Summary
여기에 제시 된 프로토콜의 목표 endosphere 절연 균 mycoides 의 감자 루트 exudates에 transcriptomic 반응을 것입니다. 이 메서드는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 중요 한 세균 유전자의 식별을 용이 하 게 하 고 원칙적으로 다른 endophytes 및 식물, 사소한 조정에 적용.
Abstract
유익한 식물 관련 박테리아 성장을 촉진 하 고 식물에 질병을 방지에 중요 한 역할. Biofertilizers 또는 biocontrol 대리인으로 식물 성장을 승진 시키는 rhizobacteria (PGPR)의 응용 프로그램 기존의 비료의 사용에 효과적인 대안이 되 고 저렴 한 비용에 작물 생산성을 높일 수 있습니다. 식물-미생물 상호작용 호스트 공장 분 비 신호 및 그들의 관련 된 박테리아에 의해 hereon 반응에 의존. 그러나 어떻게 유익한 박테리아의 분자 메커니즘 응답 그들의 관련 된 식물 유래 신호는 완전히 이해 되지 않습니다. 루트 exudates 박테리아의 transcriptomic 반응 평가 세균성 유전자 발현 rhizospheric 조건 하에서 규제를 결정 하는 강력한 접근 이다. 이러한 정보는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 근본적인 메커니즘을 이해 하는 데 필요한 있습니다. 이 종이 transcriptomic 반응을 B. mycoides EC18, 감자 루트 exudates 감자 endosphere에서 격리 하는 긴장의 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 최근 높은 처리량 시퀀싱 기술의 도움으로,이 프로토콜은 몇 주 및 생산 대규모 데이터 집합에서 수행할 수 있습니다. 먼저, 루트 exudates B. mycoides 문화에 추가 되는 무 균 조건 하에서 수집 합니다. 이러한 문화에서 RNA는 상용 키트와 결합 하 고 자동화 된 전기 악기에 의해 품질 관리 대상이 페 놀/클로 프롬 방법을 사용 하 여 격리 됩니다. 시퀀싱, 데이터 분석 수행 됩니다 웹 기반 T-렉스 파이프라인 차동 표현한 유전자의 그룹을 식별 하는 후에. 이 방법은 세균 유전자 식물-미생물 상호작용에 관련 된 새로운 발견을 촉진 하는 유용한 도구입니다.
Introduction
식물 exudate rhizosphere1, 즉, 뿌리 근처 토양의 좁은 영역에 뿌리를 통해 광합성 동안 고정 탄소의 최대 20% 수 있습니다. 더 높은 영양소 여부는 rhizosphere은 식물 성장을 승진 시키는 박테리아를 포함 하 여 다양 한 미생물에 대 한 적당 한 서식 지. 루트 exudates 이온, 무기 산, 산소, 물 같은 무기 화합물의 범위를 포함합니다. 그러나, 대부분의 루트 exudates 화합물 저 분자 무게 화합물 및 고분자 중량으로 분할 될 수 있다 유기 물질에 의해 형성 된다. 저 분자 무게 화합물 아미노산, 유기 산, 설탕, 페 놀 화합물, 지방산 및 2 차 대사 산물의 배열을 포함합니다. 점액과 단백질2,3높은 분자 무게 화합물에 의하여 이루어져 있다. Rhizosphere 미생물 에너지 원으로 성장 및 개발에 대 한 이러한 화합물 중 일부를 사용할 수 있습니다. 루트 exudates 이후는 exudates에서 공장 생산 화합물 영향을 미칠 수 rhizosphere 관련 된 박테리아의 동작에 영향을 주는 특정 유전자의 표현에 의해 rhizobacterial 커뮤니티 형성에 중요 한 역할을.
루트 exudates에 세균성 응답을 이해 해독 식물-미생물 상호작용 메커니즘에서 중요 한 단계입니다. 식물-미생물 상호작용에 세균성 응답 차동 유전자 발현의 제품으로, transcriptome 분석에 의해 공부 될 수 있다. 이 메서드를 사용 하 여 이전 연구 식물-미생물 상호작용에 관련 된 몇 가지 중요 한 유전자를 확인. 녹 농 균, 신진 대사, chemotaxis, 유형 II 분 비에 관여 하는 유전자 사탕 루트 exudates4에 응답을 표시 했다. 팬 외. 5 옥수수 루트 exudates 응답에 B. amyloliquefaciens FZB42의 프로 파일링 transcriptomic 공부. 그들의 결과, 강하게 루트 exudates에 의해 유도 된 유전자의 몇몇 그룹에에서 관련 영양소 사용률, chemotaxis, 운동 성, 및 항균 성 펩 티 드와 polyketides의 비 ribosomal 합성 대사 경로 보여 줍니다.
이러한 연구의 정확도 루트 exudates 컬렉션에 의존합니다. 여러 가지 방법을 서로 다른 목적을 위해 루트 exudates의 컬렉션을 설명 했으며, 비록 그들은 정교한 악기를 요구 하거나 잘 제어 조건6,,78수행 되지 않습니다. 또한, rhizosphere 억제 미생물 수 영향 루트 exudate 구성 식물 세포 막 침투성에 영향을 미치는 미생물9의 컨소시엄의 경우 특히 루트 조직 손상. 루트 exudates에 미생물 반응 조사, 다른 미생물10화합물의 피하기 위하여 잘 정의 된 조건을 사용 하 여 중요 하다. 또한, 높은-품질 RNA가 RNA-seq transcriptome 연구 기반을 위한 필요 합니다. 그러나, 비 모델 세균성 긴장 처리, 표준 프로토콜 또는 상업 키트 보통 있다 알 수 없는 요인 또는 특별 한 성장 특성으로 인해 낮은 효율성.
여기에 설명 된 프로토콜 사용 하 여 B. mycoidesFirmicute 문의 그람 양성, 포자 형성 박테리아를 확인 했습니다. 그것은 다양 한 식물 종의 rhizosphere에 유비 쿼터 스입니다. 여러 식물 성장 촉진 특성 사탕11, 감쇠 떨어져 병원 체의 Pythium 질소로 서 오이12, 억제에에서 체계적인 저항 (ISR)의 유도 포함 한이 종에 대 한 보고 해바라기 rhizosphere13에 고정입니다. 그러나, 호스트 플랜트와의 상호 작용의 분자 메커니즘은 잘 공부 하지.
여기에 제시 된 실험의 목적은 감자 루트 exudates에 endosphere 절연 B. mycoides 의 transcriptomic 반응을 것입니다. 즉, 프로토콜은 다음 단계로 구성 됩니다: 첫째, 메 마른 조건 하에서 감자 루트 exudates 수집. 그런 다음, 루트 exudates 치료 세균 세포에서 높은-품질 RNA를 추출 합니다. 마지막 단계는 T-렉스 웹 기반 파이프라인14를 사용 하 여 데이터 분석. 이 프로토콜 루트 exudates와 접촉 시 식 수준에 변화를 표시 하 고 따라서 식물-미생물 상호작용에 중요 한 역할을 재생 있습니다 B. mycoides 유전자를 식별 하기 위해 사용 되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 출 감자 멸 균된 조건에서
- 감자 표면 살 균 물으로 린스. 그리고 5 분 동안 3% 염소에 70% 에탄올에 감자를 목욕. 다시 모든 나머지 염소 제거 살 균 물으로 린스.
- 출 아 하 고 감자 괴 경; 성장에 필요한 자료를 준비 플라스틱 냄비, engraftment 바구니, 질 석, 소독 하 고 20 분 동안 121 ° C에서 그들 압력가 마로 소독 하 여 물.
참고: 사용 되는 모든 재료 멸 인지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 다른 살 균 방법을 사용 합니다. - 표면 살 균 된 감자를 engraftment 바구니에 넣고 젖은 질 석 포함 하는 압력가 마로 소독 냄비에 배치.
- 3 주 동안 24 ° C에서 기후 챔버에 냄비 유지. 빛 (120 µmol m-2의-1)와 어둠의 8 h 16 h의 사이클에 그것을 설정 합니다. 미생물 오염을 방지 하려면 냄비를 커버 하는 대형 유리 섬유 상자를 사용 합니다.
2. 감자 루트 Exudates 수집
- 새싹 새싹, 전송 압력가 이온된 물 150 mL 소독된 비 커에 전체 감자 바구니 가득 때 감자와 함께 물 표면과 뿌리 바로 위에 배치 tubers는 물에 잠긴 ( 그림 1참조). 기후 챔버에는 종묘를 유지 하 고 동일한 설정을 사용 하기 전에 [24 ° C, 16 h 빛 (120 µmol m-2의-1), 8h 어둠의의].
- 두 번째 날부터 exudates를 포함 하는 물을 수집 하 고 살 균 이온을 제거 된 물으로 비 커를 리필. 샘플링을 수행 매일 묘 종 전송 후 7 일까지.
- 4 ° c.에서 별도로 각 샘플 저장 각 샘플에 대 한 확산에 Luria Bertani 100 µ L (파운드, 1 %tryptone, 0.5% 효 모 추출 물, 0.5 %NaCl) 천 배지 미생물 오염에 대 한 확인. 오염 된 샘플을 삭제 합니다.
- 1 종묘의 수집 된 샘플을 결합 하 고-40 ° C ~ 150 mL의 최종 볼륨에서 그들을 freeze-drying에 의해 그들을 집중.
3. 성장 하는 박테리아
- B. mycoides 스트레인 파운드 한 천 격판덮개에-80 ° C 글리세롤 재고에서 행진 하 고 하룻밤 30 ° C에서 접시를 품 어.
- 접시에서 단일 식민지와 파운드 액체 매체를 접종 하 고 하룻밤 30 ° c.에서 200 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 문화를 성장
4. 치료 및 박테리아의 샘플링
- 루트 exudates 부정적인 제어를 치료 하는 박테리아의 성장 곡선 비교를 파운드 액체 매체의 50 mL를 포함 하는 플라스 크의 시리즈를 준비 합니다. 모든 플라스 크에 하룻밤 세균성 문화의 0.5 mL을 추가 하 고 중간, 0%, 5%, 10% 또는 15% (v/v) 루트 exudate 또는 살 균 이온된 수를 각각 추가.
- 루트 exudates 대신 이온 물 문화를 사용 하 여 컨트롤. 600에서 광학 밀도 측정 nm (OD600) 마다 1 시간 이후에. 시간 대 세600 값을 그려서 성장 곡선을 생성 합니다.
참고: 우리는 루트 exudates의 10% B. mycoides 의 성장에는 영향을 미치지 않았다 보았다 ( 그림 2참조). 이 비율은 RNA-seq 실험을 위해 사용 되었다. - 희석의 초기 세600 미리 따뜻하게 파운드 매체의 90 mL와 함께 하룻밤 B. mycoides 문화 ~ 300 mL 플라스 크에 0.05. 문화에 루트 exudates의 10 mL를 추가 하 고 1 시간에 30 ° C에서 품 어.
- 10 mL 살 균 이온된 수 치료를 사용 하 여 컨트롤. 4 ° c.에 2 분 동안 9000 x g에서 원심 분리 하 여 문화에서 세포를 수집 상쾌한, 삭제 즉시 액체 질소에는 펠 릿을 동결 다음 사용까지-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.
5. RNA 격리
참고: 시작 하기 전에 격리, 작업 대, 선반, 및 펫 정리 하 여 준비 그들 RNase 오염 제거 솔루션 ( 재료의 표참조). 모든 시간에 장갑을 착용 하 고 모든 튜브, 팁 및 솔루션은 RNase 무료 다는 것을 확인 한다. 가능 하면 얼음에 샘플 항상 유지.
- 초순 수 (100 µ L DEPC의 100 mL 해결책 당)에 diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 0.1% (v/v)을 추가 하 고 잘 섞어 하룻밤 실 온에서 보관. 압력솥 혼합물 하룻밤 치료 후는 DEPC를 비활성화. 이 DEPC 처리 초순 준비 테 버퍼를 사용 하 여 [10 mM Tris HCl (pH = 8), 1 mM EDTA] 10 %SDS (w/v) 솔루션.
- 얼음에 셀 펠 릿을 녹여 고 테 (DEPC) 버퍼의 400 µ L에서 각각 일시 중단. 2 mL 스크류 캡 튜브에 정지를 전송 합니다.
- 5 분 동안 서 서 혼합물을 허용 그리고 섞은 300 µ L의 클로 프롬 isoamyl 알콜 (24:1 v/v) 및 (산 페 놀, RNA 등급), 페 놀의 300 µ L Resuspended 셀에 추가 하려면 유기 상위 단계의 500 µ L를 가져가 라. 튜브에 10 %SDS와 유리 구슬 (0.5 µ m)의 0.5 g 50 µ L를 추가 합니다.
- 모자를 단단히 닫고 비드 밀 균질 화기에 튜브를 배치 ( 재료의 표참조). 얼음에 1 분 간격으로 3 × 45의 펄스 균질 화를 수행 합니다.
- 샘플 11000 x g (4 ° C)에서 10 분 원심 하 고 새 튜브를 위 단계를 전송.
- 5.5 단계에서 상위 단계로 클로 프롬 isoamyl 알콜 (24:1)의 500 µ L을 추가 하 고 11000 x g (4 ° C)에서 5 분을 위한 혼합물을 원심.
참고: 다음 단계는 상업적인 유리 섬유 필터 기반 RNA 격리의 제조 업체의 지시에서 수정 된 키트 ( 재료의 표참조). - 신선한 튜브를 상위 단계의 500 µ L을 전송 세포/바인딩 버퍼의 2 권 (1 mL)을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 혼합.
- (에서 RNA 격리 kit) 필터 및 컬렉션 튜브를 결합 하 고 필터 튜브를 단계 5.7에서에서 혼합물을 플라스틱. 원심 튜브 15 g와 흐름을 통해 삭제 x 8000에서 s.
- 100 µ L DNase 버퍼, DNase의 10 µ L의 microcentrifuge 튜브 1.5 mL를 준비, 그리고 5 µ L의 RNase 억제제 ( 재료의 표참조). 필터 튜브의 필터에 준비 솔루션 믹스를 추가 하 고 15-25 ° c.에 20-30 분 동안 품 어
- 제조업체의 지시에 따라 세척 단계를 수행 합니다. 차입 버퍼의 50 µ L를 사용 하 여 RNA elute.
- -80 ° C에서 eluted RNA를 저장 하 고 그것의 주위에 플라스틱 파라핀 영화를 넣어. 동시에 품질 검사를 수행 하는 1.5 mL microcentrifuge 튜브 샘플의 약간 microliters 전송.
6. RNA 품질 확인 및 시퀀싱
- Microvolume 분 광 광도 계와 RNA를 확인 하십시오.
참고: 260/280에서 흡 광도 비율 1.8 이상 이어야 합니다 그리고 비율 260/230에서 적어도 1.8, 2.0 이상 선호 이상 이어야 합니다. - 실행 권장 RNA 분석을 사용 하 여 자동화 된 전기 이동 법 악기에서 정화 RNA 키트 ( 재료의 표참조); RNA 무결성 번호 (린) 진행 7 위 이상 이어야 합니다.
- 샘플 당 RNA의 3 µ g의 총 금액을 사용 하 여 RNA-Seq 라이브러리 준비 라이브러리 생성 키트 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 권장 사항에 따라.
참고: 라이브러리 준비는 높은 처리량 시퀀싱 플랫폼에서 시퀀싱 했다 고 쌍 간 읽기 생성 했다.
7. 데이터 분석 웹 기반 파이프라인 T-렉스를 사용 하 여
- 버전 0.0.13 FASTX-도구 키트를 사용 하 여 필터링 품질 (> 20 Phred 품질 평가 점수). Trimmomatic 도구 어댑터 시퀀스에서 원시 RNA-Seq 읽기 트림.
참고: 모든 다운스트림 분석은 고품질을 가진 깨끗 한 데이터에 근거 했다. - B. mycoides ATCC 6462 NCBI 게놈 데이터베이스 다운로드 (NCBI 승인 번호: CP009692.1) 및 Bowtie2/2.2.3를 사용 하 여 깨끗 한 읽기를 매핑하기 위한 참조 게놈으로 그것을 사용.
- 읽기 숫자 계산을 사용 하 여 HTSeq v0.6.1 각 유전자에 매핑되고 각 유전자의 백만 매핑된 읽기 (RPKM) 당 대 본의 kilobase 당 읽기가이 유전자에 매핑된 유전자와 읽기의 길이에 따라.
- T-렉스 파이프라인에 의해 데이터의 분석을 위해 입력, 뿐만 아니라 3 개의 설명 파일 RPKM 테이블 사용: (i) (ii) 어떤 요소가 차동 유전자 발현에 대 한 비교를 정의 하기 위해 대조 파일 요인에 실험을 설명 하기 위해 요인 파일 그리고 (iii) 관심사의 유전자의 그룹을 설명 하는 클래스 파일.
참고: 설명 파일은 in.txt 형식입니다. 예는 T-렉스 (http://genome2d.molgenrug.nl/)의 웹 페이지에서 찾을 수 있습니다. T-렉스를 사용 하 여 데이터 분석에 대 한 자세한 지침 드 종 외. 여 이전 간행물에서 찾을 수 있습니다. 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
식물 관련 미생물 긍정적으로 식물의 성장과 건강에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 식물과 그들의 미생물 symbionts 사이 복잡 한 상호 작용의 메커니즘 완전히 이해 되지 않는다. 루트 exudates rhizobacterial 활동 및 행동 조절에 중요 한 역할 그리고 그것은 일반적으로 가정 하는 뿌리의 미생물 식민지 루트 exudates 미생물의 매력으로 시작. 이 작품의 목표에 감자 루트 exudates B. mycoides rhizobacterial의 transcriptomic 응답을 조사 했다. 이 행, 감자 괴 경 표면 소독 하 고 압력가 vermiculite에 출 아 했다 했다. 다음 그림 1과 같이 루트 exudates 수집 했다. 최대 세균성 성장에 영향을 미치는 루트 exudates의 가능성을 배제 하기 위해 루트 exudates의 15% B. mycoides 문화에 추가 했다 고 성장에 아무런 변화가 없습니다 (그림 2) 측정 시간 동안 검색 되었습니다. 따라서,이 연구에서 관찰 된 유전자 식 변화 성장 관련 효과 의해 가능성이 발생 하지 했다.
수령 후, 루트 exudates 10% 비율 (v/v), B. mycoides 문화에 추가 하 고 세균 총 RNA 격리는 앞에서 설명한. RNA는 다음 자동된 전기 악기의 결과 그림 3에 표시 됩니다 의해 품질 검사를 받게 됩니다. 그림 3A 와 3B B. mycoides 루트 exudates 치료에서 격리 하는 RNA와 그림 3C 와 3D 컨트롤 그룹에서 격리 하는 RNA를 대표 합니다. 모든 샘플에 해당 하는 16와 23S RNA 소 단위, 높은-품질 RNA이이 프로토콜에 의해 얻은 것을 보여주는 2 개의 명확한 밴드와 함께 9 위 린 값을 이뤘다.
라이브러리 준비 후 쌍 간 읽기 높은 처리량 시퀀싱 플랫폼으로 획득 했다. 원시 RNA-Seq 읽기 어댑터 시퀀스에서 손질 되었고 참조 게놈 시퀀스에 대 한 매핑됩니다. 결과 데이터의 RPKM 테이블 생성 되었습니다. T-렉스 파이프라인 transcriptome 분석 수행 했다. 모든 차동 표현한 유전자의 비율 강도 플롯은 그림 4에 표시 됩니다. 컨트롤에 비해 감자 루트 exudates 추가 표현 차동 수 715 유전자 유도. 그 중, 408 유전자 upregulated, 되었고 307 유전자 downregulated15했다. 변경된 식으로 유전자 들의 상대적인 변화는 표 1에 나열 됩니다.
그림 1: 감자 루트 exudates 컬렉션의 프로세스 구조. 사용 되는 재료는 압력가 마로 소독 하 고 발 아 기후 챔버에 수행 됩니다. 감자 괴 경 멸 균된 물으로 세척 하 고 5 분 목욕 그것은 또 다른 5 분 장소에 대 한 75% 에탄올에 감자는 압력가 마로 소독 바구니에 고 젖은 질 석 포함 하는 냄비에 넣어 2-3 %NaOCl 목욕. 3-4 주, 기후 상공 회의소에서 감자를 성장 하 고 비 커에 감자 종묘와 바구니를 전송. 수집 루트 exudates 매일 하 고 소독된 물으로 비 커를 리필. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2:는 성장 곡선의 B. mycoides 감자 루트 exudates의 다른 농도 함께. 변형 EC18 감자 루트 exudates의 추가 함께 액체 LB 매체에 성장 했다 또는 살 균 H2o. OD600 매 1 시간 측정 되었고 플롯 시간에 대. 모든 그룹 표시 비슷한 성장 패턴을 나타내는 루트 exudates 추가의 15%는 B. mycoides 성장에 중요 한 효과 없이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 자동된 전기 악기에 의해 RNA 품질 체크. A 와 B 대표 B. mycoides 에서 격리 하는 RNA 치료 루트 exudates 및 C 와 D 대표 컨트롤 그룹에서 격리 하는 RNA. 모든 RNA 샘플 해당 23S 16S rRNA와 약한 5S rRNA 밴드 하 두 분명 밴드를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 감자 루트 exudates 응답에 B. mycoides 의 RNA seq 샘플의 차동 유전자 발현을 시각화에 대 한 비율 강도 플롯. 그림은 T-렉스에 의해 자동으로 생성 됩니다. X 축 진 식 수준 나타내고 y 축은 log2 변형 배 변화를 나타냅니다. 업 및 downregulated 유전자는 긍정적이 고 부정적인 log2 비율 값. 줄무늬 지역에 점 상당히 이상-또는 아래-표현 되지 않는 유전자를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 유전자 태그 | 스트랜드 | 배 변경 | 주석 |
| BG05_RS09165 | + | 3.3 | multidrug 경과 단백질 |
| BG05_RS20930 | + | 25.3 | 막 단백질 |
| BG05_RS10935 | + | 23.3 | 단계 III 포자 형성 단백질 광고 |
| BG05_RS08990 | - | 11.8 | 포자 형성 단백질 |
| BG05_RS16405 | + | 3.9 | IclR 가족 transcriptional 레 귤 레이 터 |
| BG05_RS24905 | - | 3 | 트립토판 synthase 소 단위 알파 |
| BG05_RS24920 | - | 2.3 | indole-3-글리세롤 인산 염 synthase |
| BG05_RS22255 | - | 27 | acetolactate synthase |
| BG05_RS22250 | - | 6.5 | ketol 산 reductoisomerase |
| BG05_RS22265 | - | 26.4 | 측 쇄 사슬 아미노산 aminotransferase |
| BG05_RS18715 | - | 2.8 | pullulanase |
| BG05_RS18040 | + | -9.1 | 발 아 단백질 YpeB |
| BG05_RS16930 | + | -4.2 | ABC 운송업 자 ATP 의무적인 단백질 설탕 |
| BG05_RS27345 | + | -2.9 | MFS 전송 |
| BG05_RS19555 | - | -3.3 | PTS cellobiose 운송업 자 소 단위 IIB |
| BG05_RS24345 | - | -2.7 | putrescine 가져오기 |
| BG05_RS22525 | - | -12.4 | cardiolipin synthase |
| BG05_RS15225 | - | -3.3 | 막 단백질 |
| BG05_RS18475 | + | -5.7 | 막 단백질 |
| BG05_RS19095 | + | -2.1 | 발 아 단백질 |
표 1: 컨트롤에 비해 루트 exudates 대우 그룹의 차동 표현한 유전자의 목록입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
식물-미생물 상호작용 박테리아와 식물 사이 가늘게 조정된 평형에 의해 결정 될 가설 되어 있다. 이러한 상호 작용은 매우 복잡 하 고 공부 하기 어려운 자연 시스템에는 구성 다양 한 미생물 종, 잠재적으로 컨소시엄의 역할. 이 문서는 잘 제어 된 조건 하에서 루트 exudates에 세균성 응답을 공부 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. Rhizobacteria, 루트 exudates에 노출 시의 transcriptome 프로필 rhizosphere 틈새에 세균 적응에 자세한 정보를 제공합니다. 이 루트 exudates 컬렉션 프로토콜은 복잡 한 절차와 특수 장비를 필요로 하지 않습니다. 그러나, 엄격 하 게 메 마른 조건 하에서 모든 절차를 실시 해야 합니다 그리고 불 임의 컨트롤 포함 되어야 합니다. 병렬로 여러 감자 괴 경은 성장 하 고 오염 된 것 들을 버리는 것이 좋습니다. 수정 다른 식물 종의 공부 되 고 있다 하는 경우이 프로토콜을 만들 수 있습니다. 그것은 적절 한 메서드를 사용 하 여 공차를 적용 하는 소독 제에 다를 수 있습니다 그들은 때문에 어떤 씨앗/tubers을 소독 해야 합니다.
일단 루트 exudates 가져온 세균 세포에서 높은-품질 RNA 격리 되어야 합니다. 다양 한 시 약 및 표준 프로토콜을 주로 기반으로 페 놀/클로 프롬 또는 TRIzol 메서드는 시간이 많이 걸리는16. 상업적인 장비는 주로 모델 생물을 위한 하지만 덜 다른 사람에 게 적용 됩니다. 페 놀/클로 프롬 및 RNA 격리 키트를 결합 하 여 RNA 격리 프로토콜이이 방법의 단점을 극복 했다. 또한, 비드 박동 단계 균질 planktonic 문화에서 일반적으로 집계 하는 B. mycoides 셀 포함 됩니다. 잠재적인 DNA 오염 이전에 차입 DNase 가진 여분의 외피에 의해 제거 됩니다. 높은 린 번호 그대로 RNA의 격리를 의미합니다. 따라서,이 프로토콜은 특히 효율적이 고 환경 박테리아 변종에 대 한 시간을 절약.
후에 RNA 시퀀싱 데이터 분석 T-렉스, RNA-seq 유전자 표현 데이터14에 대 한 웹 기반 통계 분석 파이프라인으로 수행 됩니다. 이 파이프라인은 특히 광범위 한 생물 정보학 지식 없이 생물학에 대 한 사용자 친화적입니다. 입력된 파일은 원시 RNA 식 수준 데이터, RPKM, 같은 조각 당 백만 매핑된 읽기 (FPKM), kilobase 당 백만 매핑된 읽기 (CPM), 또는 다른 유전자 표현 단위 당 수 있습니다. 이러한 유전자 식 값 파일 SAMtools17,18, BEDtools 그리고 NGS Trex19를 포함 하 여 사용 가능한 도구 생성 될 수 있습니다. RNA-seq 분석 실행, 다른 3 개의 입력된 파일이 필요 합니다. 이러한 파일은 실험과는 복제, 다양 한 실험 조건, 관심사의 유전자의 그룹 사이의 비교를 설명 하는 요소를 정의 하는 데 사용 됩니다. 때 입력된 파일 업로드, 분석 과정만 몇 분을 소요 됩니다.
B. mycoides EC18, 루트 exudates로 치료 하면의 여러 차동 표현한 유전자는 표 1에 나열 됩니다. 그 중, 막 단백질 인코딩 여러 유전자의 표현을 변경 됩니다. 유전자는 포자 형성에 관련 된 또는 발 아 과정 차동 표현 됩니다. 포자 형성에 관련 된 유전자의 표현 또한 B. subtilis 변경 때 루트 exudates 박테리아의 동적 성장18세포에 필요한 에너지를 공급 하기 때문에 쌀 묘와 공동 경작. multidrug 저항 및 토양 박테리아에 향기로운 화합물의 저하와 관련, IclR transcriptional 규칙의 식은 upregulated입니다. Rhizobacteria Klebsiella 균 의 IclR 삭제 변형 미네랄 인산 가용 화, 야생-타입 스트레인19에 비해 감소 했다. 아미노산 물질 대사 및 합성에 관련 된 여러 유전자 cellobiose 점 전송기를 포함 하 여 설탕 전송에 관련 된 유전자는 downregulated 자극 된다. 이것은 그 부담 EC18는 rhizosphere에 설탕에 아미노산 대사 기본 설정을 할 수 있습니다. 변경 된 유전자의 기능은 녹아웃 또는 overexpression 돌연변이 하 여 공부 현장에 추가 될 수 있습니다. 요약 하자면, 여기에 설명 된 프로토콜의 잠재적으로 중요 한 세균 유전자 식물-미생물 상호작용에 관련 된 많은 수의 빠른 식별 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 그의 도움이 의견 및 제안에 대 한 제이콥 재를 감사합니다. 우리는 또한 생물 정보학 분석에 그의 도움에 대 한 앤 데 종 감사합니다. Yanglei 이순신 Zhibo Li 중국 장학금 위원회 (CSC)에 의해 지원 됩니다. 우리 감사 NWO TTW Perspectief 전문 직원 Back2Roots (TKI-AF-15510) OPK에 그들의 재정 지원에 대 한.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
- Haichar, F. eZ., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
