Summary
Burada sunulan Protokolü amacı endosphere izole Bacillus mycoides transcriptomic yanıt patates kök exudates için incelemektir. Bu yöntem önemli bakteriyel genler bitki-mikrop etkileşimlerde yer tanımlamasını kolaylaştırır ve prensip olarak diğer endophytes ve bitkilerle küçük ayarlamalar için geçerli olduğunu.
Abstract
Yararlı bitki ilişkili bakterilerin büyüme teşvik ve bitkilerde hastalık önleme önemli bir rol oynamaktadır. Bitki büyüme teşvik rhizobacteria (PGPR) uygulama biofertilizers veya biyolojik ajanlar olarak geleneksel gübre kullanımı için etkili bir alternatif haline gelmiştir ve düşük maliyetle ürün verimliliği artırabilir. Bitki-mikrop etkileşimler ana bitki salgılanan sinyalleri ve onların ilişkili bakteriler tarafından bu andan bir tepki bağlıdır. Ancak, nasıl yararlı bakteriler moleküler mekanizmaları için bunların ilişkili bitki kaynaklı sinyalleri tam olarak anlaşılamamıştır yanıt. Kök exudates bakteri transcriptomic yanıtı değerlendirirken bakteri gen ekspresyonu ve yönetmelik rhizospheric koşullar altında belirlemek için güçlü bir yaklaşımdır. Böyle bir bilgiye temel mekanizmaları bitki-mikrop etkileşimleri dahil anlamak gereklidir. Bu kağıt B. mycoides EC18, patates endosphere patates kök exudates için izole bir yük transcriptomic yanıt çalışmaya detaylı bir protokolünü açıklar. Son yüksek üretilen iş sıralama teknolojisi sayesinde, bu iletişim kuralı birkaç hafta ve üretmek büyük veri kümeleri olarak gerçekleştirilebilir. İlk olarak, kök exudates sonra bunlar B. mycoides kültürler için eklenir steril koşullarda topluyoruz. Bu kültürlerden RNA ticari bir kit ile kombine ve kalite kontrol için otomatik Elektroforez enstrüman tarafından tabi fenol/kloroform yöntemini kullanarak ayrı tutulur. Sonra sıralama, veri analizi T-REx örümcek ağı-esaslı boru hattı ile gerçekleştirilir ve bir grup differentially ifade genlerin tanımlanır. Bu yöntem bakteriyel genler bitki-mikrop etkileşimlerde yer üzerinde yeni keşifler kolaylaştırmak için yararlı bir araçtır.
Introduction
Bitkiler fotosentez kökleri aracılığıyla sırasında sabit rizosferde1, yani, toprak kökleri yakınındaki dar bölge içine karbon % 20'e kadar çıktı olabilir. Daha yüksek besin durumu nedeniyle, rizosferde bitki büyüme teşvik bakteriler de dahil olmak üzere çeşitli mikroorganizmalar için uygun bir yaşam alanı olduğunu. Kök exudates inorganik bileşikler iyonları, İnorganik asitler, oksijen ve su gibi bir dizi içerir. Ancak, kök exudates çoğunluğu düşük moleküler ağırlıklı bileşikler ve yüksek moleküler ağırlıklı bileşikler ayrılabilir organik maddeler tarafından oluşturulur. Düşük moleküler ağırlıklı bileşikler amino asitleri, organik asitler, şekerler, fenolik bileşikler, yağ asitleri ve sekonder metabolitler bir dizi içerir. Yüksek molekül ağırlıklı bileşikler zamk ve proteinler2,3/ oluşur. Rizosferde mikroorganizmaların bu bileşiklerin bazıları büyüme ve gelişme için bir enerji kaynağı olarak kullanabilirsiniz. Kök exudates exudates bitki üretilen bileşikler belirli genlerin ifade etkileyen bakteriler rizosferde ilişkili davranışını etkileyebilir beri rhizobacterial topluluk şekillenmesinde önemli bir rol oynamaktadır.
Bakteriyel yanıt-e doğru kök exudates anlama bitki-mikrop etkileşim mekanizmaları deşifre önemli bir adımdır. Bakteriyel yanıt-e doğru bitki-mikrop etkileşimleri farklı gen ekspresyonu ürün olduğu için transcriptome analizi ile okudu olabilir. Bu yöntemi kullanarak, önceki çalışmalarda birkaç önemli genler bitki-mikrop etkileşimlerde yer tespit edilmiştir. Pseudomonas aeruginosaiçinde genlerin metabolizma, kemotaksis ve tip II salgı şeker pancarı kök exudates4' e cevap gösterilmiştir. Fan ve ark. 5 yanıt olarak Mısır kök exudates B. amyloliquefaciens FZB42 transcriptomic profilleme okudu. Güçlü kök exudates tarafından indüklenen genler, çeşitli gruplar metabolik yollar besin kullanımı, kemotaksis, hareketliliği ve ribozomal sigara Sentezi antimikrobiyal peptidler ve polyketides ilgili söz konusu olduğunu, bunların sonuçları göster.
Bu çalışmalar doğruluğunu kök exudates koleksiyon üzerinde dayanır. Her ne kadar çeşitli yöntemler farklı amaçlar için kök exudates topluluğu tarif var, sofistike aletleri talep ya da iyi denetlenen koşullar6,7,8' gerçekleştirilmez. Ayrıca, rizosferde inhibe mikroorganizmalar bitki hücre membran geçirgenliği etkileyen kök çıktı kompozisyon etkileyebilir ve konsorsiyumlar mikroorganizmaların9durumunda özellikle kök dokulara zarar. Kök exudates mikrobiyal cevaben araştırıyor tarafından diğer mikroorganizmalar10bileşikleri değiştirilmesini önlemek için iyi tanımlanmış koşulları kullanmak önemlidir. Ayrıca, RNA-seq tabanlı transcriptome çalışmaları için yüksek kaliteli RNA gereklidir. Ancak, modeli bakteri suşları ile uğraşırken, standart protokolleri veya ticari kitleri genellikle düşük verimlilik bilinmeyen faktörler veya özel büyüme özellikleri nedeniyle var.
Burada açıklanan protokol Firmicute şube bir gram-pozitif, spor oluşturan bakteri olan B. mycoides,'ı kullanarak doğrulandı. Çeşitli bitki türlerinin rizosferde içinde her yerde. Şeker pancarı11, sönümleme-off patojen Pythium salatalık12yanı sıra azot inhibisyonu indüksiyon sistematik direnç (ISR) dahil olmak üzere bu tür için birkaç bitki büyüme teşvik özellikleri bildirilmiştir Ayçiçeği rizosferde13fiksasyonu. Ancak, bir ana bitki ile etkileşimi moleküler mekanizmaları iyi okudu değil.
Burada sunulan deneyler amacı endosphere izole B. mycoides transcriptomic yanıt patates kök exudates için incelemektir. Kısacası, protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: Birincisi, patates kök exudates Steril koşullar altında toplamak. Sonra yüksek kaliteli RNA bakteri hücreleri kök exudates ile tedavi ayıklamak. Son adım, web tabanlı T-REx boru hattı14kullanarak veri analizidir. Bu iletişim kuralı ifade düzeylerinde kök-exudates ile temas üzerine bir kayma göstermek ve böylece bitki-mikrop etkileşimlerde önemli bir rol oynayabileceği B. mycoides genlerin tanımlamak için kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. patates steril koşullarda takımıdır
- Patates yüzey steril su ile durulayın. % 70 etanol ve daha sonra 5 min için %3 Sodyum hipoklorit patates yıkayın. Tekrar kalan herhangi bir sodyum hipoklorit kaldırmak için steril su ile durulayın.
- Takımıdır ve patates yumrular büyüyen için gerekli malzemeleri hazırlamak; plastik kap, engraftment sepetleri, vermikülit, sterilize ve ısıyla tarafından 20 dk için 121 ° C'de su.
Not: kullanılan tüm malzemelerin autoclavable olduğundan emin olun. Aksi takdirde, sterilizing diğer yöntemleri kullanın. - Engraftment sepet içine yüzey sterilize patates bağlayıp bu ıslak vermikülit içeren autoclaved bir tencereye koyun.
- Pot bir iklim odasında 24 ° C'de üç hafta boyunca devam et. 16 h ışık (120 µmol m-2s-1) ve karanlığın 8 h döngüleri üzerinde ayarlayın. Mikrobiyal contaminations önlemek için bir büyük cam elyaf kutu kapak pot kullanın.
2. toplama patates kök Exudates
- Sürgünler filiz, transfer autoclaved deiyonize su ile 150 mL steril bir kabı içine bütün patates sepetle doldurdu ile patates yumrular su yüzeyi ve kökleri yer sular altında suda (bkz. Şekil 1). Fide iklim odasında tutmak ve aynı ayarları daha önce olduğu gibi [24 ° C; ışık (120 µmol m-2s-1), karanlığın 8 h 16 h döngüleri] kullanın.
- İkinci gün, gelen su exudates içeren toplamak ve kabı steril deiyonize su ile doldurma. Örnekleme gerçekleştirmek fide aktarma sonra yedinci güne kadar her gün.
- Her örnek ayrı olarak 4 ° C'de depolayın Her örnek için Luria Bertani üzerinde 100 µL yaymak (LB; % 1'tryptone, % 0.5 maya ekstresi, % 0.5 NaCl) agar plaka için mikrobiyal contaminations kontrol etmek için. Kirlenmiş örnekleri atmak.
- Bir fide toplanan örnekleri birleştirir ve onları onları-40 ° c ile 150 mL son hacmi dağılması konsantre.
3. büyüyen bakteriler
- B. mycoides zorlanma bir LB agar plaka üzerine bir-80 ° C gliserol stoktan çizgi ve 30 ° c plaka gecede kuluçkaya.
- Bir koloni plaka ile bir LB sıvı orta aşılamak ve 30 ° C'de gecede 200 devirde titreyen bir kuluçka kültür büyümek
4. tedavi ve bakterilerin örnekleme
- Bir negatif kontrol için kök exudates ile tedavi bakterilerin büyüme eğrisi karşılaştırmak için bir dizi içeren LB sıvı orta 50 mL şişe hazırlayın. Tüm şişeler için gecede bakteriyel kültürünün 0.5 mL ekleyin ve % 0, % 5, % 10 veya % 15 (v/v) kök çıktı ya da steril deiyonize suyla orta olarak sırasıyla ekleyin.
- Bir kültür deiyonize su kök exudates yerine bir denetim olarak kullanın. 600 optik yoğunluk ölçmek nm (OD600) her 1 saat sonra. OD600 değerleri zaman karşı komplo tarafından bir büyüme eğrisi oluşturur.
Not: Biz kök exudates yüzde 10'u B. mycoides gelişimini etkilemez mi gördüm (bkz: Şekil 2); Bu oran RNA-seq deneyler için kullanıldı. - Bir gecede B. mycoides kültürü ile önceden ısıtılmış LB orta ve ilk doz600 itibaren 90 mL seyreltik ~ 0,05 bir 300 mL şişe içinde. Kültür için kök exudates 10 mL ekleyin ve 1 h için 30 ° C'de kuluçkaya.
- 10 mL steril deiyonize su arıtma bir denetim olarak kullanın. Santrifüjü 9000 x g 4 ° C'de 2 min için de tarafından kültür hücreleri toplamak Süpernatant, atmak ve hemen Pelet sıvı azot içinde dondurmak, sonra-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
5. RNA izolasyon
Not: yalıtım başlamadan önce tezgah, raflar ve pipetler RNase dekontaminasyon çözümünü ile temizleyerek hazırlayın ( Tablo malzemelerigörmek). Her zaman eldiven ve tüm tüpler, keyif ve çözümleri RNase ücretsiz olduğundan emin olun. Her zaman örnekleri buz mümkün olduğunda üzerinde tutun.
- Ultrasaf Su (100 mL solüsyon başına DEPC, 100 µL) %0.1 dietil pyrocarbonate (DEPC) (v/v) eklemek, iyice karıştırın ve bir gecede oda sıcaklığında saklayın. Otoklav karışımı gece tedaviden sonra DEPC devre dışı bırakabilirsiniz. TE arabellek hazırlamak için bu DEPC tedavi ultrasaf su kullanın [10 mM Tris-HCl (pH = 8); 1 mM EDTA] ve % 10 SDS (w/v) çözüm.
- Hücre topakları buz çözme ve her biri 400 µL TE (DEPC) arabelleği askıya alma. Süspansiyonlar 2 mL vidalı kapak tüpler içine aktarın.
- Kloroform izoamil alkol (24:1 v/v) 300 µL ve fenol (asit fenol, RNA sınıf) 300 µL premix ve 5 min için durmak karışım izin verin. Resuspended hücrelere eklemek için organik üst aşaması 500 µL al. Daha sonra 50 µL % 10 SDS ve cam boncuk (0.5 µm) 0.5 g tüp içine ekleyin.
- Kapağı sıkıca kapatın ve bir boncuk-değirmen homogenizer tüpü yerleştirin (bkz. Tablo malzeme). 3 × 45 s darbe homojenizasyon 1dk aralığı ile buz üzerinde gerçekleştirin.
- Örnekleri için 11.000 x g (4 ° C) de 10 dk santrifüj kapasitesi ve üst aşaması için yeni bir tüp aktarın.
- Kloroform izoamil alkol (24:1) 500 µL üst aşamaya adım 5.5 ekleyin ve karışımı 11.000 x g (4 ° C) de 5 dk santrifüj kapasitesi.
Not: Aşağıdaki adımları bir ticari cam elyaf filtre tabanlı RNA izolasyon üreticinin yönergesinden modifiye edildi ( Tablo malzemelerigörmek) kit. - 500 µL üst aşaması için taze bir tüp transferi, 2 cilt (1 mL) bir lizis/bağlama arabellek ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.
- Filtre ve toplama tüpler (gelen RNA izolasyon kit) birleştirin ve filtre boru 5.7. adımdaki karışıma pipette. 15 tüpler santrifüj kapasitesi 8000 x g ve atma akışı aracılığıyla s.
- DNaz arabelleği, DNaz 10 µL 100 µL tüplerini microcentrifuge 1,5 mL hazırlamak ben ve 5 µL bir RNase inhibitörü ( Tablo malzemelerigörmek). Filtre tüp filtre üzerinde hazır çözüm mix ekleyin ve 20-30 dk 15-25 ° C'de için kuluçkaya
- Üreticinin yönerge göre çamaşır adımları gerçekleştirin. 50 µL elüsyon arabelleği RNA elute için kullanın.
- -80 ° C'de eluted RNA kaydedin ve çevresinde bir plastik parafin film koymak. Aynı zamanda, bir kaç microliters örnek bir kalite denetimi gerçekleştirmek için 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
6. RNA kalite kontrol ve sıralama
- RNA microvolume Spektrofotometre ile kontrol edin.
Not: 260/280 oranlarıyla absorbans 1.8 olmalıdır ve 260/230 oranlarıyla en az 1,8, tercihen 2.0 yukarıda yukarıda olmalıdır. - Çalıştır tavsiye RNA analizi kullanarak bir otomatik Elektroforez alet arıtılmış RNA kiti ( Tablo malzemelerigörmek); RNA bütünlüğü (RIN) en az 7 devam etmek için olmalıdır.
- RNA 3 µg örnek başına toplam miktarı bir RNA-Seq Kütüphane hazırlık kitaplıklarıyla oluşturmak için kullanın (bkz. Tablo reçetesi) kit üreticinin önerilerini takip.
Not: Yüksek işlem hacmi sıralama platformda Kütüphane hazırlıklar sıralı ve eşleştirilmiş uç okuma oluşturuldu.
7. veri analizi Web tabanlı boru hattı T-REx
- Bir kalite FASTX-Toolkit sürüm 0.0.13 kullanarak filtreleme gerçekleştirmek (> 20 Kalite Puanlarını Phred). Trimmomatic aracı ile bağdaştırıcısı dizilerinden ham RNA-Seq okuma kırpın.
Not: Yüksek kalite ile temiz veri aşağı akım analizleri dayalı idi. - B. mycoides ATCC 6462 NCBI genom veritabanı indir (NCBI katılım No: CP009692.1) ve Bowtie2/2.2.3 kullanarak temiz okuma eşlemek için bir başvuru genom kullanabilirsiniz.
- Kullanım HTSeq v0.6.1 okunma sayıları saymak için her gen için eşlenen ve okuma transkript milyon eşlenen okuma (RPKM) her gen başına kilobaz başına bu gen için eşlenen gen ve Okunma sayısı uzunluğu temel.
- T-REx boru hattı tarafından veri analizi için RPKM tablo giriş yanı sıra üç açıklayıcı dosya kullanın: faktörler, deneyde hangi faktörler farklı gen ekspresyonu için Karşılaştırılacak tanımlamak için (II) bir tezat dosya tanımlamak için (i) bir faktörler dosya ve (iii) genleri ilgi grupları tanımlamak için bir sınıf dosyası.
Not: İn.txt biçimde açıklayıcı dosyalarıdır. Örnekler T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/) Web sayfasında bulunabilir. T-REx kullanarak veri analizi için ayrıntılı bir talimat önceki yayında de Jong vd tarafından bulunabilir 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bitki ilişkili mikroorganizmalar bitki büyüme ve Sağlık olumlu etkileyebilir. Ancak, bitkiler ve onların mikrobiyal simbiont arasındaki karmaşık etkileşimler mekanizmaları tam olarak anlaşılmış değildir. Kök exudates rhizobacterial etkinliği ve davranış düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır ve genellikle kökleri mikrobiyal kolonizasyon mikroplar kök exudates için cazibe olan başlatır öne ise. Bu çalışmanın amacı, rhizobacterial B. mycoides patates kök exudates için transcriptomic yanıt araştırmak için yapıldı. Bunu yerine getirmek için sterilize ve autoclaved vermikülit germinated yüzey patates yumrular vardı. Sonra kök exudates Şekil 1' de gösterildiği gibi toplanmıştır. Bakteriyel büyüme en fazla etkileyen kök exudates olasılığı ekarte için kök exudates % 15 B. mycoides kültür eklenmiş ve büyüme hiçbir değişiklik ölçüm zaman (Şekil 2) sırasında algılandı. Böylece, bu çalışmada gözlenen gen ifade değişiklikler büyük olasılıkla büyüme ile ilgili etkileri tarafından neden.
Koleksiyon sonra kök exudates % 10 oranında (v/v) B. mycoides kültür için eklenmiştir ve bakteriyel toplam RNA daha önce açıklandığı gibi izole edildi. RNA kalite kontrolü için hangi sonuçları Şekil 3' te gösterilmektedir bir otomatik Elektroforez araç tarafından maruz bırakıldı. Şekil 3A ve 3B B. mycoides kök exudates ile tedavi dan izole RNA gösterir ve Şekil 3 c ve 3D kontrol grubundan izole RNA gösterir. Tüm örneklerini RIN değeri 9 yukarıda yüksek kaliteli RNA bu iletişim kuralı tarafından alındığını gösteren 16S ve 23S RNA alt birimleri, karşılık gelen iki net şeritli attı.
Sonra kütüphane hazırlık, Çift uçlu okuma yüksek üretilen iş sıralama platformu ile elde edilmiştir. Ham RNA-Seq okuma bağdaştırıcısı dizileri kesilmiş ve başvuru genom dizisi karşı eşlenmiş. Elde edilen veri, RPKM tablo oluşturuldu. Transcriptome Analizi T-REx boru hattı ile gerçekleştirildi. Oranı yoğunluğu Arsa differentially ifade genlerin Şekil 4' te gösterilmiştir. Bir kontrol ile karşılaştırıldığında, patates kök exudates ilavesi differentially ifade edilecek 715 genler indüklenen. Bu, 408 genlerin upregulated ve 307 genlerin downregulated15idi. Bazı genleri değiştirilmiş ifade ile göreceli değişiklik Tablo 1' de listelenmiştir.
Şekil 1: işlem düzeni patates kök exudates koleksiyonunun. Kullanılan malzemeler autoclaved ve çimlenme bir iklim odasında gerçekleştirilir. Patates yumru steril su ile yıkama ve 5 dk. Bu patates autoclaved bir sepet içine başka bir 5 dk. yer için % 75 etanol içinde banyo ve ıslak vermikülit içeren bir pota koymak içinde % 2-3 NaOCl banyo. Patates bir iklim odasında 3-4 hafta için büyümek ve sonra patates fide sepetle bir ölçek için transfer. Kök exudates her gün toplamak ve kabı steril su ile doldurma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Büyüme eğrisi B. mycoides patates kök exudates farklı konsantrasyonları ile. Yük EC18 bir sıvı LB orta patates kök exudates ilavesi ile büyüdü ya da steril H2O. OD600 her 1s ölçülen ve karşısında anda çizilen. Tüm grupların benzer bir büyüme yol göstermek ilâ gösteren kök exudates ek % 15 B. mycoides büyüme üzerinde önemli hiçbir etkisi yoktur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: RNA kalite kontrol tarafından otomatik Elektroforez enstrüman. A ve B temsil B. mycoides izole RNA kök exudates ve C ve D temsil ile kontrol grubundan izole RNA tedavi. Tüm RNA örnekleri 23S ve 16S rRNA ve zayıf 5S rRNA grubu karşılık gelen iki açık grup göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: fark gen ekspresyonu B. mycoides RNA-seq örnekleri patates kök exudates yanıt olarak görüntülenmesi için oranı yoğunluğu arsa. Rakam T-REx tarafından otomatik olarak oluşturulur. X ekseni gen ifade düzey ve y ekseni log2 dönüştürülmüş kat değişiklik gösterir. Up - ve downregulated genler pozitif ve negatif log2 oranı değerleri vardır. Noktalar çizgili alanında önemli ölçüde bitti - veya altında-ifade değildir genlerin gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Gen etiketi | Strand | Kat değiştirme | Ek açıklama |
| BG05_RS09165 | + | 3.3 | tedavisine sızma protein |
| BG05_RS20930 | + | 25,3 | membran protein |
| BG05_RS10935 | + | 23,3 | Aşama III sporulation protein reklam |
| BG05_RS08990 | - | 11,8 | sporulation protein |
| BG05_RS16405 | + | 3.9 | IclR aile transkripsiyon regülatör |
| BG05_RS24905 | - | 3 | Triptofan synthase alt birimi alpha |
| BG05_RS24920 | - | 2.3 | İndol-3-gliserol fosfat synthase |
| BG05_RS22255 | - | 27 | acetolactate synthase |
| BG05_RS22250 | - | 6.5 | ketol-asit reductoisomerase |
| BG05_RS22265 | - | 26,4 | dallı zincirli amino asit aminotransferaz |
| BG05_RS18715 | - | 2.8 | pullulanase |
| BG05_RS18040 | + | -9.1 | çimlenme protein YpeB |
| BG05_RS16930 | + | -4.2 | ABC ışınlama ATP-bağlayıcı protein şeker |
| BG05_RS27345 | + | -2.9 | MFS ışınlama |
| BG05_RS19555 | - | -3.3 | PUAN cellobiose ışınlama alt birim IIB |
| BG05_RS24345 | - | -2.7 | putrescine ithalatçı |
| BG05_RS22525 | - | -12.4 | cardiolipin synthase |
| BG05_RS15225 | - | -3.3 | membran protein |
| BG05_RS18475 | + | -5.7 | membran protein |
| BG05_RS19095 | + | -2.1 | çimlenme protein |
Tablo 1: Differentially ifade genleri kök exudates tedavi grubu ile karşılaştırıldığında bir denetim listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bitki-mikrop etkileşimleri bakteri ve bitkiler arasındaki ince ayarlı bir denge tarafından belirlenecek olan. Bu tür etkileşimler son derece karmaşık ve zor çalışma için doğal bir sistemde, hangi oluşur çeşitli mikrobiyal türler, potansiyel olarak konsorsiyum hareket. Bu kağıt bakteriyel yanıt-e doğru kök exudates iyi kontrollü şartlar altında çalışmak için basitleştirilmiş bir protokolünü açıklar. Rhizobacteria, kök exudates, maruz kalma üzerine transcriptome profil bakteriyel uyum rizosferde niş için ayrıntılı bilgi sağlar. Bu kök exudates koleksiyonu Protokolü karmaşık prosedürler ve özel ekipman gerektirmez. Ancak, tüm yordamlar kesinlikle steril koşullarda yapılmalıdır ve kısırlık denetimi dahil edilmelidir. Biz birkaç patates yumrular paralel olarak büyüyen ve kontamine olanlar atarak öneririz. Diğer bitki türleri incelendiği Eğer değişiklik bu iletişim kuralı için yapılabilir. Uygulanan dezenfektanlar için hoşgörü içinde değişebilir çünkü herhangi bir tohum/yumrular sterilize etmek için uygun bir yöntem kullanmak önemlidir.
Kök exudates elde edilen bir kez yüksek kaliteli RNA bakteri hücreleri izole edilmelidir. Çeşitli reaktifler ve öncelikle fenol/kloroform veya TRIzol yöntemi temel alan standart iletişim kuralları zaman alıcı16vardır. Ticari kitleri çoğunlukla model organizmalar için tasarlanmıştır ancak başkalarına daha az tabidir. Fenol/kloroform yöntemi ve bir RNA izolasyon kiti bir araya getiren bu RNA izolasyon protokolü bu yöntemlerin dezavantajları üstesinden gelir. Ayrıca, bir boncuk atan adım genellikle planktonik kültüründe toplamak B. mycoides hücreleri homojenize bulunur. Potansiyel DNA kontaminasyon öncesinde elüsyon DNaz ile ilave bir kuluçka tarafından kaldırılır. RIN sayısının yüksek olduğu gibi RNA izolasyonu anlamına gelir. Böylece, bu özellikle verimli ve zaman tasarrufu için çevre bakteri suşları iletişim kuralıdır.
RNA sıralama sonra veri analizi T-REx, RNA-seq gen ifadesi verileri14için bir istatistiksel analiz web tabanlı boru hattı ile gerçekleştirilir. Bu boru hattı, özellikle geniş Biyoinformatik bilgisi olmadan biyologlar için Kullanıcı dostudur. Giriş dosyası sayıları milyon eşlenen okuma (BGBM) veya diğer gen ifade birim başına kilobaz milyon eşlenen okuma (FPKM), başına başına ham RNA ifade düzeyinde veri, RPKM gibi parçaları var. Bu tür gen ifade değer dosyaları SAMtools17, BEDtools18ve NGS-Trex19da dahil olmak üzere kullanılabilir araçlar tarafından oluşturulabilir. RNA-seq analizler için üç giriş dosyaları ihtiyaç vardır. Bu dosyalar tarif deneyler ve çoğaltır, çeşitli deneysel koşullar ve genler ilgi grupları arasında karşılaştırmalar faktörleri tanımlamak için kullanılır. Giriş dosyaları yükledi zaman analiz süreci sadece birkaç dakika sürecek.
B. mycoides EC18, kök exudates ile tedavi ederken birkaç differentially ifade genler Tablo 1' de listelenmiştir. Bunlar arasında membran proteinlerinin kodlama çeşitli genlerin ifade değişir. Genler için sporulation ilgili veya çimlenme işlem differentially dile getirdi. Genlerin sporulation içinde yer alan ifade de B. subtilis içinde değişir zaman kök exudates18dinamik büyüme bakteriyel hücreler için gerekli enerji kaynağı çünkü pirinç fidan ile birlikte kültürlü. Tedavisine direnç ve aromatik bileşikler toprak bakterilerde bozulması ilgilidir, IclR transkripsiyon regülatör upregulated ifadesidir. IclR silme rhizobacteria Klebsiella pneumoniae suşu vahşi tipi zorlanma19ile karşılaştırıldığında mineral fosfat solubilization azalmıştır. Amino asit metabolizması ve sentez ile ilgili çeşitli genler uyarılır, genlerin cellobiose puan ışınlama dahil olmak üzere şeker nakliyesi dahil downregulated iken. Bu Bu zorlanma göstermektedir EC18 amino asitler için metabolik tercih rizosferde şekerler üzerinde sahip. Değiştirilmiş genler işlevini daha da nakavt veya overexpression mutantlar yaparak okudu situ içinde olabilir. Özetle, burada açıklanan protokol potansiyel olarak önemli bakteriyel genler bitki-mikrop etkileşimleri dahil çok sayıda hızlı bir tanımlama sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Jakob Viel onun yararlı yorumlar ve öneriler için teşekkür ederiz. Biz de Anne de Jong Biyoinformatik Analizi onun yardım için teşekkür ederim. Yanglei Yi ve Zhibo Li Çin burs Konseyi (CSC) tarafından desteklenir. NWO-TTW Perspectief başına Programma Back2Roots teşekkür ediyoruz (TKI-AF-15510) OPK için finansal destek için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
- Haichar, F. eZ., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
