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Biology

植物-微生物相互作用:丝状芽孢杆菌对马铃薯根系分泌物的转录反应

doi: 10.3791/57606 Published: July 2, 2018

Summary

本议定书的目的是研究 endosphere 分离芽孢杆菌丝状对马铃薯根系分泌物的 transcriptomic 反应。这种方法有助于鉴定与植物微生物相互作用有关的重要细菌基因, 并原则上适用于其他菌和植物, 并作小的调整。

Abstract

有益植物相关的细菌在促进植物生长和预防疾病中起着重要作用。应用植物生长促进细菌 (PGPR) 作为生物肥料或生防剂已成为使用常规肥料的有效替代品, 并能以较低的成本提高作物生产率。植物-微生物的相互作用取决于寄主植物分泌的信号以及它们伴生细菌的反应。然而, 分子机制的有益细菌如何响应其相关的植物衍生信号是没有充分了解。评估细菌对根分泌物的 transcriptomic 反应是确定际条件下细菌基因表达和调控的有力途径。这种知识对于了解植物-微生物相互作用所涉及的基本机制是必要的。本文描述了一个详细的协议, 以研究丝状EC18 的 transcriptomic 反应, 从马铃薯 endosphere 的菌株, 马铃薯根系分泌物。在最近的高通量测序技术的帮助下, 该协议可以在几个星期内执行, 并产生大量的数据集。首先, 我们收集在不育条件下的根分泌物, 然后将它们添加到B. 丝状文化中。这些文化中的 RNA 是用苯酚/氯仿方法与商业试剂盒相结合, 并通过自动电泳仪器进行质量控制而分离出来的。在测序后, 采用基于 web 的 T 型雷克斯管道进行数据分析, 确定了一组差异表达基因。这种方法是一个有用的工具, 以促进新发现的细菌基因所涉及的植物-微生物相互作用。

Introduction

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植物可能渗出多达20% 的碳固定在光合作用中通过根进入根际1,, 土壤狭窄的区域附近的根。由于养分的可用性较高, 根际是一种适合多种微生物的栖息地, 包括植物生长促进细菌。根分泌物含有一系列无机化合物, 如离子、无机酸、氧和水。然而, 大多数根系分泌物是由有机物质形成的, 可分为低分子量化合物和高分子量化合物。低分子量化合物包括氨基酸, 有机酸, 糖, 酚类化合物, 脂肪酸, 和一系列次生代谢物。高分子量化合物包括粘液和蛋白质2,3。根际微生物可以将其中一些化合物用作生长和发育的能量来源。根系分泌物在 rhizobacterial 群落的形成过程中起着重要的作用, 因为植物产生的化合物能通过影响特异基因的表达影响根际相关细菌的行为。

了解细菌对根分泌物的反应是破译植物-微生物相互作用机制的关键步骤。由于细菌对植物-微生物相互作用的反应是差异基因表达的产物, 可以通过转录分析来研究。使用这种方法, 以前的研究发现了几个重要的基因参与植物-微生物的相互作用。在铜绿假单胞菌中, 参与代谢、趋化和 II. 型分泌的基因对甜菜根分泌物4有反应。风扇5研究了amyloliquefaciens FZB42 对玉米根系分泌物的 transcriptomic 分析。结果表明, 在根分泌物强烈诱发的基因中, 有几个组参与了与养分利用、趋化、运动和非核糖体合成抗菌肽和 polyketides 有关的代谢途径。

这些研究的准确性依赖于根系分泌物的收集。虽然有几种方法描述了用于不同目的的根分泌物的收集, 但它们要么要求尖端仪器, 要么在受控条件678中不执行。此外, 根际抑制微生物可以影响植物细胞膜通透性和损害根组织, 特别是在微生物联合体9的情况下, 对根分泌物的组成有很显著的作用。在调查微生物对根分泌物的反应时, 重要的是使用明确的条件, 以避免其他微生物对化合物的改变10。此外, 基于 rna 序列的转录研究需要高质量的 rna。然而, 当处理非模型细菌菌株时, 标准协议或商业套件通常由于未知因素或特殊生长特性而效率低下。

这里描述的协议是使用丝状, 这是一个革兰阳性, 孢子形成细菌的 Firmicute。它在各种植物的根际中普遍存在。本文报道了几种植物生长促进特性, 包括甜菜11的系统抗性 (ISR) 的诱导, 对黄瓜12禾草病原菌的抑制作用, 以及氮固定在向日葵根际13。然而, 其与寄主植物相互作用的分子机制还没有得到很好的研究。

本文的实验目的是研究 endosphere 分离的丝状对马铃薯根系分泌物的 transcriptomic 反应。简而言之, 该议定书由以下步骤组成: 一是在无菌条件下收集马铃薯根系分泌物。然后, 从细菌细胞中提取高质量的 RNA, 用根分泌物处理。最后一步是使用基于 web 的 T 雷克斯管道14的数据分析。该协议用于识别丝状基因, 表明在接触到根系分泌物时表达水平的变化, 从而可能在植物微生物相互作用中发挥重要作用。

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Protocol

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1. 杀菌条件下的马铃薯发芽

  1. 用无菌水冲洗马铃薯表面。将马铃薯浸泡在70% 乙醇中, 然后在3% 次氯酸钠中沐浴, 每人5分钟。再用无菌水冲洗, 除去剩下的次氯酸钠。
  2. 准备发芽和生长马铃薯块茎所需的材料;将塑料罐、植入篮子、蛭石和水热处理121摄氏度以20分钟消毒。
    注: 确保所有使用的材料都耐高压。否则, 使用其他杀菌方法。
  3. 将表面杀菌的马铃薯放入植入篮中, 放入含湿蛭石的蒸压锅中。
  4. 把锅放在24摄氏度的气候室里三周。设置它的周期16小时的光 (120 µmol m-2s-1) 和 8 h 的黑暗。为了避免微生物污染, 用一个大的玻璃纤维盒盖住锅。

2. 马铃薯根系分泌物的收集

  1. 当芽苗发芽时, 将篮子与整个马铃薯转移到一个被消毒的烧杯中, 装满150毫升的蒸压去离子水, 土豆块茎放在水面上, 根埋在水中 (见图 1)。保持幼苗在气候室, 并使用相同的设置之前 [24 °c; 周期的16小时的光 (120 µmol m-2s-1), 8 h 的黑暗]。
  2. 从第二天起, 收集含有分泌物的水, 用无菌的去离子水将烧杯填满。每天进行取样, 直到转移苗后的第七天。
  3. 将每个样品分别存放在4摄氏度。对于每个样品, 在 Luria Bertani (磅; 1% 胰蛋白胨, 0.5% 酵母萃取物, 0.5% NaCl) 琼脂板上传播100µL, 以检查微生物污染物。丢弃被污染的样品。
  4. 将所采集的样品组合成一个幼苗, 并将其浓缩为-40 °c, 最后体积为150毫升。

3. 细菌生长

  1. 将 a 的丝状菌株从-80 摄氏度甘油储存到 LB 琼脂板上, 并在30摄氏度的一夜内孵化出盘子。
  2. 接种一个磅液体培养基与一个单一的殖民地从板块, 并种植的文化在一个颤抖的孵化器在 200 rpm 隔夜在30摄氏度。

4. 细菌的治疗和取样

  1. 将根分泌物处理的细菌生长曲线与阴性对照进行比较, 制备出含有50毫升 LB 液培养基的一系列烧瓶。在所有烧瓶中加入0.5 毫升的隔夜细菌培养, 并分别将0%、5%、10% 或 15% (v/v) 根渗出物或无菌去离子水添加到培养基中。
  2. 使用具有去离子水的文化代替根分泌物作为控制。测量光学密度在600毫微米 (OD600) 以后每 1 h。通过绘制 OD600值与时间来生成增长曲线。
    注: 我们看到10% 的根分泌物不影响B. 丝状的生长 (见图 2);该比值用于 RNA 序列实验。
  3. 用90毫升预热的 LB 培养基, 将一夜之间的丝状文化稀释到600毫升0.05 的最初 OD。添加10毫升的根分泌物的培养和孵化它在30°c 1 小时。
  4. 使用10毫升无菌去离子水处理作为控制。以 9000 x g 为2分钟, 在4摄氏度时, 从养殖中收集细胞。丢弃上清液, 立即将颗粒冻结在液氮中, 然后将其贮存在-80 摄氏度, 直至使用。

5. RNA 分离

注意: 在开始隔离之前, 准备工作台、机架和吸管, 方法是用 RNase 净化液清洗它们 (见材料表)。随时戴上手套, 确保所有的管子、小贴士和解决方案都是 RNase 的。尽可能把样品放在冰上。

  1. 添加 0.1% (v/v) 的焦碳酸二乙基 (DEPC) 到超纯水 (100 µL DEPC 每100毫升溶液), 搅拌好, 并保持在室温下过夜。在隔夜治疗后, 将混合物 DEPC 灭菌。使用此 DEPC 处理的超纯水制备 TE 缓冲器 [10 毫米三盐酸 (pH = 8); 1 毫米 EDTA] 和 10% SDS (w/v) 溶液。
  2. 在冰上解冻细胞颗粒, 在400µL (DEPC) 缓冲中悬浮。将悬浮液转移到2毫升螺钉盖管中。
  3. 预混料300µL 氯仿-异戊醇 (24:1 伏/五) 和300µL 苯酚 (酸苯酚, RNA 级), 并允许混合物站立5分钟。用500µL 的有机上相添加到悬浮细胞。然后加入50µL 10% SDS 和0.5 克玻璃珠 (0.5 µm) 入管。
  4. 牢固地关闭盖子并且安置管子在一个珠磨房均质机 (参见材料表)。执行3×四十五年代脉冲均匀化与1分钟间隔在冰上。
  5. 离心样品为10分钟在 1.1万 x g (4 °c), 并且转移上部阶段到新的管子。
  6. 加入500µL 氯仿-异戊醇 (24:1) 到上阶段从步骤5.5 和离心机混合物5分钟在 1.1万 x g (4 °c)。
    注: 以下步骤是从制造商的说明中修改的, 它是基于商用玻璃纤维过滤器的 RNA 隔离套件 (见材料表)。
  7. 将上部相的500µL 转移到一个新鲜的管子上, 加入2卷 (1 毫升) 的裂解/结合缓冲液, 并将其与吹打上下混合。
  8. 结合过滤器和收集管 (从 RNA 隔离套件) 和吸管的混合物从步骤5.7 到过滤管。离心管为十五年代在 8000 x g 和放弃流动通过。
  9. 准备1.5 毫升离心管, 100 µL DNase 缓冲器, 10 µL DNase I, µL 抑制剂 5 RNase (见材料表)。在过滤管的过滤器上添加准备好的溶液组合, 在15-25 摄氏度时孵化 20-30 分钟。
  10. 按照制造商的指示执行洗涤步骤。使用50µL 的洗脱缓冲洗脱 RNA。
  11. 保存洗脱 RNA 在-80 摄氏度, 并在它周围放置一个塑料石蜡膜。同时, 将一些微升的样品转移到一个1.5 毫升的离心管上进行质量检查。

6. RNA 质量检查和排序

  1. 用 microvolume 分光光度计检查 RNA。
    注: 吸光度率在260/280 以上应高于 1.8, 比例为260/230 以上至少 1.8, 最好在2.0 以上。
  2. 使用推荐的 rna 分析试剂盒在自动电泳仪器中运行纯化 rna (见材料表);RNA 完整性号 (玲) 必须至少在7以上才能继续。
  3. 根据制造商的建议, 每样使用3µg 的 rna, 生成具有 rna 序列库准备套件 (见材料表) 的库。
    注: 在高通量测序平台上对库的准备工作进行了排序, 生成了配对端读取。

7. 使用基于 Web 的管道 T 雷克斯的数据分析

  1. 使用 FASTX 工具包版本 0.0.13 (Phred 质量分数 > 20) 执行质量筛选。用 Trimmomatic 工具修剪来自适配器序列的原始 RNA 顺序读取。
    注: 所有下游分析都是以高质量的干净数据为基础的。
  2. 下载B. 丝状ATCC 6462 NCBI 基因组数据库 (NCBI 加入号: CP009692.1), 并将其作为参考基因组, 用于映射使用 Bowtie2/2.2. 3 的清洁读数。
  3. 使用 HTSeq v0.6.1 计数映射到每个基因的读取数字和每 kilobase 每百万的转录读数 (RPKM) 的每个基因根据该基因的长度和读取计数映射到这个基因。
  4. 为了分析 T 雷克斯管道的数据, 请使用 RPKM 表作为输入, 以及三描述性文件: (i) 一个因素文件来描述实验的因素, (ii) 对比文件, 以确定哪些因素将比较的差异基因表达和 (iii) 一个类文件来描述感兴趣的基因组。
    注意: 描述性文件是 in.txt 格式。例子可以在 T-雷克斯 (http://genome2d.molgenrug.nl/) 的网页上找到。一个详细的数据分析指令, 使用 T 雷克斯可以在以前的出版物中找到. 14

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Representative Results

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植物相关的微生物可以积极地影响植物的生长和健康。然而, 植物与微生物共生的复杂相互作用机制还没有得到充分的理解。根系分泌物在调节 rhizobacterial 活动和行为方面起着重要作用, 一般认为根系的微生物定植与微生物对根系分泌物的吸引有关。本研究的目的是探讨 rhizobacterial B 丝状对马铃薯根系分泌物的 transcriptomic 反应。为实现这一目的, 马铃薯块茎在蒸压蛭石中被表面杀菌和发芽。然后收集根分泌物, 如图 1所示。为了排除影响细菌生长的根分泌物的可能性, 15% 的根分泌物被添加到B. 丝状培养中, 在测量时间内没有发现生长变化 (图 2)。因此, 在本研究中观察到的基因表达变化不太可能是由生长相关的影响引起的。

收集后, 根分泌物被添加到B. 丝状培养物的10% 比值 (v/v), 细菌总 RNA 被隔离如前所述。然后, RNA 通过自动电泳仪进行质量检查, 结果如图 3所示。图 3A3B表示从丝状的根分泌物中分离出的 rna,图 3C3D代表从对照组分离出来的 rna。所有样本均在9以上, 两个清晰带对应于16S 和 23S RNA 亚基, 表明该协议获得高质量的 rna。

在库准备后, 用高通量测序平台获得了对端读取。原始 RNA 序列读从适配器顺序被修剪了并且映射了反对参考基因组序列。在结果数据中, 生成了 RPKM 表。转录分析是用 T 雷克斯管道进行的。图 4显示了所有差异表达基因的比值强度图。与对照组相比, 马铃薯根系分泌物的添加导致715基因差异表达。其中408种基因为上调, 307 基因 downregulated15表 1列出了一些基因表达改变的相对变化。

Figure 1
图 1: 马铃薯根系分泌物的收集工艺方案.所使用的材料是蒸压和发芽是在一个气候室进行。用消毒过的水洗马铃薯块茎, 在 2-3% NaOCl 中沐浴5分钟. 将土豆放入一个蒸压篮中, 放入含有湿蛭石的锅中。在气候室里种植马铃薯 3-4 周, 然后将篮子与马铃薯幼苗转移到烧杯中。每天收集根分泌物, 用灭菌的水将烧杯填满。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 不同浓度马铃薯根系分泌物的丝状生长曲线。菌株 EC18 生长在液体 LB 培养基中, 添加马铃薯根分泌物或无菌 H2O.600度测量每1小时, 并绘制与时间。所有的组显示相似的生长模式, 表明多达15% 的根分泌物添加对B. 丝状生长没有显著影响。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 通过自动电泳仪检测 RNA 质量.Ab代表从丝状中分离出的 rna, 用根分泌物治疗, CD代表从对照组分离出来的 rna。所有的 RNA 样本显示两个清晰的波段对应23S 和 16S rRNA 和弱 5S rRNA 波段。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 在对马铃薯根系分泌物的反应中,丝状RNA 序列样品的差异基因表达的比值强度图.这个数字是由霸王龙自动生成的。X 轴表示基因表达式水平, Y 轴表示 log2-transformed 折叠变化。基因正在上升, downregulated 有正负 log2 比值值。条纹区域中的点表示的基因没有明显的过度或未表达。请单击此处查看此图的较大版本.

基因标记 折叠更改 注释
BG05_RS09165 + 3。3 多药外流蛋白
BG05_RS20930 + 25。3 膜蛋白
BG05_RS10935 + 23。3 第三阶段孢子蛋白广告
BG05_RS08990 - 11。8 孢子蛋白
BG05_RS16405 + 3。9 IclR 家庭转录调节器
BG05_RS24905 - 3 色氨酸合酶亚基α
BG05_RS24920 - 2。3 indole-3-glycerol 磷酸合酶
BG05_RS22255 - 27 乙酰乳酸合成酶
BG05_RS22250 - 6。5 缩酮酸 reductoisomerase
BG05_RS22265 - 26。4 支链氨基酸转氨酶
BG05_RS18715 - 2。8 普鲁兰酶
BG05_RS18040 + -9。1 发芽蛋白 YpeB
BG05_RS16930 + -4。2 糖 ABC 载体 ATP 结合蛋白
BG05_RS27345 + -2。9 MFS 运输器
BG05_RS19555 - -3。3 纤维二糖转运子亚单位 IIB
BG05_RS24345 - -2。7 腐胺进口商
BG05_RS22525 - -12。4 心合成酶
BG05_RS15225 - -3。3 膜蛋白
BG05_RS18475 + -5。7 膜蛋白
BG05_RS19095 + -2。1 发芽蛋白

表 1: 与对照组比较, 根分泌物处理小组差异表达基因列表。

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Discussion

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植物-微生物相互作用被假设是由一个微妙地调整的平衡在细菌和植物之间决定。这种相互作用是高度复杂和难以研究的自然系统, 其中包括多种微生物物种, 可能作为联营集团。本文介绍了一种简化的协议, 以研究在良好的控制条件下, 根分泌物的细菌反应。在暴露于根分泌物时, 细菌的转录剖面提供了细菌对根际生态位的适应的详细信息。这种根分泌物收集协议不需要复杂的程序和专用设备。然而, 所有的程序必须在严格的无菌条件下进行, 并应包括不育控制。我们建议并行种植几个马铃薯块茎, 并丢弃被污染的。如果正在研究其他植物物种, 则可以对该协议进行修改。重要的是, 使用适当的方法来消毒任何种子/块茎, 因为它们可能会因耐药性不同而适用于消毒剂。

一旦获得根系分泌物, 就必须从细菌细胞中分离出高质量的 RNA。主要基于苯酚/氯仿或 TRIzol 方法的各种试剂和标准协议耗时16。商业套件主要是为模型生物体设计的, 但不适用于其他产品。这种 rna 隔离协议, 结合苯酚/氯仿方法和 RNA 隔离套件克服了这些方法的缺点。此外, 在融汇B. 丝状细胞中, 通常聚集在浮游文化中, 也包括了一个珠跳动的步骤。在洗脱之前, DNase 的额外孵化会去除潜在的 DNA 污染。高的数目意味着分离完整的 RNA。因此, 本议定书对环境细菌菌株具有特别的效率和省时性。

在 rna 测序之后, 用基于 web 的统计分析管道对 rna 序列基因表达数据14进行数据分析。这条管道是用户友好的, 特别是对于没有广泛的生物信息学知识的生物学家。输入文件是原始的 RNA 表达式水平数据, 如 RPKM, 每 kilobase 的片段每百万映射读取 (FPKM), 计数每百万映射读取 (CPM) 或其他基因表达单位。这种基因表达价值文件可以通过可用工具生成, 包括 SAMtools17、BEDtools18和龙19。为了运行 RNA 序列分析, 需要三个其他输入文件。这些文件用于定义描述实验和复制的因素, 不同实验条件和感兴趣基因组的比较。当上传输入文件时, 分析过程只需要几分钟时间。

表 1列出了丝状EC18 的几种差异表达基因, 当根分泌物处理时。其中, 对膜蛋白编码的几种基因的表达进行了改变。与孢子或发芽过程相关的基因有差异表达。孢子的基因表达也随水稻幼苗的生长而变化, 因为根系分泌物为细菌细胞的动态增长提供所需的能量18。IclR 转录调节剂的表达与多药耐药性和土壤细菌中芳香族化合物的降解有关, 上调。与野生型菌株相比, 细菌肺炎克雷伯菌的 IclR 缺失菌株降低了磷酸酯的增溶性。一些与氨基酸代谢和合成有关的基因被刺激, 而涉及糖转运的基因, 包括纤维二糖转运器 downregulated。这表明, 应变 EC18 可能有代谢偏好的氨基酸超过糖的根际。通过制作击倒或过度表达突变体, 可以对改变基因的功能进行原位研究。总之, 这里描述的协议可以快速识别出大量的潜在重要的细菌基因, 涉及植物微生物相互作用。

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Disclosures

作者声明他们没有竞争的财政利益。

Acknowledgments

我们感谢雅各布维尔为他提供了有益的意见和建议。我们还感谢安妮在生物信息学分析方面的帮助。Yanglei 和智博李得到中国奖学金委员会 (CSC) 的支持。我们感谢 NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) 对 OPK 的财政支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium hypochlorite Sigma  CAS: 7681-52-9  10-15%  active chlorine
Luria-Bertani (LB) broth
incubater New Brunswick Scientific Innova 4000
spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Genesys 20
liquid nitrogen
glass beads Sigma G8893 0.5 µm
2.0 ml tube with screw cap RNase free
1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube RNase free
Bead mill homogenizer BioSpec 607 Mini_beadbeater
centrifuge Eppendorf 5430
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) sigma CAS: 1609-47-8
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) sigma CAS: 151-21-3  10% solution prepared with DEPC treated MQ water
TE buffer 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8
phenol Sigma RNA grade
chloroform-isoamyl alcohol  prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature
High pure RNA isolation kit Roche 11828665001
RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780 RNase-Zap
Automated electrophoresis instrument Agilent 2100 Bioanalyzer
Microvolume spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Nanodrop ND-1000
RNA quality analysis kit Agilent RNA 6000 Nano kit 
RNase inhibitor Thermo Fisher Scientific RiboLock
Directional RNA library Prep kit NEB Ultra For Illumina

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References

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植物-微生物相互作用:<em>丝状芽孢杆菌</em>对马铃薯根系分泌物的转录反应
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Cite this Article

Yi, Y., Li, Z., Kuipers, O. P. Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates. J. Vis. Exp. (137), e57606, doi:10.3791/57606 (2018).More

Yi, Y., Li, Z., Kuipers, O. P. Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates. J. Vis. Exp. (137), e57606, doi:10.3791/57606 (2018).

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