Summary
وهدف البروتوكول المعروضة هنا دراسة استجابة ترانسكريبتوميك اندوسفيري-المعزولة Bacillus ميكويديس للإفرازات الجذرية البطاطا. هذا الأسلوب يسهل تحديد الجينات البكتيرية الهامة المشاركة في التفاعلات بين الميكروبات والنبات وهو مبدأ ينطبق على اندوفيتيس والنباتات، مع إدخال بعض التعديلات الطفيفة الأخرى.
Abstract
البكتيريا المفيدة المرتبطة بالنباتات تلعب دوراً هاما في تعزيز النمو والوقاية من الأمراض في النباتات. تطبيق رهيزوباكتيريا تشجيع نمو النبات (PGPR) كوكلاء الأسمدة أو عشب أصبح بديل فعال لاستخدام الأسمدة التقليدية ويمكن زيادة إنتاجية المحاصيل بتكاليف منخفضة. التفاعلات بين الميكروبات والنبات تعتمد على إشارات يفرز النبات المضيف، ورد الممتلكات من البكتيريا المقترنة بها. بيد أن الآليات الجزيئية للبكتيريا المفيدة كيف تستجيب ليرتبط المشتقة من النباتات إشارات غير مفهومة تماما. تقييم استجابة ترانسكريبتوميك البكتيريا للإفرازات الجذرية نهج قوية لتحديد الجينات البكتيرية وتنظيم ظروف رهيزوسفيريك. هذه المعرفة أمر ضروري لفهم الآليات الكامنة التي تشارك في التفاعلات بين الميكروبات والنبات. وتصف هذه الورقة بروتوكول مفصل لدراسة رد ترانسكريبتوميك ميكويديس EC18، سلالة معزولة من اندوسفيري البطاطا، للإفرازات الجذرية البطاطا. مع مساعدة التكنولوجيا التسلسل الفائق الأخيرة، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في عدة أسابيع وإنتاج مجموعات ضخمة. أولاً، نقوم بجمع الإفرازات الجذرية تحت ظروف معقمة، بعد التي يتم إضافتها إلى الثقافات mycoides باء . الجيش الملكي النيبالي من هذه الثقافات معزولة باستخدام أسلوب فينول/كلوروفورم جنبا إلى جنب مع مجموعة تجارية وتخضع لمراقبة الجودة بصك التفريد الآلي. بعد التسلسل، هو إجراء تحليل البيانات مع أنبوب تي ركس المستندة إلى ويب وهو تحديد مجموعة من الجينات الأثران المعرب عنها. هذا الأسلوب أداة مفيدة لتسهيل الاكتشافات الجديدة في الجينات البكتيرية المشتركة في التفاعلات بين الميكروبات والنبات.
Introduction
النباتات قد نضحة تصل إلى 20 في المائة الكربون ثابتة خلال عملية التمثيل الضوئي من خلال الجذور rhizosphere1، أي، منطقة ضيقة من التربة قرب الجذور. نظراً لتوافر المغذيات أعلى، rhizosphere كموئل مناسب للكائنات الدقيقة المتنوعة، بما في ذلك البكتيريا تشجيع نمو النباتات. نتحات الجذر يحتوي على مجموعة من المركبات غير العضوية مثل الأيونات والأحماض غير العضوية والأكسجين والماء. ومع ذلك، معظم الإفرازات الجذرية شكلتها المواد العضوية، والتي يمكن تقسيمها إلى مركبات الوزن الجزيئي المنخفض وارتفاع الوزن الجزيئي المركبات. وتشمل المركبات منخفضة الوزن الجزيئي الأحماض الأمينية والأحماض العضوية والسكريات، والمركبات الفينولية، والأحماض الدهنية ومجموعة واسعة من نواتج الأيض الثانوية. تتكون مركبات عالية الوزن الجزيئي من الصمغ والبروتينات2،3. يمكن استخدام الكائنات المجهرية رهيزوسفيري بعض من هذه المركبات كمصدر للطاقة للنمو والتنمية. الإفرازات الجذرية تلعب دوراً هاما في تشكيل المجتمع رهيزوباكتيريال نظراً للمركبات المنتجة في مصنع في الإفرازات يمكن التأثير على سلوك البكتيريا rhizosphere المرتبطة بالتأثير على الجينات المحددة.
فهم رد بكتيرية على الإفرازات الجذرية خطوة رئيسية في فك رموز آليات التفاعل الميكروبات والنباتات. كما رد البكتيرية للتفاعلات بين الميكروبات والنبات هو نتاج التعبير الجيني التفاضلي، فإنه يمكن دراستها بتحليل الترنسكربيتوم. باستخدام هذا الأسلوب، دراسات سابقة حددت عدة جينات هامة تشارك في التفاعلات بين الميكروبات والنبات. في الزائفة الزّنجاريّة، عرضت الجينات المشتركة في الأيض وانزيمية، والنوع الثاني إفراز الاستجابة بنجر السكر الجذرية نتحات4. مروحة وآخرون. 5 دراسة التنميط ترانسكريبتوميك من FZB42 أميلوليقويفاسينس (ب) استجابة للإفرازات جذر الذرة. وتظهر نتائجها، عدة مجموعات من الجينات بشدة فعل الإفرازات الجذرية، تشارك في الأيضية المتصلة باستخدام المغذيات وانزيمية وحركية والتوليف غير ريبوسومال الببتيدات المضادة للميكروبات و polyketides.
تعتمد دقة هذه الدراسات على جمع الإفرازات الجذرية. على الرغم من أن وصف عدة طرق جمع الإفرازات الجذرية لأغراض مختلفة، أنها تتطلب أدوات متطورة أو لا تتم في ظروف خاضعة للرقابة جيدا6،،من78. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تؤثر الكائنات المجهرية التي تحول دون رهيزوسفيري تكوين الإفرازات الجذرية التي تؤثر على نفاذية غشاء الخلية النباتية وإلحاق الضرر بأنسجة الجذر، لا سيما في حالة اتحادات للكائنات الحية الدقيقة9. عند التحقيق في الاستجابة للميكروبات للإفرازات الجذرية، من المهم استخدام شروط محددة تحديداً جيدا تفاديا لتغيير المركبات بسائر الكائنات الحية الدقيقة10. وعلاوة على ذلك، مطلوب رنا عالية الجودة لتسلسل الحمض النووي الريبي على أساس دراسات الترنسكربيتوم. ومع ذلك، عند التعامل مع السلالات البكتيرية النموذجية غير، البروتوكولات القياسية أو مجموعات تجارية وعادة ما يكون كفاءة منخفضة بسبب عوامل غير معروفة أو خصائص النمو الخاصة.
تم التحقق من البروتوكول بوصفها هنا باستخدام ميكويديس (ب)، وبكتيريا إيجابية، وتشكيل بوغ من الأسرة في اللغات فيرميكوتي. وموجود في كل مكان في رهيزوسفيري من مختلف الأنواع النباتية. قد تم الإبلاغ عن عدة خصائص تشجيع نمو النبات لهذه الأنواع، بما في ذلك تحريض منهجي المقاومة (ISR) في بنجر السكر11، تثبيط التخميد قبالة الممرض بيثيوم لخيار12، فضلا عن النتروجين التثبيت في عباد الشمس رهيزوسفيري13. ومع ذلك، الآليات الجزيئية لتفاعلها مع مصنع لمضيف لم تدرس جيدا.
والهدف من هذه التجارب المقدمة هنا دراسة استجابة ترانسكريبتوميك اندوسفيري-المعزولة ميكويديس باء- للإفرازات الجذرية البطاطا. وباختصار، البروتوكول يتكون من الخطوات التالية: أولاً، جمع الإفرازات الجذرية البطاطس تحت ظروف معقمة. بعد ذلك، استخراج الحمض النووي الريبي عالية الجودة من الخلايا البكتيرية تعامل مع الإفرازات الجذرية. والخطوة الأخيرة تحليل البيانات باستخدام خط أنابيب تي ركس المستندة إلى ويب14. هذا البروتوكول المستخدم لتحديد الجينات ميكويديس (ب) أن تظهر تحولاً في مستويات التعبير عند ملامسة الإفرازات الجذرية، وهكذا قد تلعب دوراً هاما في التفاعلات بين الميكروبات والنبات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الإنبات البطاطا في ظروف معقمة
- أشطف السطح البطاطس مع الماء المعقم. يستحم البطاطا في الإيثانول 70%، ومن ثم في تحت كلوريت الصوديوم 3%، لمدة 5 دقائق. يشطف مرة أخرى بالماء المعقم لإزالة أي تحت كلوريت الصوديوم المتبقية.
- إعداد المواد اللازمة للإنبات ونمو درنات البطاطا؛ تعقيم الأواني البلاستيكية، سلال engraftment، الفيرميكوليت، والمياه بالتعقيم لهم في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: تأكد من أن جميع المواد المستخدمة أوتوكلافابل. وبخلاف ذلك، استخدام طرق التعقيم الأخرى. - وضع البطاطا تعقيم سطح في سلة انجرافتمينت، وهذا في وعاء يعقم المحتوية على الفيرميكوليت الرطب.
- الاحتفاظ الوعاء في دائرة مناخ في 24 درجة مئوية لمدة ثلاثة أسابيع. وضعه على دورات 16 ساعة من الضوء (120 µmol m-2s-1) و 8 ح الظلام. لتجنب التلوث الميكروبي، استخدم مربع ألياف زجاجية كبيرة لتغطية الوعاء.
2-جمع نتحات جذر البطاطا
- عندما تنبت البراعم ونقل تملأ السلة مع البطاطا كله في كوب معقم مع 150 مل من يعقم المياه، مع البطاطا الدرنات توضع فوق سطح الماء والجذور المغمورة في الماء (انظر الشكل 1). الاحتفاظ الشتلات في دائرة المناخ، واستخدام نفس الإعدادات كما كانت من قبل [24 درجة مئوية؛ ودورات 16 ساعة من الضوء (120 µmol m-2s-1)، ح 8 من الظلام].
- من اليوم الثاني في جمع المياه التي تحتوي على الإفرازات، وإعادة ملء كوب ماء منزوع العقيمة. القيام بأخذ عينات كل يوم حتى اليوم السابع بعد نقل الشتلات.
- تخزين كل عينة على حدة عند 4 درجة مئوية. لكل عينة، انتشر 100 ميليلتر في لوريا-بيرتاني (رطل؛ تريبتوني 1%، استخراج الخميرة 0.5%، 0.5% كلوريد الصوديوم) طبق أجار للتحقق من التلوث الميكروبي. تجاهل هذه العينات الملوثة.
- الجمع بين العينات التي تم جمعها من الشتلات واحدة، والتركيز عليها بالتجميد لهم في-40 درجة مئوية إلى وحدة تخزين نهائي من 150 مل.
3-زراعة البكتيريا
- متتالية سلالة mycoides باء من مخزون والغليسيرول-80 درجة مئوية على صفيحة أجار رطل، واحتضان لوحة عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تطعيم وسيلة سائل رطل مع مستعمرة واحدة من اللوحة، وتنمو الثقافة في حاضنة تهز 200 لفة في الدقيقة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
4-العلاج وأخذ عينات من البكتيريا
- لمقارنة منحنى نمو البكتيريا تعامل مع الإفرازات الجذرية لعنصر تحكم سلبية، إعداد مجموعة من قوارير تحتوي على 50 مل من رطل السائلة المتوسطة. إضافة 0.5 مل ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها إلى جميع قوارير، وإضافة 0%، 5%، 10%، أو الإفرازات الجذرية 15% (v/v) أو تعقيم المياه للمتوسط، على التوالي.
- استخدام ثقافة مع المياه بدلاً من الإفرازات الجذرية كعنصر تحكم. قياس الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) كل ح 1 بعد ذلك. إنشاء منحنى نمو برسم القيم600 OD مقابل الوقت.
ملاحظة: لقد رأينا أن 10% الإفرازات الجذرية لم تؤثر على نمو ميكويديس (ب) (انظر الشكل 2)؛ واستخدمت هذه النسبة لتجارب تسلسل الحمض النووي الريبي. - تمييع ثقافة ميكويديس باء- بين عشية وضحاها مع 90 مل المعالجون مسبقاً رطل المتوسطة والتطوير التنظيمي الأولى600 من ~ 0.05 في قارورة 300 مل. أضف 10 مل الإفرازات الجذرية للثقافة واحتضان أنه عند 30 درجة مئوية ح 1.
- تستخدم لعلاج مياه معقمة 10 مل كعنصر تحكم. جمع الخلايا من الثقافة بالطرد المركزي في 9,000 س ز 2 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية، وفورا تجميد بيليه في النتروجين السائل، ثم احفظها في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
5. عزل الحمض النووي الريبي
ملاحظة: قبل البدء العزل، إعداد منضدة ورفوف والماصات عن طريق تنظيف لهم مع حلاً تطهير رناسي (انظر الجدول للمواد). ارتداء القفازات في كل وقت، وتأكد من أن جميع الأنابيب ونصائح وحلول يتم رناسي مجاناً. دائماً تبقى العينات على الجليد عندما يكون ذلك ممكناً.
- إضافة 0.1% (v/v) من ثنائي إثيل بيروكاربوناتي (ديبك) إلى الماء عالي النقاوة (100 ميليلتر من ديبك كل حل 100 مل) ومزجها جيدا، والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. اﻷوتوكﻻف المخلوط لإلغاء تنشيط ديبك بعد العلاج بين عشية وضحاها. استخدم هذا الماء عالي النقاوة معاملة ديبك لإعداد المخزن المؤقت TE [10 ملم تريس-HCl (pH = 8)؛ 1 مم يدتا] وحل الحزب الديمقراطي الصربي (w/v) 10%.
- ذوبان الجليد الكريات الخلية على الجليد وتعليق بعضها في 400 ميليلتر من المخزن المؤقت "الشركة المصرية للاتصالات" (ديبك). تحويل التعليق إلى أنابيب ملولبة 2 مل.
- بريمكس 300 ميليلتر من الكحول كلوروفورم-إيسواميل (24:1 v/v) و 300 ميليلتر من الفينول (حمض الفينول، والجيش الملكي النيبالي الصف)، والسماح الخليط الوقوف لمدة 5 دقائق. تأخذ 500 ميليلتر للمرحلة العليا العضوية إضافة إلى الخلايا ريسوسبينديد. قم بإضافة 50 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10% وز 0.5 من الزجاج الخرز (0.5 ميكرومتر) في الأنبوب.
- قم بإغلاق الغطاء بقوة ووضع الأنبوب في الخالطون طاحونة حبة (انظر الجدول للمواد). القيام تجانس نبض s 3 × 45 مع فاصل زمني 1 دقيقة على الجليد.
- الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقائق في س 11,000 ز (4 درجة مئوية)، ونقل في المرحلة العليا لأنبوب جديد.
- إضافة 500 ميليلتر من الكحول كلوروفورم-إيسواميل (24:1) إلى المرحلة العليا من الخطوة 5.5 والطرد المركزي المخلوط لمدة 5 دقائق في 11,000 س ز (4 درجات مئوية).
ملاحظة: الخطوات التالية تم تعديلها من تعليمات الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الريبي المستندة إلى عامل التصفية الزجاج التجارية الألياف كيت (انظر الجدول للمواد). - نقل 500 ميليلتر للمرحلة العليا لأنبوب جديد وإضافة وحدات التخزين 2 (1 مل) من المخزن المؤقت تحلل/ملزمة وأنها مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
- الجمع بين أنابيب التصفية وجمع (من عدة عزل الحمض النووي الريبي) و "الماصة؛" الخليط من الخطوة 5.7 إلى أنبوب تصفية. الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 15 ثانية بواقع 000 8 × ز وتجاهل التدفق من خلال.
- إعداد 1.5 مل أنابيب ميكروسينتريفوجي مع 100 ميليلتر من الدناز المخزن المؤقت، 10 ميليلتر من الدناز الأول، و 5 ميليلتر للمانع رناسي (انظر الجدول للمواد). إضافة مزيج استعداد الحل في عامل تصفية أنبوب تصفية، واحتضان أنه لمدة 20-30 دقيقة في 15-25 درجة مئوية.
- نفذ الخطوات الغسيل طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة. استخدام 50 ميليلتر من مخزن مؤقت شطف الوتي الجيش الملكي النيبالي.
- حفظ التيد الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية، ووضعت فيلما بارافين بلاستيك حوله. في الوقت نفسه، نقل ميكروليتيرس عدد قليل من العينة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل لإجراء فحص جودة.
6-فحص الجودة الجيش الملكي النيبالي والتسلسل
- راجع الجيش الملكي النيبالي جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي.
ملاحظة: يجب أن تكون نسب امتصاص في 260/280 أعلاه 1.8، وينبغي أن تكون النسب في 260/230 أعلاه على الأقل 1.8، يفضل أن تكون فوق 2.0. - تشغيل مجموعة الجيش الملكي النيبالي المنقاة في صك التفريد مؤتمتة باستخدام تحليل الحمض النووي الريبي التوصية (انظر الجدول للمواد)؛ يجب أن يكون عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) على الأقل فوق 7 المضي قدما.
- استخدم مبلغ إجمالي قدرة 3 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي كل عينة لإنشاء مكتبات إعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي كيت (انظر الجدول للمواد) عقب توصيات الشركة المصنعة.
ملاحظة: الإعداد مكتبة كانت متسلسلة على منصة تسلسل الفائق ويقرأ إقران نهاية تم إنشاؤها.
7-بيانات التحليل باستخدام خط أنابيب المستندة إلى ويب تي-ريكس
- إجراء تصفية الجودة استخدام الإصدار 0.0.13 فاستكس-مجموعة الأدوات (Phred نوعية عشرات > 20). تقليم على ما يلي تسلسل الحمض النووي الريبي الخام من تسلسل محول باستخدام أداة تريموماتيك.
ملاحظة: جميع التحليلات المتلقين للمعلومات التي استندت إلى بيانات نظيفة ذات جودة عالية. - تحميل قاعدة بيانات الجينوم ATCC 6462 نكبي mycoides باء (نكبي الانضمام رقم: CP009692.1) واستخدامها بوصفها جينوم مرجع لرسم الخرائط على ما يلي نظيفة باستخدام Bowtie2/2.2.3.
- استخدام هتسيق v0.6.1 عد الأرقام ما يلي: تعيين لكل الجينات ويقرأ كل كيلوبس للنسخة الواحدة مليون المعينة ما يلي (ربكم) لكل الجينات استناداً إلى طول مدة العد الجينات، وفيما يلي نص معين لهذا الجين.
- لتحليل البيانات بخط الأنابيب تي ركس، استخدم الجدول ربكم كمدخلات، فضلا عن ثلاثة ملفات وصفية: (ط) ملف عوامل لوصف التجربة في العوامل، (ثانيا) ملف تناقضات لتحديد العوامل التي سيتم مقارنة للتعبير الجيني التفاضلي ، و (iii) ملف فئة لوصف مجموعات الجينات للفائدة.
ملاحظة: الملفات وصفية تنسيق in.txt. يمكن العثور على أمثلة في صفحة تي ركس (http://genome2d.molgenrug.nl/). يمكن الاطلاع على تعليمات مفصلة لتحليل البيانات باستخدام تي ركس في منشور سابق بشركة دي يونغ et al. 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة النباتات يمكن أن يؤثر تأثيراً إيجابيا نمو النبات والصحة. ومع ذلك، آليات التفاعلات المعقدة بين النباتات وعلى سيمبيونتس الجرثومية ليست مفهومة تماما. الإفرازات الجذرية تلعب دوراً هاما في تنظيم نشاط رهيزوباكتيريال والسلوك، وعموما هو افترض أن استعمار الجراثيم من الجذور يبدأ مع الجذب للميكروبات للإفرازات الجذرية. وكان الهدف من هذا العمل للتحقيق في رد ترانسكريبتوميك رهيزوباكتيريال ميكويديس للإفرازات الجذرية البطاطا. ولتحقيق هذا، كانت درنات البطاطا سطح تعقيم ونامي في الفيرميكوليت يعقم. ثم جمعت الإفرازات الجذرية كما هو مبين في الشكل 1. بغية استبعاد إمكانية الإفرازات الجذرية التي تؤثر على النمو البكتيري، تصل إلى 15% الإفرازات الجذرية أضيفت إلى ثقافة ميكويديس باء ، وتم الكشف عن أي تغيير في النمو خلال فترة القياس (الشكل 2). وهكذا، التعبير الجيني التغييرات الملاحظة في هذه الدراسة لم تكن المحتمل نتيجة الآثار المتصلة بالنمو.
بعد جمع، وأضيفت الإفرازات الجذرية لثقافة ميكويديس (ب) بنسبة 10% (v/v)، وكان الجيش الملكي النيبالي إجمالي البكتيرية المعزولة كما تم وصفه سابقا. ثم تعرض الجيش الملكي النيبالي لفحص جودة بصك التفريد الآلي الذي يتم إظهار النتائج في الشكل 3. الشكل 3 ألف و 3 باء تمثل الجيش الملكي النيبالي معزولة من ميكويديس باء تعامل مع الإفرازات الجذرية، و الرقم 3 و 3D تمثل الجيش الملكي النيبالي المعزولة من السيطرة على المجموعة. وسجل جميع العينات قيمة رين أعلاه 9 مع شريطين واضحة المقابلة لمفارز الجيش الملكي النيبالي 16S و 23S، مما يدل على أنه تم الحصول على الحمض النووي الريبي عالية الجودة بموجب هذا البروتوكول.
بعد إعداد مكتبة، تم الحصول على زوج-نهاية ما يلي مع منصة تسلسل الفائق. ما يلي تسلسل الحمض النووي الريبي الخام تم اقتطاعها من تسلسل محول وتعيين ضد مرجع تسلسل الجينوم. البيانات الناتجة عن ذلك، وتم إنشاء الجدول ربكم. تم إجراء تحليل الترنسكربيتوم مع أنبوب تي ريكس. ويرد المؤامرة نسبة كثافة جميع الجينات الأثران المعرب عنها في الشكل 4. مقارنة بعنصر تحكم، إضافة البطاطا الجذر نتحات الناجمين عن الجينات 715 الأثران الإعراب عن. من هؤلاء، كانت الجينات 408 upregulated، والجينات 307 دوونريجولاتيد15. التغيير النسبي لبعض الجينات مع التعبير غيرت مسرود في الجدول 1.
رقم 1: خطة عملية لجمع البطاطا جذر نتحات. المواد المستخدمة يعقم ويتم إجراؤها الإنبات في دائرة مناخ. يغسل درنة البطاطس بالماء المعقم، وحمام أنه في ناوكل 2-3% للحد الأدنى 5 حمام في الإيثانول 75% للحد الأدنى 5 آخر مكان البطاطس في سلة يعقم ووضعه في وعاء يحتوي على الفيرميكوليت الرطب. زراعة البطاطس في دائرة مناخ لمدة 3-4 أسابيع ومن ثم نقل السلة مع الشتلة البطاطا إلى كوب. جمع الإفرازات الجذرية كل يوم، وإعادة ملء الكأس بالماء المعقم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: النمو منحنى mycoides باء بتركيزات مختلفة من الإفرازات الجذرية البطاطا. يزرع سلالة EC18 في متوسط LB سائل بالإضافة إلى الإفرازات الجذرية البطاطا أو العقيمة ح2OD سين600 كان يقاس كل ح 1 ورسم مقابل الوقت. إظهار كافة المجموعات نمط نمو مماثل، مشيراً إلى أن تصل إلى 15% إضافة الإفرازات الجذرية له لا آثار كبيرة على نمو ميكويديس (ب) . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: فحص الجودة الجيش الملكي النيبالي بالصك التفريد الآلي. أ و ب تمثل الجيش الملكي النيبالي معزولة من ميكويديس باء تعامل مع الإفرازات الجذرية و C و D تمثل الجيش الملكي النيبالي المعزولة من السيطرة على المجموعة. وتظهر جميع عينات الحمض النووي الريبي شريطين واضحة تناظر 23S والرنا الريباسي 16S وعصابة الرنا الريباسي 5S ضعيفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 4: نسبة كثافة الأرض لتصور التعبير الجيني التفاضلي من تسلسل الحمض النووي الريبي عينات من ميكويديس باء- استجابة للإفرازات الجذرية البطاطا- إنشاء الرقم تلقائياً بواسطة تي ريكس. المحور السيني يمثل مستوى التعبير الجيني، والمحور الصادي يمثل التغيير تحول log2 حظيرة. الجينات حتى-ودوونريجولاتيد تحتوي على قيم نسبة log2 الإيجابية والسلبية. تشير النقاط في منطقة شريطية إلى الجينات التي ليست كبيرة فوق أو تحت عن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| العلامة الجينات | ضفيرة | أمثال التغيير | تعليق توضيحي |
| BG05_RS09165 | + | 3.3 | بروتين افلوكس ت |
| BG05_RS20930 | + | 25.3 | بروتين غشائي |
| BG05_RS10935 | + | 23.3 | المرحلة الثالثة تبوغ البروتين الإعلانية |
| BG05_RS08990 | - | 11.8 | تبوغ البروتين |
| BG05_RS16405 | + | 3.9 | منظم النسخي الأسرة إيكلر |
| BG05_RS24905 | - | 3 | ألفا فرعية synthase التربتوفان |
| BG05_RS24920 | - | 2.3 | synthase اندول-3-والغليسيرول الفوسفات |
| BG05_RS22255 | - | 27 | أسيتولاكتاتي synthase |
| BG05_RS22250 | - | 6.5 | كيتول--حمض ريدوكتويسوميراسي |
| BG05_RS22265 | - | 26.4 | أمينوترانسفيراسي من الأحماض الأمينية متفرعة السلسلة |
| BG05_RS18715 | - | 2.8 | بولولاناسي |
| BG05_RS18040 | + | -9.1 | البروتين إنبات يبب |
| BG05_RS16930 | + | -4.2 | السكر ABC الناقل ملزم ATP البروتين |
| BG05_RS27345 | + | -2.9 | نقل قسم التمويل متناهي الصغر |
| BG05_RS19555 | - | -3.3 | قرش سيلوبيوسي الناقل وحدة فرعية IIB |
| BG05_RS24345 | - | -2.7 | بوتريسسيني مستورد |
| BG05_RS22525 | - | -12.4 | synthase كارديوليبين |
| BG05_RS15225 | - | -3.3 | بروتين غشائي |
| BG05_RS18475 | + | -5.7 | بروتين غشائي |
| BG05_RS19095 | + | -2.1 | البروتين الإنبات |
الجدول 1: قائمة بالجينات الأثران أعرب فريق الإفرازات المعالجة الجذرية بالمقارنة مع عنصر تحكم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التفاعلات بين الميكروبات والنبات وقد تم الافتراض يحدده توازناً دقيقا بين البكتيريا والنباتات. مثل هذه التفاعلات المعقدة للغاية وصعبة للدراسة في نظام طبيعي، التي تضم مختلف الأنواع الميكروبية، يحتمل أن يتصرف كاتحادات. وتصف هذه الورقة بروتوكول مبسط لدراسة رد بكتيرية على الإفرازات الجذرية تحت ظروف خاضعة للرقابة جيدا. صورة الترنسكربيتوم رهيزوباكتيريا، عند التعرض للإفرازات الجذرية، معلومات تفصيلية عن التكيف البكتيرية إلى مكانة رهيزوسفيري. هذا البروتوكول جمع الإفرازات الجذرية لا يتطلب إجراءات معقدة والمعدات المتخصصة. ومع ذلك، يجب أن تنفذ جميع الإجراءات تحت ظروف معقمة تماما وينبغي إدراج عنصر تحكم عقم. نوصي بزراعة عدة درنات البطاطا بالتوازي ونبذ تلك الملوثة. يمكن إجراء تعديلات على هذا البروتوكول إذا كانت تجري دراسة الأنواع النباتية الأخرى. من المهم أن تستخدم أسلوباً مناسباً لتعقيم البذور/الدرنات أي نظراً لأنها قد تختلف في التسامح للمطهرات تطبيقها.
حالما يتم الحصول على الإفرازات الجذرية، يجب أن يكون الجيش الملكي النيبالي عالية الجودة معزولة من الخلايا البكتيرية. مختلف الكواشف والبروتوكولات القياسية التي تستند في المقام الأول الفينول/كلوروفورم أو أسلوب تريزول، هي مضيعة للوقت16. مجموعات تجارية مصممة معظمهم لنموذج الكائنات الحية ولكن أقل تنطبق على الآخرين. هذا البروتوكول عزل الحمض النووي الريبي الذي يجمع بين الأسلوب الفينول/كلوروفورم ومجموعة مواد عزل الحمض النووي الريبي ويتغلب على عيوب هذه الأساليب. وعلاوة على ذلك، خطوة ضرب حبة يتم تضمين مجانسة ميكويديس ب- الخلايا التي عادة تجميعها في ثقافة العوالق. يتم إزالة التلوث المحتملة بالحمض النووي بواسطة حضانة إضافية مع الدناز قبل شطف. ويعني ارتفاع عدد رين عزل الحمض النووي الريبي سليمة. وبالتالي، من هذا البروتوكول لا سيما كفاءة وتوفير الوقت للسلالات البكتيرية البيئية.
بعد تسلسل الحمض النووي الريبي، هو إجراء تحليل البيانات مع تي ركس، خط أنابيب المستندة إلى ويب تحليل إحصائي لتسلسل الحمض النووي الريبي الجينات التعبير البيانات14. هذا الخط سهل الاستعمال، خاصة بالنسبة لعلماء الأحياء دون علم المعلوماتية الحيوية واسعة النطاق. ملف الإدخال الحمض النووي الريبي التعبير مستوى البيانات الخام، مثل ربكم، شظايا كل كيلوبس كل القراءات المعينة مليون (فبكم)، تهم كل القراءات المعينة مليون (CPM)، أو وحدات أخرى التعبير الجيني. يمكن إنشاء هذه الملفات قيمة التعبير الجيني بالأدوات المتاحة بما في ذلك سامتولس17وبيدتولس18و Trex خ ع19. من أجل تشغيل تحليل الحمض النووي الريبي seq، يلزم ثلاثة ملفات الإدخال الأخرى. وتستخدم هذه الملفات لتحديد العوامل التي تصف التجارب و replicates، المقارنات بين شروط تجريبية مختلفة، والمجموعات من الجينات للفائدة. عندما يتم تحميل ملفات الإدخال، عملية التحليل سوف يستغرق سوى بضع دقائق.
يتم سرد عدة جينات ميكويديس EC18، عندما تعامل مع الإفرازات الجذرية، أعرب الأثران في الجدول 1. من بينها، يتم تبديل عدة الجينات ترميز البروتينات الغشاء. المتعلقة بالجينات تبوغ أو خلطات يعبر عن عملية الإنبات. الجينات المشتركة في تبوغ أيضا التغييرات في باء-نجحت عندما شارك مثقف مع شتلات الأرز، نظراً لأن الإفرازات الجذرية إمدادات الطاقة اللازمة للنمو الديناميكي للبكتيريا خلايا18. التعبير المنظم النسخي إيكلر، الذي يرتبط بمقاومة عصيات وتدهور المركبات العطرية في بكتيريا التربة، أوبريجولاتيد. وقد انخفض سلالة حذف إيكلر من رهيزوباكتيريا الكلبسيله الرئوية solubilization الفوسفات المعدنية، بالمقارنة مع السلالة البرية من نوع19. يتم تحفيز الجينات عدة تتعلق باستقلاب الأحماض الأمينية والتوليف، بينما الجينات المعنية بالنقل السكر بما في ذلك نقل النقاط سيلوبيوسي دوونريجولاتيد. وهذا يوحي بأن السلالة EC18 قد يكون تفضيل ايضية للأحماض الأمينية على السكريات في رهيزوسفيري. وظيفة الجينات المتغيرة يمكن أن يكون كذلك درس في الموقع بجعل طفرات خروج المغلوب أو أوفيريكسبريشن. وباختصار، يتيح البروتوكول الموصوفة هنا تعريف سريع لعدد كبير من الجينات البكتيرية التي قد تكون هامة تشارك في التفاعلات بين الميكروبات والنبات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونشكر السيد جاكوب Viel على تعليقات مفيدة واقتراحاته. ونشكر أيضا أن دي يونغ لمساعدته في تحليل المعلومات البيولوجية. يي يانجلي ولي زهيبو معتمدة من مجلس المنح الدراسية الصيني (CSC). ونحن نشكر جمعية البحث العلمي الهولندية-شركة TTW بيرسبيكتيف Back2Roots غاب (TKI-AF-15510) لتقديم الدعم المالي إلى OPK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
- Haichar, F. eZ., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
