Summary
여기, 선물이 해리 했다 부동성 e10.5 췌 장 창시자와 관련된 mesenchyme 3D murine pancreatoids을 표현 하는 인슐린을 생성 하는 프로토콜.
Abstract
췌 장 혈액 포도 당 항상성 및 소화를 함께 작동 하는 많은 다른 세포 유형의 구성 하는 복잡 한 기관 이다. 이 셀 형식 효소를 은닉 포상 세포는 arborized ductal 시스템 본질적인, 그리고 호르몬 생산 하는 내 분 비 세포에 효소의 수송에 대 한 책임을 포함합니다.
내 분 비 하는 베타 세포는 낮은 혈액 포도 당 수준에 인슐린을 생성 하는 본문에 유일한 셀 유형입니다. 당뇨병, 손실 또는 베타 세포의 기능 장애를 특징으로하는 질병 전염병 비율에 도달입니다. 따라서, 파생 약물 및 세포 기반 치료제 심사 목적으로 사용할 수 있는 베타 세포 개발 조사를 프로토콜을 확립 필수적 이다. 마우스 개발의 실험 조사는 필수, vivo에서 학문은 힘들고 시간이 많이 소요. 배양된 세포 검사;에 대 한 더 편리한 플랫폼을 제공 그러나, 그들은 세포 다양성, 건축, 조직과 세포 상호 작용 발견 유지할 수 없습니다 vivo에서. 따라서, 췌 장 organogenesis 및 생리학 조사 하는 새로운 도구를 개발 하는 것이 필수적입니다.
세포 구성 하 고 복잡 한, 순수 유능한 성인 기관으로 분화 췌 장 상피 세포는 organogenesis의 발병에서 mesenchyme와 가까운 협회에서 개발. 췌 장 mesenchyme 내 분 비 개발에 대 한 많은 이해 되지 않는다 잘 아직, 따라서 생체 외에서 문화 동안 정리 하기 어려운 중요 한 신호를 제공 합니다. 여기, 우리 유지 mesenchyme, pancreatoids 라고 하는 문화 3 차원, 셀룰러 복잡 한 마우스 organoids에 프로토콜을 설명 합니다. E10.5 murine 췌 장 새싹은 해 부, 해리, 및 비 계 없는 환경에서 경작. 이러한 셀을 떠 자기 mesenchyme 개발 pancreatoid 및 내 분 비 베타 세포에는 포상 및 덕트 세포 개발의 강력한 수 포와 함께 조립. 이 시스템은 organogenesis, 또는 약물 이나 작은 분자, 유전자 검사에 대 한 세포 운명 결정, 구조, 조직과 morphogenesis, 세포-세포 상호 작용을 공부 하 사용할 수 있습니다.
Introduction
정상적인 개발 및 생리의 메커니즘을 묘사 하는 것은 질병 병 인을 이해 하 고 궁극적으로 치료 방법을 육성에 답해야 합니다. 배양 및 분화 줄기 세포 개발의 신속 하 고 높은 처리량 분석을 수 있습니다, 그것은 기존의 신체의 세포 운명 조절 메커니즘에 관한 지식에 의해 제한 됩니다 고 인위적으로 개발에이 상대적으로 균질 성, 2 차원 상태1,2. 뿐만 아니라 vivo에서 개발 틈새와 환경에서 서로 다른 세포 유형으로 외부 영향에 의해 영향을 받는 paracrine 신호 및 조직 지원 organogenesis, 가이드를 제공 하는 있지만 이러한 세포의 기능에 의존 하 고 또한 그들의 주변 지도3,,45. 이러한 외부 단서의 중요성, vivo에서 마우스 모델의 힘 드는 자연과 분화 프로토콜의 한계를 감안할 때, 새로운 시스템 기본 개발 프로세스 및 생리학을 실험적으로 조사 필요 합니다.
Organogenesis, 생리학, 약물 효능 및 심지어 pathogenesis. 을 편리 하 고 적합 한 시스템을 제공 하는 3 차원, 복잡 한 organoids를 생성 하는 프로토콜의 출현 대 위6 과 대 장7 다른 시스템 organogenesis에 대 한 우리의 이해를 확장 했다 murine organoids를 설립, 연구 개발 복잡성 vivo에서 보다 적게 제한 하는 도구를 제공 하 그리고 생체 외에서 모델입니다. Murine organoid이 진보 때문 형성과 인간 만능의 출현 줄기 세포, 인간의 장8, 망막9, 신장10,11, 그리고 대뇌12 organoids 생산 되어,이 레 퍼 토리만 개발 메커니즘에 관한 기존의 지식에 의해 제한 됩니다.
질병의 무수 한 재앙 다른 췌 장 세포 유형, 외 분 비 췌 장 불충분13,14, 췌 장 염 포상 세포에에서 포상 세포와 덕트를 포함 한 췌 장 organoids의 생성은 특별 한 관심의 고 15당뇨병 베타 세포입니다. 이러한 서로 다른 세포 유형의 개발에 관한 지식을 얻고 고 또한, 맞춤된 약물 검사 또는 이식에 대 한 플랫폼 역할을 할 수, 있습니다. 그들의 병 리를 이해에 도움이 수 있습니다. 이전, Greggio 외. 만들 murine 췌 장 organoids morphogenesis vivo에서 정리 하 고 모든 주요 췌 장 상피 세포의 구성 하는 조직, 3 차원, 복잡 한 구조를 개발 하는 방법 개발 유형16,17. 이것은 췌 장 분야에서 앞으로 중요 한 단계 이다, 특히 만드는 세포에 생체 외에서 베타 세포 개발의 생물 학적 조사를 설정할 수 있습니다. 그러나, 내 분 비 세포의 부족은 organoids 조직, 틈새 상호 작용 수 및 교육용 신호17제공으로 이식 했다 하지 않는 한이 프로토콜에서 형성 했다. 틈새 시장, 무 겁 게 내 분 비 박 등 차별화3,4, 후기에 organogenesis의 초기 단계에서 개발 상피를 뒤 덮 었의 가장 큰 부분을 구성 하는 mesenchyme 18. 개발 췌는 mesenchyme의 상호작용은 아직 외부 신호 및 생체 내에서 세포 복잡성을 유지의 중요성 organogenesis 연구의 또 다른 예.
여기, 우리는 3 차원 췌 장 organoids, pancreatoids, 해리 e10.5 murine 췌 장 창시자에서 불리를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 pancreatoids 네이티브 mesenchyme 유지, 부동성 조건에서 자기 조립 및 내 분 비 하는 베타 세포19의 강력한 수를 포함 한 모든 주요 췌 장 세포 종류를 생성. 이 방법은 이전 프로토콜 강력한 내 분 비 차별화 부족으로 내 분 비 발달의 분석을 위해 가장 적합 하다. 그러나, 췌 장 organoids에 대 한 프로토콜을 사용 하 여 Greggio 외. 췌 장의 상피 분기 및 morphogenesis의 분석에 대 한 더 적합에 의해 설명 된 대로 분기로 더 제한 됩니다 pancreatoids.
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Protocol
이 방법에 설명 된 모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 베일 러 대학의 약에 의해 승인 되었다.
1. 마우스 배아 일 10.5 췌 장 창시자의 준비
그러나 참고:이 프로토콜 않습니다 필요가 없습니다 2 단계까지 무 균 조건 하에서 지켜질 해 부 도구를 소독 하 고 사용 하기 전에 70% 에탄올 스프레이에 최적입니다.
- 해 부에 대 한 설정, 얼음 양동이 얼음에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 컨테이너를 놓습니다. 두 개의 뾰족한 집게 및 해 부가 위 70% 에탄올으로 청소. 컨테이너를 3 개 이상 붕 모 세관 튜브, 입 피 펫, 라이터와 1000 µ L 피 펫 팁을 필터링 해 부 지역 근처 설정.
- 1.25 mg/mL 찬 dispase에 얼음에 12 잘 플레이트의 두 번째 잘 소독된 물에 희석의 적어도 1 mL를 준비 합니다. 첫 번째, 세 번째 및 네 번째에서 PBS를 넣어 12의 우물 잘 접시. 0.05%의 장소 1 mL Trypsin 1.5 ml에서 튜브 얼음에. 미리 따뜻하게 37 oc.에 떨고 인큐베이터
- E10.5 타임-임신 쥐 IACUC 지침에 따라 안락사 복 부 지역 V 자형 절 개를 성 기 영역에서의 위와 집게를 사용 하 여 마우스를 하기 전에 청소 하 고 횡 경 막까지 계속 70% 에탄올 스프레이.
참고:이 프로토콜에 질 플러그의 모양을 하루 0.5를 나타냅니다. 5-6 주 오래 된 마우스를 사용 하 여 이상의 2 g의 체중 증가 성공적인 임신의 보조 수단으로 역할을 합니다.- 조심 스럽게 반대편에 반복 하기 전에 생식 기 지역으로 위쪽으로 마우스, 그리고이 절에 따라 장기를 당겨 자 궁의 맨 측면 부분에 절 개를 함으로써 자 궁을 삭제할. 10 cm 차가운 PBS와 페 트리 접시에에서 놓습니다.
그러나 참고: 그것은 e10.5 pancreatoids와 달리이 organoids 특징 되지 않습니다 및 따라서 모든 세 가지 주요 췌 장 혈통으로 분화 하는 능력을 유지 하지 않을 수 있습니다 e11.5 해리 셀에서 organoids를 얻을 수 있습니다.
- 조심 스럽게 반대편에 반복 하기 전에 생식 기 지역으로 위쪽으로 마우스, 그리고이 절에 따라 장기를 당겨 자 궁의 맨 측면 부분에 절 개를 함으로써 자 궁을 삭제할. 10 cm 차가운 PBS와 페 트리 접시에에서 놓습니다.
- 가벼운 해 부 현미경 페 트리 접시를 놓고 하 고 신중 하 게 각 태아 사이 두 집게 배치 하 노른자위 낭에서 조직을 박 리 하 여 자 궁 조직을 엽니다. 집게와 10cm 신선한, 페 트리 접시에서 부드럽게 노른자위 sac를 파악 하 여 배아를 전송 차가운 PBS. 얼음에 페 트리 접시를 놓습니다.
참고: 그것은 heedfully 강력한 제거 탯, 태아의 조직 고 구조적 무결성을 손상 시 키 지를 뽑을 수 선호 노른자위 낭 내에서 유지 하는 배아를 제거 하는 것이 중요. - 10 cm 배양 접시 뚜껑에 여러 PBS 방울을 배치 합니다. 이 방울을 사용 하 여 extraembryonic 조직 가시성을 보장 하기 위해 제거는 해 부 동안 배아를 전송. PBS 드롭 배아를 전송 하 고 나머지 배아 얼음 (그림 1A)에 PBS에 체류 하는 동안 집게를 사용 하 여 노 른 자 골목에서 부드럽게 제거 합니다. 가볍게 푸 하지 손상 조직 (그림 1B), 태아를 집게를 사용 하 여 새로운 PBS 드롭 배아를 이동 하기 전에 머리를 제거 합니다.
참고: 조직 액체의 불투명도 따라 여기서 설명한 것 보다 신선한 PBS 방울을 더 자주 전송 되도록 해야 합니다.- 새로운 PBS 드롭 forelimb 싹 집게 (그림 1B)를 사용 하 여 제거 합니다. 사지 새싹은 현재 오프닝으로 집게를 배치 하 고 부드럽게 anteriorly 가장 외부 조직만을 찢 어 (그림 1B). 배아를 회전 하 고 hindlimb 새싹에서 후부 방향으로 반복 합니다. 이 시점에서, 위장 표시 (그림 1B) 해야 합니다.
- 위장의 후부 지역의 약간의 굴곡 (그림 1 층) 있다. 위장과 체 벽의 척추 지역 사이이 벤드 뒤에 집게를 삽입 합니다. 위장, 가장 앞쪽 영역 심장 지역 (그림 1B-E)를 연결 하는 곳에 도달할 때까지 천천히 위쪽으로 작업을 분리 합니다.
선택 사항: 원시 심장과 간 싹에서에서 제거만 연속 직감 튜브를 떠나 위 장관의 복 부 지역. 이 프로토콜을 수행 하는 처음 몇 번 그것은 두고 심장과 간 위장와 등 쪽 췌 장 새싹의 형태까지 복 부 랜드마크는 더 쉬울 수도 있습니다 (그림 1C 와 D 익숙한 ). - 신선한 PBS 물방울에 위장을 전송.
- 집게를가지고 부드럽게 돌출 버드와 소장 아래 조직을 꼬 집 고 약간 들어올립니다 (그림 1D-F)을 외부 조직.
참고: 등 쪽 췌 장 새싹은 위장과 소장 (그림 1C G) 사이 있습니다. 아래 췌 장 새싹 라운드, 혹 구조 (그림 1G) 처럼 보이게 한다. - 꽃 봉 오리 핀치 위로 새싹 (그림 1G)을 완화 하 고 소장에 연결 집게에 놓습니다. 얼음에 차가운 PBS에 12 잘 플레이트의 첫 번째 우물에 꽃 봉 오리를 전송 하기 전에 새로운 PBS 거품에 한 번 씻어. 모든 새싹 및 배아에서 수집한 12 잘 플레이트의 첫 번째 우물에 배치 될 때까지 반복 합니다.
- 가벼운 해 부 현미경 아래 12 잘 접시를 놓습니다. 성공적으로 나중에 분할 비율을 계산 해 부 췌 장 새싹의 수를 계산 합니다.
- 장소는 모 세관 튜브 입 피 펫에 필터링 된 1000 µ L 피 펫 팁 첨부. 화 염 모 세관 튜브를 소독 하 고 사용의 용이성에 대 한 튜브에 벤드를 만듭니다. 모 세관을 사용 하 여 깨끗 한 PBS (그림 1G)와 세 번째 우물을 전송 하기 전에 2 분 동안 두 번째 잘 포함 하 찬 dispase 솔루션에 싹을 전송.
참고: 꽃 봉 오리를 dispase에서 PBS를 전송 하는 동안 조직 모 세관 튜브의 팁을 만지지 마십시오. 조직 관의 끝에 걸리면, 위쪽 및 아래쪽 플라스틱 또는 느슨하게 때까지 깨끗 한 PBS 솔루션에 흔들. - 꽃 봉 오리를 아래로, 플라스틱 그리고 깨끗 한 PBS 가진 4 잘 전송. 마지막으로, 0.05%는 1.5 mL 튜브에 새싹 모 세관 장치 전송 사용 하 여 트립 신. 미리 데워 진된 37 oC 셰이 커에 튜브를 놓고 4 분 1500 rpm에서 흔들어.
- 약 10 소용돌이 s 다음 즉시 튜브에 배치는 원심 분리기와 200에서 5 분 동안 스핀 g. centrifuged 세포 (그림 1G)을 방해 하지로 조심 스럽게 솔루션의 모든 하지만 약 50 µ L를 제거.
- 장소는 모 세관 튜브 입 피 펫에 필터링 된 1000 µ L 피 펫 팁 첨부. 화 염 모 세관 튜브를 소독 하 고 사용의 용이성에 대 한 튜브에 벤드를 만듭니다. 모 세관을 사용 하 여 깨끗 한 PBS (그림 1G)와 세 번째 우물을 전송 하기 전에 2 분 동안 두 번째 잘 포함 하 찬 dispase 솔루션에 싹을 전송.
2. 경작 Pancreatoids를 형성 하기 위하여 해리 창시자
참고: 다음는 표준 살 균 절차를 사용 하 여 표준 조직 문화 후드에 메 마른 분위기에서 수행 합니다.
- 수집 된 모든 새싹, centrifuged 셀 400 µ L organogenesis 미디어16,17 (표 1)를 추가 합니다. 펄스 소용돌이 세 번 하 고 플레이트 100 µ L 당 낮은 첨부 파일 96의 잘 잘 플레이트, 싹 (그림 1G) 1:4 비율로 분할.
- 시각화를 해리 셀 (그림 1H)를 자유롭게 떠 현미경 아래에서 확인 하십시오. 중간 속도에서 로커에 5% CO2 와 37 oC 인큐베이터에서 문화 접시를 놓습니다.
- 매일 pancreatoids의 진행 상황을 모니터링 합니다. 신선한 미디어 3 일 마다 미세한 제어 후드 우물에서 pancreatoid를 떠나 있는 동안 제거에 신중 하 게 pipetting 미디어의 100 µ L를 바꿉니다. 또는 신선한 100 µ L 미디어의 입 피 펫 및 1000 µ L에 연결 된 붕 규 산 세관 피 펫 팁 필터링 새로운 잘 사용 하 여 전송 하는 pancreatoid에 추가할 수 있습니다.
3. 처리 Pancreatoids Immunofluorescent 이미징
- Immunofluorescent 이미지 pancreatoids를 처리 하려면 먼저 4 %paraformaldehyde / PBS, pH7.4 (PFA) 솔루션 준비 합니다. 4%의 장소 50 µ L PFA는 96의 우물에 잘 플레이트.
- Pancreatoids 4% 신선한 잘으로 가능한 작은 미디어를 복용 하는 문화 매체에서 전송 1000 µ L 필터링 된 피 펫 팁 붕 규 산 모 세관 튜브 및 입 피 펫을 사용 하 여, PFA. 15 분 동안 실내 온도에 로커에 설정 합니다.
- 4%에서 pancreatoids 전송 3 신선한 PBS 세척의 총에 대 한 5-10 분 반복에 대 한 상 온에서 신선한 PBS의 100 µ L로 잘으로 PFA 바위.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지, 여기 4 oC에서 PBS의 100 µ L에 최대 1 주일까지 저장 하는 pancreatoids와.
- Wholemount 이미징 (경우 항 체는 섹션 3.3에에서 적합 한 대체 접근 권장. 그리고 3.4에서 현미경 검사 법.), PBS에서 블록을 0.1% 비 세제 (PBST)로 1 x PBS에서 50 µ L 5% 당나귀 혈 청으로 전송. 4 oC에서 하룻밤 바위 또는 양자 택일로 실 온에서 4 시간.
- 1 혈 청 5% 당나귀의 50 µ L에 희석 하는 주 항 체를 포함 하는 새로운 우물을 pancreatoids 전송 x PBST. 4 oC에서 24 시간 (36 h까지 하지만 적어도 12 h)에 대 한 최적의 바위.
참고: 항 체 Chga (1: 100), DBA (1:400), Vim (1:400), 및 Pdx1에 대 한 재료의 테이블에 에서 나열 된 (1: 100) wholemount 얼룩;에 적합 다른 항 체 최적화가 필요할 수 있습니다. - Pancreatoids 신선한 PBST 세척 하 고 실 온에서 30 분 동안 바위의 100 µ L를 포함 하는 잘 전송. 3 신선한 PBST 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.
- 1 혈 청 5% 당나귀의 50 µ L에 희석 2 차 항 체를 포함 하는 새로운 우물을 pancreatoids 전송 x PBST. 빛에서 접시를 보호 하 고 4 oC, 락을 최적으로 24 시간 (36 h까지 하지만 적어도 12 h)에.
참고: 테이블의 재료 와 DAPI 핵 counterstain에 나열 된 모든 이차 항 체는 wholemount 얼룩 적합 합니다. - Pancreatoids x PBST와 바위 1에 3 개의 세척의 총 30 분 반복에 대 한 실 온에서 1의 100 µ L를 포함 하는 새로운 잘 전송 x PBST. 제 3의 그리고 마지막 세척에 추가 300 nM DAPI.
- 마지막으로, 깨끗 한 PBS의 저장소 4 oC 최상의 결과 즉시 얼룩 후 영상에서 온 confocal 현미경 검사 법에 의해 이미징 하기 전에 주일에 대 한 빛에서 보호에서 100 µ L을 넣으십시오. 이미징 동안 pancreatoids의 움직임을 방지 하지만 밖으로 건조 방지, PBS의 20 µ L 방울에 각 pancreatoid를 놓습니다. Pancreatoids 아직도 남아 있지, PBS 볼륨을 줄일 수 있습니다.
- 1 혈 청 5% 당나귀의 50 µ L에 희석 하는 주 항 체를 포함 하는 새로운 우물을 pancreatoids 전송 x PBST. 4 oC에서 24 시간 (36 h까지 하지만 적어도 12 h)에 대 한 최적의 바위.
- 냉동된 섹션에 대 한 pancreatoids에서에서 전송할 PBS 30% 자당 해결책 하룻밤에 4 o3.
- 해 부 현미경 거품에서 포함 미디어를 추가 합니다. 미세한 제어 집게를 사용 하 여 부드럽게 밀어 포함 미디어를 통해 여러 번 냉동 포함 미디어 조직 블록을 전송 하기 전에 잔여 자당을 제거 하 여 pancreatoids를 담근 다.
- 8 µ m에서 cryostat에 고정 될 때까지 드라이 아이스에 조직 블록 및 섹션을 놓습니다.
참고: 섹션 저장할 수 있습니다-80 oC 또는 immunostained에 즉시. - 섹션-80 oC 건조까지 약 5 분 동안 실 온에서 해 동 하실 수 있습니다. 소수 성 장벽을 조직과 5% 당나귀 혈 청 1에서 희석을 사용 하 여 블록 주위 소수 pap 펜을 사용 하 여 그리는 실 온에서 30 분 동안 x PBST.
- 미디어를 제거 하 고 기본 항 체 5% 당나귀 혈 청 1 x PBST에서 4 o3. 하룻밤에 희석에 희석 즉시 바꿉니다
- 기본 솔루션을 제거 하 고 씻어 조직 세 번 1 10 분 x PBST. 이것 다음, 이차 항 체 솔루션 5% 당나귀 혈 청 1에서 희석에 희석 추가 실 온에서 1 h x PBST 빛에서 슬라이드를 보호 하 고.
- 보조 솔루션을 제거 하 고 1에 슬라이드 세 번 씻고 10 분 x PBST. 마지막 세척에 추가 300 nM DAPI.
- 미디어를 제거 하 고 설치 미디어와는 coverslip 추가. 스토어 이미지 준비까지 멀리 빛 4 oC에에서 슬라이드.
4. 대 본 분석에 대 한 Pancreatoids에서 RNA의 격리
- Pancreatoids 1.5 mL 튜브에 산 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-솔루션의 500 µ L로 불 임 및 장소에 대 한 필터링 된 1000 µ L 피 펫 팁 입 피 펫에 연결 된 붕 규 산 모 세관을 사용 하 여 수집 합니다. -80 oC에 저장 하거나 즉시 RNA 격리를 진행.
- RNA 격리에 대 한 필요한 경우 얼음 샘플을 해 동 하 고 클로 프롬의 100 µ L를 추가 합니다. 4 oC 15 분에 대 한 장소와 소용돌이 잘 미리 냉각 4 oc. 원심 분리기
- 장소 튜브 원심 분리기 및 스핀 4 oc.에서 12000 g에서 20 분
- 조심 스럽게 튜브 레이어 분리를 방해 하지 않는를 제거. 200 µ L 피 펫을 사용 하 여, 명확한 수성 해결책을 수집 하 고 흰색 단백질 층 및 분홍색 DNA 층에서 버퍼에 작은 금액을 뒤에 남겨두고 새로운 1.5 mL 튜브에 배치. 이 과정에서 아무것도 피 펫의 끝을 만지지 마십시오 하 고 1.5 mL 튜브의 벽을 만지지 마십시오.
- 수성 층과 소용돌이 포함 하는 새 튜브를 100% 소 프로 파 놀의 500 µ L를 추가 합니다. 앉게 실 온에서 20 분, 얼음, 더 이상 또는 최대 강수량 하룻밤 사이에 두고-20 oc.
- 4 oC를 작은 RNA에서 15 분 동안 12000 g에서 원심. 펠 릿을 방해 하지 않고는 소 프로 파 놀을 제거 합니다.
참고: pancreatoids는 작은, 그것은 가능성이 펠 릿 표시 되지 것입니다. - 감기, 75% 에탄올을 추가 하 고 여러 번 튜브를 반전. 원심 분리기에 놓고 에탄올과 9000 x g에서 2 분 동안 회전 4 oC. 제거에서 10 분 동안 9000 x g에서 회전 합니다.
- 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 지역에 거주 하는 펠 릿 하지 않고 튜브에 어떤 나머지 에탄올을 제거. 잔여 에탄올의 증발 되도록 실 온에서 5 ~ 10 분에 대 한 튜브에 뚜껑 열어 둡니다.
- 깨끗 한, nuclease 무료 물 20 µ L에서 vortexing에 의해에 펠 릿을 resuspend.
선택 사항: 열 RNA 65 oC 3 분 하 고 즉시 얼음에 반환 합니다. RNA-80 oC에 저장 하거나 즉시 반전 녹음 방송 및 정량에 사용 될 수 있습니다.
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Representative Results
마우스 배아 자 궁 경적에서 e10.5에서의 주의 해 부 추가 해 부 (그림 1A)에 대 한 PBS에 손상 되지 않은 배아 항복 한다. 위장은 배아 (그림 1B), 내장 및 위 (그림 1C F)의 교차점에서 등 쪽 췌 장 새싹의 분별을 허용에서 효율적으로 제거할 수 있습니다. E10.5 췌 장 새싹 이전 특징 되었습니다; 창시자는 Pdx1, Sox9, Ptf1a, 및 Hes120,21,,2223을 표현 한다. 조직 처리 단계에 따라 천연된 췌 장 단일 세포 또는 세포의 작은 그룹 가벼운 현미경 검사 법 (그림 1G H)에 의해 구상 될 수 있다.
Organogenesis 미디어에서 이러한 부동성, 비 계 없는 셀 자체 조립 하 고과 문화 (그림 2A)에서 적어도 10 일 동안 계속 성장 하는 3 차원 pancreatoids로 구성. pancreatoids vivo에서 췌 장, 분기 morphogenesis 발생과 형태학 유사성이 있다. 유전자 변형 쥐를 사용 하 여, 실시간으로 다른 세포 유형 또는 과정을 모니터링할 수 있습니다. 예를 들어 Ins1 eGFP24 마우스를 사용 하 여 내 분 비 하는 베타 세포의 형성을 표시를 pancreatoids 수 수 몇 군데 베타 셀 개발 (그림 2B)을 시각화 하기 위해 매일. 또한, 문화 조건 변경, 추가 작은 분자, 약물, 또는 게놈을 조작, 뿐만 아니라 세포 운명 결정 평가 될 수 있다 그러나 구조 및 형태학에 있는 변화는 또한 조사 수 있습니다. 여기에 우리가 높은 농도에서 키 니 아 제 C 활성 제 단백질 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)의 응용 프로그램 표시 (160 nM), 상피 세포를 연결 하 고 분기 증가 pancreatoids, 느슨하게 이어지는 개발의 형태를 변경 19 (그림 2C).
췌 장의 상피 세포와 췌 장 mesenchyme 조직의 협회 평가, immunostaining 각 조직의 표식에 대 한 수행할 수 있습니다. 덕트 마커, DBA25,26, 내 분 비 표식, Chga27및 핵 DAPI에 의해 표시의 Immunostaining pancreatoids (그림 3A)에서 멀티 혈통 형성 공개. Mesenchyme 마커, Vimentin, 공동 췌 장의 조상 표식으로 물 (약 e15.5 e9.0)에서 Pdx1, 보여준다는 mesenchyme pancreatoid (그림 3B) 봉투. Immunostaining는 또한 종류의 세포의 다른 마커 뿐 아니라 Pdx1 공개 분기 구조, 형태를 검사 하 사용할 수 있습니다. 그림 3C, 우리는 상피 마커 Pdx1 및 베타 세포 마커 기능 사용 하 여 정량 분석, 창시자의 녹취 록에 대 한 얼룩 및 세포 분화에 의해 베타 셀 개발을 시각화 한 조상 유전자 등 평가 Pdx1 와 Hes1, 그리고 차별화 된 마커 Prss1, Prss3, Hnf6, Isl1, Nkx6-1, 및 Ins1 (그림 4).
그림 1: 해 부, 분리, 및 pancreatoid 세대에 대 한 e10.5 췌 장 창시자의 도금의 개요. (A) e10.5 배아의 명시 이미지. (B) 왼쪽 상단에서 시작 해 부 절차의 회로도 빨간색, 파선 영역 잘라내기, 녹색 지역은 위장을 나타냅니다. 첫째, 머리 forelimb 새싹의 제거 및 유기 체의 측면의 개통 다음 제거 됩니다. (C) 위장은 신중 하 게 제거, 관의 복 부 지역에서 튀어나와 심장과 간 싹. 복 부, 등 쪽 췌 장 새싹 및 장 수 될 시각, 대물 이미지와 같이. (D) 심장 및 간 새싹의 제거. 회로도 왼쪽에 고 명시 이미지 오른쪽에 있습니다. 등 쪽 췌 장 새싹의 주위 조직 (E) Pinching 버드 해 부에 대 한 노출 회로도 왼쪽에 고 명시 이미지 오른쪽에 있습니다. (F)는 위장 요로 명시 야 현미경 아래 등 쪽 췌 장 새싹으로. 왼쪽에 있는 이미지, 소장에서 벤드는 표시, 척추 지역에서 위장 분리 때 집게를 배치 될 수 있습니다. 오른쪽에 고배율 대물 이미지 모두 등 쪽과 복 부 췌 장 새싹을 보여 줍니다. (G) 등 쪽 췌 장 새싹 및 조직의 분리, organogenesis 미디어 물의 resuspension 전에 처리 및 도금의 제거. (H) 대물 이미지 도금 직후 해리 셀을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Pancreatoids 시간이 지남에 모니터링. (A) 주 1, 주 2, 및 3 일에서 pancreatoids의 명시 이미지. 바 규모 = 100 um. (B) 췌 장 morphogenesis 조사 문화 조건의 조작. 여기, PMA의 높은 레벨의 추가 하루 1과 2에서 명시 야 현미경 검사 법에 의해 시각으로 불린된 상피 구조와 증가 분기를 지도 한다. 스케일 바 하루 4, 5 일, 6 일, 하루 7, 및 eGFP 녹색에서으로 표시 된 베타 세포의 개발 일 9, 100 µ m. (C) Ins1-eGFP 마우스 pancreatoids =. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Pancreatoids의 Immunostaining. (A) Immunostaining pancreatoid 녹색, 및 핵 DAPI에서 파란색으로 표시 Chga 여 빨간색, 내 분 비 세포에서 DBA에 의해 덕트를 표시 하려면 5 일에. (B) Immunostaining pancreatoid Pdx1 여 녹색에서 빨간색과 췌 장 창시자에 의해 Vimentin mesenchyme 표시 하려면 7 일에. (B) Immunostaining pancreatoid Pdx1 여 녹색에서 빨간색과 췌 장 창시자에 의해 인슐린 베타 세포를 7 일에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 대 본 분석. 창시자와 차별화 세포의 표식에 대 한 하루 7 pancreatoids의 양이 많은 PCR Vivo에서 murine 조직 비교 Scavuzzo 외 에 표시 됩니다. (2017). 결과 Gapdh으로 정규화 됩니다. N = 2, 스케일 바는 SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 구성 요소 | 약어 | 최종 농도 |
| 페니실린-스 | P/S | 1% |
| FBS-무료 미디어 보충 | 10% | |
| 베타-Mercaptoethanol | 공학 | 0.1 m m |
| Phorbol Myristate 12 13-아세테이트 | PMA | 16 nM |
| Y-27632 또는 바위 억제제 | RI | 10 음 |
| 표 피 성장 인자 | EGF | 25 ng/mL |
| R-Spondin1 | - | 500 ng/mL |
| 산 성 섬유 아 세포 성장 인자, 섬유 아 세포 성장 인자 1 | aFGF, FGF1 | 25 ug/mL |
| 헤 파 린 나트륨 소금 | 헤 파 린 | 2 U/mL |
| 섬유 아 세포 성장 인자 10 | FGF10 | 100 ng/mL |
| Dulbecco의 수정이 글 매체/영양소 혼합 F-12 | DMEM/F12 | 5 mL를 |
표 1입니다. Organogenesis 미디어입니다.
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Discussion
셀 문화 모델의 진행은 제대로 개발 모델, 임상 관련 세포 유형, 시험 약물 효능, 또는 심지어 이식 환자에 게 중요 합니다. 그러나, 인위적으로 업과 접시에 개발은 도전으로 우리는 여전히 organogenesis과 생리학의 메커니즘을 이해 멀리 vivo에서. 따라서 체 외에서 세포는 효율적으로 생성 된, 완전히 기능, 시간, 오랜 기간 동안 유지 될 또는 본문에 대 등 한 셀에서 다른 이상 항구 수 없습니다. 많은 다른 세포 유형 개발 및 생리학에 영향을 발생 하는 복잡 한 전체적 변화 하는 동안 상호 작용 하는 때문입니다. 체 외에서 의 편의 결합 하 여 개발 진행 하는 방법에 대 한 이해를 얻고 vivo에서 개발의 복잡성을 유지 하면서 시스템 것 이라고가 르 친다 생명 의학 연구를 위한 유용한 도구를.
Organoids의 개발은 개발의 복잡성을 모델링으로 유망한 애비뉴. 이 프로토콜에서 우리 췌 장 organoids, pancreatoids, 네이티브 mesenchyme 유지 하 고 pancreatoids 포도 당 응답을 전시 하지 않습니다 불구 하 고, 내 분 비 세포를 튼튼하게 생성 되 나를 확인 하는 방법을 설명 합니다. 이 도구는 vivo에서발견 하는 조직의이 질을 유지 하는 문화 시스템에서 기능 개발의 메커니즘을 조사를 사용할 수 있습니다. 또한,이 유전 화면 또는 화면 작은 분자 또는 약물을 사용할 수 있습니다. 이것은 흥미로운 특히 상대적으로 균질 성 세포 배양 시스템에서 테스트 후보 약물 다른 밀접 하 게 관련된 셀 형식에이 화합물의 효과 우회 수 있습니다.
이 프로토콜 중 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 자 궁에서 태아의 주의 제거는으로 중요 한 복 부 영역을 추출 하 고 위장 췌 장 새싹 (1.3 단계)를 분별 하기 어려운 게 수 강제로 태아를 꺼내. 위장에서 췌 장 새싹의 두 번째, 깨끗 한 절 개는 중요 한, 다른 세포 유형 (단계 1.4.4)의 차별화로 이어질 수 있습니다 복용 초과 조직. 이렇게 하려면 췌 장 새싹 아래 공략 하 여 췌 장 새싹 분리 이전 overlaying 조직 리프트 중요 하다. 마지막으로, 이동할 때 꽃 봉 오리는 dispase에서 다시 씻어 PBS, 그것은 절대적으로 붕 규 산 모 세관 튜브를 사용 하 고 조직 관 개통의 가장자리를 터치 해 주세요, 그렇지 않으면, 조직 (단계 1.5.1) 튜브의 끝에 막대기 것입니다. 이 방지 하려면 꽃 봉 오리가 아닌 외부에 튜브에 새싹을 수 있도록 쪽으로 이동 하기 전에 입 pipetting 솔루션을 시작 합니다.
그러나이 메서드는 3 차원 pancreatoid 내 분 비 세포의 형성을 허용,, 상피 분기 다른 기존 프로토콜16,17보다 제한 합니다. 또한, 인슐린을 생산 하는 내 분 비 세포 형태, 하는 동안 그들은 할 전시 하지 포도 당 응답. 따라서, 추가이 세포의 성숙에 대 한 조사 정보 제공 합니다 귀중 한 모두 베타 세포 생성의 분야 뿐만 아니라 기능 pancreatoids의 생성에 일반적.
Pancreatoids의 생성 하는 내 분 비 세포, 개발 그리고, 나중에 포도 당 응답을 얻을, 당뇨병의 치료에 대 한 잠재적인 영향. 당뇨병은 췌 장 베타 세포 손실 또는 역 기능 그리고 잠재적으로 질병 합병증을 완화 수 있습니다 이러한 세포를 교체 재생 치료를 위한 주요한 후보자 이다. 그러나 당뇨병에서 베타 세포,,로 hPSCs를 차별화 진행 했다, 췌 장 베타 세포, 알파 세포 또는 포상 세포28,29, 등 함께 다른 셀 형식에 장애는 종종 30,,3132. 따라서,이 식 위한 새로운 췌 장 조직 생성 괴로움된 조직을 완전히 바꿀 수 있습니다. Murine pancreatoid 형성 및 기능 추가 조사와 함께 발달 궤적 hPSCs의 인간의 pancreatoids를 생성 하 유사 수 있습니다. 재생 치료를 위한 환자 특정 맥락에서 약물에 응답에 대 한 화면에 맞춤된 의학에 대 한 이러한 인간의 pancreatoids는 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
프로토콜 및 원고에 관한 유용한 토론에 감사 Jolanta Chmielowiec 하 고. 우리는 또한 confocal 현미경에 접근을 위한 벤자민 Arenkiel 감사합니다. 이 작품은 NIH (P30-DK079638 M.B.)와 T32HL092332-13 마스와 M.B., 맥 네 어 의료 재단 (M.B.), 및 BCM 지적 발달 장애 연구 센터에서 confocal 코어에 의해 지원 되었다 (NIH U54 HD083092는 유 니스에서 케네디 슈 라이버 국립 연구소의 건강 그리고 인간 발달).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
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