニッチの最も大きい部分を構成します。 18。発展途上膵臓と間充織相互作用はまだ器官形成を研究する外因性シグナリングと体内細胞複雑さを維持することの重要性の別の例です。
ここでは、解離の e10.5 マウス膵前駆細胞からの pancreatoids と呼ばれる三次元の膵オルガノイドを生成する方法について述べる。これらの pancreatoids ネイティブ間充織を保持、自己をフローティング状態で組み立てるし、堅牢な内分泌のベータ細胞19数など、主要な膵細胞型をすべて生成します。この方法は、以前のプロトコルは、堅牢な内分泌分化を欠いているように内分泌の開発の分析に最適です。ただし、膵オルガノイドのプロトコルを使用して Greggioらは膵上皮分岐の形態形成解析に適してのとおり分岐と限定 pancreatoids。
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Protocol
このメソッドに記載されているすべての動物実験は、機関動物ケアおよび使用委員会のベイラー医科大学によって承認されました。
1. マウス胚日 10.5 膵前駆細胞の調製
注: このプロトコル必要はありません手順 2 まで無菌条件の下で続くことにしかし、それは解剖ツールを殺菌し、使用する前に 70% エタノールをスプレーするが最適。
- 郭清をセットアップする、氷のバケツを埋めるし、氷のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) のコンテナーを配置します。2 つの細い鉗子と解剖はさみの 70% エタノールで拭きます郭清範囲付近に設定、少なくとも 3 つホウケイ酸毛管容器チューブ口ピペット、ライターと 1,000 μ L ピペット チップをフィルタ リングします。
- 滅菌水と氷の上 12 ウェル プレートの 2 番目の井戸の場所で希釈 1.25 mg/mL 冷たい当期の少なくとも 1 mL を準備します。最初、3 番目、および 4 番目の PBS を入れて 12 の井戸はウェル プレートします。氷の上チューブ 1.5 mL のトリプシンの 0.05% の場所 1 mL。あらかじめ 37 oc 以上に揺れインキュベーターを温める
- E10.5 IACUC ガイドラインに従ってタイミング妊娠マウスを安楽死させます。腹部をハサミ、鉗子を使ってマウスの性器で V 字切開を行う前に、地域をきれいにし横隔膜まで継続 70% エタノールをスプレーします。
注: このプロトコルで膣にプラグの外観は、0.5 日を示します。2 g 以上の体重増加は 5 - 6 週齢のマウスを使用して成功した含浸の二次的な対策として機能します。- 慎重に反対側に繰り返す前に陰部にこの切開し、上方マウスからの臓器を引っ張って、子宮の最上部の横部分で切開することで子宮を切除します。10 cm 冷 PBS でシャーレに入れること。
注: それはしかし e10.5 の pancreatoids とは異なりこれらオルガノイド特徴付けされていませんし、従ってすべての 3 主要な膵臓系譜への分化誘導能力が保持されない分離した e11.5 細胞からオルガノイドを得ることが可能です。
- 慎重に反対側に繰り返す前に陰部にこの切開し、上方マウスからの臓器を引っ張って、子宮の最上部の横部分で切開することで子宮を切除します。10 cm 冷 PBS でシャーレに入れること。
- 光解剖顕微鏡の下でペトリ皿を配置し、慎重にそれぞれの胚の間 2 つの鉗子を配置し、卵黄嚢から組織を剥離子宮の組織を開きます。把持鉗子と 10 cm シャーレ、新鮮な場所で軽く卵黄嚢胚を転送冷 PBS。氷の上にペトリ皿を配置します。
注: 胚、強制的な削除は、臍帯、胎児の組織をリッピングと構造の整合性を損なうことを引っ張ることができる卵黄嚢内で維持できれば heedfully を削除することが重要です。 - 10 cm シャーレの蓋に複数 PBS 滴を配置します。これらの液滴を使用すると、初期胚胚体外組織が視認性を確保するために削除されると、解剖時に胚を転送します。PBS ドロップに胚を転送、鉗子を使用して残りの胚のまま氷上 (図 1A) PBS で卵黄嚢からそっと取り外します。胚を軽くティッシュ (図 1B) を損傷しないように、胚をスクープする鉗子を使用して新しい PBS ドロップに移動する前に頭を削除します。
注: 組織は、液体の不透明度に応じてここでは、説明よりも新鮮な PBS の液滴により頻繁に転送する必要があります。- 新しい PBS ドロップ鉗子 (図 1B) を使用して前肢芽を削除します。肢芽があった開口部に鉗子を配置し、ゆっくり前方のみほとんどの外部組織を引き裂く (図 1B)。胚を回転させ、肢芽で停止、後部方向に繰り返します。この時点で、消化管は目に見える (図 1B) をする必要があります。
- 消化管の後部の地域は、わずかな曲がり (図 1 f) を持っています。消化管と体壁の脊髄領域の冒頭でこの曲の背後に鉗子を挿入します。消化管、心臓領域が (図 1B E) を接続する最も前方の領域に到達するまでゆっくりと上向きに働くをデタッチします。
(省略可能) は、原始の心と肝芽を削除連続腸内管だけを残して、消化管の腹側の地域から。このプロトコルが実行される最初の数回それは心臓と肝臓消化管および背側膵原基の形態まで腹側ランドマークが多いまましやすくなる可能性があります (図 1CとDはおなじみ). - 消化管を新鮮な PBS の液滴に転送します。
- 鉗子を取るし、突出の芽と腸の下にティッシュを軽くピンチ (図 1D F) を外側の組織を少し持ち上げます。
注: 背側膵原基は胃と腸 (図 1C G) の間に位置します。下膵芽ラウンド、節くれだった構造 (図 1G) ようになります。 - 芽が腸と上向きの芽 (図 1G) を緩めにピンチに接続する鉗子を配置します。新しい PBS バブルで氷冷 PBS で 12 ウェル プレートの最初のウェルに芽を転送する前に 1 つの時間を洗浄します。すべて芽胚から収集され、12 ウェル プレートの最初の井戸の配置までを繰り返します。
- 光解離顕微鏡 12 よく皿を配置します。正常に後分割比率を計算するために解剖膵芽の数をカウントします。
- 場所フィルター 1,000 μ L ピペット チップ キャピラリー チューブと口のピペットに添付。炎はキャピラリー チューブを滅菌して使いやすさのためチューブにベンドを作成します。キャピラリーを使用すると、2 分の 2 番目も含んでいる冷たい当期ソリューションにきれいな PBS (図 1G) で 3 番目の井戸の中に転送する前に芽を転送します。
注: 当期から芽を PBS に転送する中に、は、キャピラリー チューブの先端にティッシュを触れないでください。組織は、チューブの先端をはまり、ピペットの上下またはゆるむまでクリーンソリューション PBS で横に振る。 - 芽の上下、ピペットし、きれいな PBS の 4 番目の井戸に転送。最後に、0.05% と 1.5 mL チューブに芽キャピラリー デバイス転送を使用してトリプシン。予め温めておいた 37 oC シェーカーにチューブを置き、4 分間 1,500 rpm で振る。
- 約 10 の渦 s すぐを置く遠心分離機で 200 で 5 分間スピン チューブ g. 削除遠心細胞 (図 1G) を邪魔しないよう慎重にソリューションのすべてが約 50 μ L。
- 場所フィルター 1,000 μ L ピペット チップ キャピラリー チューブと口のピペットに添付。炎はキャピラリー チューブを滅菌して使いやすさのためチューブにベンドを作成します。キャピラリーを使用すると、2 分の 2 番目も含んでいる冷たい当期ソリューションにきれいな PBS (図 1G) で 3 番目の井戸の中に転送する前に芽を転送します。
2. Pancreatoids を形成する解離前駆細胞の培養
注: 次は滅菌滅菌の標準の手順を使用して、標準のティッシュ文化フードの雰囲気の中で実行する必要があります。
- すべての芽を収集、遠心のセルを 400 μ L 器官形成メディア16,17 (表 1) を追加します。パルス渦 3 回とプレート 100 μ L/ウェルの低接着 96 ウェル プレート、1:4 の比率 (図 1G) で芽を分割します。
- 視覚化する解離細胞 (図 1H) を自由に浮遊、顕微鏡下でチェックしてください。中速でロッカーに 5% CO2と 37 oC のインキュベーターで培養皿を配置します。
- Pancreatoids の進行状況を毎日監視します。新鮮なメディアすべての 3 日間、慎重にピペッティング井戸の pancreatoid を残しながら削除するフード、顕微鏡の制御の下の 100 μ L に置き換えます。また、メディアの新鮮な 100 μ L に追加できます新しいもと pancreatoid を使用して転送ホウケイ酸のキャピラリー チューブ口のピペットに添付されている 1000 μ L ピペット チップをフィルタ リングします。
3. 蛍光イメージングのための Pancreatoids の処理
- 蛍光画像の pancreatoids を処理するには、最初 4% パラホルムアルデヒド/PBS、pH7.4 (PFA) ソリューションを準備します。4 %pfa は 96 の井戸のウェル プレートの 50 μ L を配置します。
- 4% 新鮮な井戸の中に可能な限りとしてほとんどのメディアを取って培地から pancreatoids を転送ホウケイ酸キャピラリー チューブと口ピペットを用いた 1,000 μ L フィルター ピペット チップ、PFA。15 分間室温でロッカーに設定します。
- 4% から pancreatoids を転送の新鮮な PBS 100 μ L をウェルに PFA が新鮮な PBS 洗浄 3 の合計 5 ~ 10 分繰り返し室温でロックします。
注: プロトコルは、pancreatoids の 1 週間 4 oC で 100 μ L の PBS に格納されているとここでは、休止できます。
- Wholemount イメージング (抗体は、セクション 3.3 で適切な代替アプローチが推奨します。 3.4 顕微鏡。)、PBS から 0.1% 非イオン性洗剤 (pbst;) 1x PBS で 50 μ l の 5% ロバ血清にブロック転送。4 oC で一晩岩または室温で 4 時間。
- Pancreatoids を 1 に 5% ロバ血清の 50 μ L で希釈した一次抗体を含む新しい井戸に転送 x PBST。(36 h ですが少なくとも 12 h) 4 oC で 24 時間、最適なロック。
注: Chga (1: 100)、DBA (1: 400)、Vim (1: 400) および Pdx1 に対する材料の表に記載されて抗体 (1: 100); 染め色に適していますその他の抗体は、最適化を必要があります。 - よく洗浄し、室温で 30 分間ロック新鮮な PBST の 100 μ L を含む pancreatoids に転送します。3 新鮮な pbst; 洗浄の合計のためには、この手順を繰り返します。
- Pancreatoids を 1 に 5% ロバ血清の 50 μ L で希釈した二次抗体を含む新しい井戸に転送 x PBST。光から保護して、プレート、4 oC、24 h (36 h ですが少なくとも 12 h) 最適のロッキングの場所します。
注:テーブルの材料および DAPI 核の対比染色に記載されているすべての二次抗体は染め色に適しています。 - PBST と常温 1 で 3 つの洗浄の合計の 30 分の繰り返しのロック × 1 の 100 μ L を含む新しい井戸に pancreatoids を転送 x PBST。3 番目と最後の洗浄に追加 300 nM DAPI。
- 最後に、100 μ L の PBS 清潔 4 o染色直後後イメージングから来る最高の結果が、共焦点顕微鏡によるイメージングの前に週までの光から保護 C でストアに配置します。イメージ投射の間 pancreatoids の動きを防ぐが、完全に乾くことを防ぐため、PBS の 20 μ L 液滴に各 pancreatoid を配置します。Pancreatoids がまだ残っていない場合、は、PBS の量を減らします。
- Pancreatoids を 1 に 5% ロバ血清の 50 μ L で希釈した一次抗体を含む新しい井戸に転送 x PBST。(36 h ですが少なくとも 12 h) 4 oC で 24 時間、最適なロック。
- 凍結切片の PBS から一晩で 4 oc. 30% ショ糖液の pancreatoids を転送する.
- 解剖顕微鏡の下にバブルの埋め込みメディアを追加します。顕微鏡制御の下で鉗子を使用して、優しく押すことによって埋め込みメディアを通じて何回か残留ショ糖を埋め込みメディアを凍結組織ブロックを転送する前に削除する pancreatoids を浸します。
- 8 μ m でクライオスタットにドライアイス凍結までに組織ブロック、セクションを配置します。
注: セクション格納できます-80 oC または immunostained ですぐに。 - -80 oC 乾燥するまで約 5 分間室温で解凍してからのセクションを許可します。組織周辺ブロック 1 で希釈した 5% ロバ血清を用いた疎水性 pap ペンを使用して疎水性の障壁を描画室温で 30 分間 x PBST。
- メディアを取り出し、1 x pbst; 4 oc. で一晩で希釈 5% ロバ血清で希釈した一次抗体をすぐに交換
- 主なソリューションを削除し、3 回 1 組織を洗って 10 分の x PBST。5% ロバ血清 1 の希釈で希釈した二次抗体溶液を追加後、室温で 1 時間 x PBST とスライドを光から保護します。
- セカンダリのソリューションを削除し、1 でスライドを 3 回洗浄 10 分の x PBST。最終的な洗浄に追加 300 nM DAPI。
- メディアを削除し、メディアをマウント、coverslip を追加します。ストアは、イメージする準備ができるまで 4 oC の光からスライドします。
4. 転写解析のための Pancreatoids からの RNA の隔離
- Pancreatoids 酸ためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム溶液 1.5 mL チューブの 500 μ L に不稔と場所のフィルター 1,000 μ L ピペット チップと口のピペットに添付ホウケイ酸のキャピラリーを使用してを収集します。-80 oC で保存または RNA の隔離に進んでください。
- RNA の隔離の必要に応じて、氷のサンプルを解凍し、100 μ L のクロロホルムを追加します。4 oc 以上に遠心分離機があらかじめ冷たい渦もと 4 oC で 15 分間の場所
- 遠心分離機・ スピン 4 oc 以上で 12,000 g で 20 分間のチューブを置き
- 層の分離を邪魔しないようにチューブを慎重に取り外します。200 μ L ピペットを使用して、透明な水溶液を収集し、白質層とピンクの DNA 層からバッファーに少量を残して新しい 1.5 mL チューブに配置。このプロセスで何かをピペットの先端に触れないで、1.5 mL チューブの壁に触れないでください。
- 水層と渦を含む新しい管への 100% イソプロピル アルコール液 500 μ L を追加します。20 分、氷の上に長い間または一晩で-20 oC. 最大降水量まま室温で放置します。
- 4 oC RNA をペレットにで 15 分間 12,000 g で遠心分離機します。ペレットを乱すことがなく、イソプロパノールを削除します。
注: pancreatoids は小さな、ペレットは表示できない可能性が高いです。 - 風邪、75% エタノールを追加し、数回チューブを反転します。遠心分離機で配置し、エタノールと 9,000 の x g で 2 分間スピン 4 oc. 削除で 10 分の 9,000 の x g でスピンします。
- 200 μ L ピペットを使用して、ペレットが存在する地域に連絡せずチューブに任意の残りのエタノールを削除します。残留エタノールの蒸発を確保するため室温で 5-10 分間チューブのキャップを開いたまま。
- きれいな、ヌクレアーゼ フリー水の 20 μ L のボルテックスでペレットを再懸濁します。
オプション: 熱 RNA 65 oC 3 分のため、すぐには、氷に戻る。RNA は-80 oC で保存または逆のトランスクリプションと qPCR のすぐに使用できます。
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Representative Results
子宮角から e10.5 のマウス胚を細かくは、さらに郭清 (図 1A) の PBS で無傷の胚を得られるはず。消化管は、胚 (図 1B)、腸および胃 (図 1C F) の接続点で背側膵原基の洞察力を許可するから効率的に削除できます。E10.5 膵芽以前特徴付けされています。前駆細胞はPdx1、Sox9、Ptf1a、およびHes120,21,22,23を表現しなければなりません。組織の処理手順に従って、解離の膵臓の単一のセルまたはセルの小さいグループが光顕 (図 1G H) で視覚化できます。
器官形成メディアでこれらの自由浮遊、スキャフォールド フリー セル自己組み立てるし、成長し、文化 (図 2A) で、少なくとも 10 日間を保持する三次元の pancreatoids にまとめます。Pancreatoids は、発生する分岐の形態形成と生体の膵臓に形態学的類似点を持ってください。トランスジェニック マウスを使用して、リアルタイムで異なる種類の細胞またはプロセスを監視できます。たとえば、Ins1 eGFP24匹のマウスを使用すると、内分泌のベータ細胞の形成を示す、pancreatoids 視覚化されるベータ細胞 (図 2B) を視覚化する毎日。さらに、培養条件を変更、追加する小分子、薬、またはゲノムの操作、によって細胞の運命の決定を評価することができますだけでなく構造と形態の変化を調査することができますも。高濃度の蛋白質キナーゼ C 活性化ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) のアプリケーションを紹介 (160 nM)、上皮細胞を関連付けられている緩やかにつながる pancreatoids の開発の形態を変え、分岐を増加19 (図 2C)。
膵上皮細胞と膵間充織組織の関連を評価するためには、各組織のマーカーの免疫染色が行えます。DBA25,26, 内分泌マーカー、Chga27, 核を DAPI でマークとダクト マーカーの免疫染色では、pancreatoids (図 3A) における複数の系統を明らかにします。間充織マーカー、ビメンチン、共同膵前駆細胞マーカー染色 (から約 e15.5 に e9.0) Pdx1 は間充織が pancreatoid (図 3B) を包み込むことを示しています。形態の種類のセルの異なるマーカーと同様、Pdx1 明らかの分岐構造を調べる免疫染色を使用もできます。図 3Cに上皮性マーカー Pdx1 と保険使用 qPCR 解析、転写産物の前駆細胞の β 細胞マーカーの染色と細胞を区別する β 細胞の開発を視覚化、祖先遺伝子など、評価されます。Pdx1とHes1と分化のマーカー、 Prss1、Prss3、Hnf6、Isl1, Nkx6-1,およびIns1 (図 4).
図 1:解離、解離、pancreatoid 世代の e10.5 膵前駆細胞のめっきの概要。(A) e10.5 胚の明視野イメージ。(B)術、左の上の開始の模式図。赤破線は、緑の地域は消化管をカットする領域を示しています。まず、頭は前肢芽の除去、有機物の側の開口部の順に削除されます。(C)消化管は慎重に削除されます、管の腹側の領域から突き出ている心臓や肝臓の芽。胃, 背側膵原基と腸は可視化できる明視野イメージに示すように。(D)心と肝芽の除去。回路図は左側と明視野イメージは右側。郭清の芽を公開する背側膵原基周囲組織の(E) Pinching。回路図は左側と明視野イメージは右側。(F)消化管明視野顕微鏡下背側膵原基に。左の画像、腸の曲がりが見える、脊髄領域からの消化管を取り外す際鉗子を配置することができます。右側に、高倍率の明視野イメージは背側と腹側膵芽を示しています。背側膵原基、解離、器官形成メディアの再懸濁の前に、のティッシュの処理とめっきの(G)の除去。(H)明視野イメージは、メッキ後直ちに解離細胞を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 時間をかけて pancreatoids を監視します。(A) 1 日目、2 日目と 3 日目で pancreatoids の明視野画像。スケール バー = 100 ええと。(B)培養条件の膵臓の形態を調査するための操作。ここでは、PMA の高レベルの追加は、1 と 2 の日に明視野顕微鏡による可視化ゆるみ上皮構造と増加分岐に します。スケール バーで 4 日目、5 日目、6 日目、7 日目、緑内で示される β 細胞の開発と日 9、 (C) Ins1 eGFP マウス pancreatoids 100 μ m を =。スケール バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: Pancreatoids の免疫染色。(A)免疫染色 pancreatoid 緑と核を DAPI で青色でマーク Chga による赤、内分泌細胞の DBA がダクトをマークする 5 日目で。緑の Pdx1 によって赤と膵前駆細胞のビメンチンが間充織をマークする 7 日(B)免疫染色 pancreatoid。(B)免疫染色 pancreatoid に緑の Pdx1 によって赤と膵前駆細胞でインスリンによってベータ細胞の 7 日目で。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: トラン スクリプト解析します。7 日目 pancreatoids 前駆細胞と分化細胞のマーカーのための定量 PCR。Scavuzzoらに生体内でマウス組織との比較(2017). 結果は、 Gapdhに正規化されます。N = 2、縮尺記号、SEM.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| コンポーネント | 省略形 | 最終濃度 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | P/S | 1% |
| 政府短期証券の無料メディアを補完します。 | 10% | |
| Β-メルカプトエタノール | bME | 0.1 mM |
| ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート | PMA | 16 nM |
| Y-27632 や岩の阻害剤 | RI | 10 uM |
| 表皮の成長因子 | EGF | 25 ng/mL |
| R Spondin1 | - | 500 ng/mL |
| 酸性線維芽細胞成長因子、線維芽細胞成長因子 1 | aFGF、FGF1 | 25 μ G/ml |
| ヘパリン ナトリウム塩 | ヘパリン | 2 U/mL |
| 線維芽細胞成長因子 10 | FGF10 | 100 ng/mL |
| ダルベッコ修飾イーグル培地/栄養混合物 F-12 | DMEM/F12 | 5 mL に |
表 1。器官形成メディア。
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Discussion
細胞培養モデルの進行は、適切にモデル開発、臨床的に関連する細胞の種類、試験薬の有効性、または患者にも移植を生成に不可欠です。ただし、我々 は器官形成と生理のメカニズムの理解には程遠い、挑戦は皿に開発を人工的にさた体内。こうして体外細胞が効率的に生成された、完全に機能しない、時間の長い期間のために維持されるまたは匹敵する細胞を体内からその他の異常を港にできません。多くの異なったセルタイプ対話開発および生理学に影響を与える複雑な形態形成の変化が発生するためです。体外の利便性を組み合わせることで開発の続行方法の理解を得る体内の開発の複雑さを維持しながらシステム生物医学の研究のための貴重なツールを与えます。
オルガノイドの開発は有望な道の開発の複雑さをモデル化です。このプロトコルのネイティブ間充織を保持し、pancreatoids はグルコース応答を示さないにもかかわらず確実内分泌細胞を生成する pancreatoids と呼ばれる、膵臓オルガノイドの作り方の概要を説明します。このツールは、生体内で見られる組織の不均一性を保持している文化システムの開発だけでなく、機能のメカニズムを調査する使用ことができます。さらに、遺伝的画面、画面小さい分子、または薬は、この機能を使用できます。これは特に興味深い、比較的均質な細胞培養システムでテストの候補薬は他の密接に関連細胞型にこれらの化合物の影響を回避可能性があります。
このプロトコルの中にいくつかの重要な手順があります。まず、子宮から胎児を慎重に除去は重要である腹部をリッピングすることができます強制的に胚を抜くと膵芽 (手順 1.3) を取得する消化管を見分けることが難しくなっています。消化管からの膵臓の芽の 2 番目、きれいな郭清は、他の細胞型 (ステップ 1.4.4) の分化につながる可能性があります余分な組織として重要です。これを行うには、膵臓の芽を分離する前にオーバーレイする組織を持ち上げて下膵芽ピンチすることが重要です。最後に、洗浄する PBS に戻って、当期から芽を移動する場合、ホウケイ酸のキャピラリー チューブを使用して管の開口部のエッジに触れるティッシュをさせないことが不可欠だ、組織 (ステップ 1.5.1) チューブの先端に固執する場合は。これを避けるために、可能に外ではなくチューブに行く芽芽に向かって移動する前に口のピペッティングの解決を開始します。
このメソッドにより、3 D pancreatoid における内分泌細胞の形成、上皮の分岐は、他の既存プロトコル16,17よりも制限します。さらに、インスリン産生の内分泌細胞フォームは中、に、彼らは、グルコース応答を示さない。したがって、さらにこれらの細胞の成熟の捜査情報を提供貴重なベータ細胞の生成の分野だけでなく、機能的な pancreatoids の世代の両方一般に。
内分泌細胞を開発する pancreatoids の生成と、グルコース応答を取得、糖尿病の治療のための潜在的な影響は、将来的に。糖尿病は、膵 β 細胞が失われた、または機能不全、これらの細胞を置き換える可能性のある病気の合併症を軽減することが、再生療法の主な候補者です。糖尿病患者の β 細胞、しかしに hPSCs を区別することに進歩を遂げて、アルファ細胞や腺房細胞28,29,などの β 細胞と膵臓の他の細胞型に機能不全がしばしばあります30,,3132。したがって、移植の新しい膵組織の生成は完全に被災組織を置き換えることができます。マウス pancreatoid の形成と機能の追加調査、hPSCs の人間の pancreatoids を生成する発達の軌跡をまねることができます。これらの人間の pancreatoids は、画面再生療法、患者固有のコンテキストにおける薬物反応性のために個人化された薬のため使用できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
プロトコルおよび原稿に関する有用な議論ありがとう省 Jolanta Chmielowiec。また、ベンジャミン ・ Arenkiel は共焦点顕微鏡へのアクセスに感謝我々。この作品は NIH (P30 - M.B. への DK079638) と T32HL092332-13 M.A.S. と M.B. と (M.B.) にマクネア医療財団、BCM 知的、発達障害研究センターの共焦点のコアによって支えられた (ユニスから NIH U54 HD083092ケネディ ・ シュライバー国立研究所母子保健と人間開発)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
References
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