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Biology

Plant-सूक्ष्म जीव जनसंवाद: आलू की जड Exudates को बैसिलस Mycoides की Transcriptional प्रतिक्रिया

Published: July 2, 2018 doi: 10.3791/57606
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics, University of Groningen

Summary

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का लक्ष्य आलू की जड़ exudates को endosphere-पृथक बैसिलस mycoides की transcriptomic प्रतिक्रिया का अध्ययन करना है. इस विधि संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत में शामिल महत्वपूर्ण जीवाणु जीन की पहचान की सुविधा और मामूली समायोजन के साथ अन्य endophytes और पौधों के लिए लागू सिद्धांत में है ।

Abstract

लाभकारी संयंत्र-जुड़े बैक्टीरिया विकास को बढ़ावा देने और पौधों में रोग की रोकथाम में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । जैव उर्वरकों या जैव नियंत्रण एजेंटों के रूप में पादप विकास-को बढ़ावा देने वाले rhizobacteria (PGPR) के आवेदन पारंपरिक उर्वरकों के उपयोग के लिए एक प्रभावी विकल्प बन गए हैं और कम लागत पर फसल की उत्पादकता बढ़ा सकते हैं. संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत मेजबान संयंत्र पर निर्भर स्रावित संकेतों और उनके जुड़े बैक्टीरिया द्वारा hereon एक प्रतिक्रिया. हालांकि, कैसे लाभकारी बैक्टीरिया का आणविक तंत्र उनके संबद्ध संयंत्र के लिए प्रतिक्रिया व्युत्पंन संकेत पूरी तरह से समझ में नहीं हैं । exudates रूट करने के लिए बैक्टीरिया की transcriptomic प्रतिक्रिया का आकलन rhizospheric शर्तों के तहत बैक्टीरियल जीन अभिव्यक्ति और विनियमन निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है. ऐसे ज्ञान को पादप-सूक्ष्म जीव बातचीत में शामिल अंतर्निहित तंत्र को समझना आवश्यक है. यह कागज एक विस्तृत mycoides EC18, आलू endosphere से अलग तनाव, आलू की जड़ exudates के transcriptomic प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । हाल ही में उच्च प्रवाह अनुक्रमण प्रौद्योगिकी की मदद के साथ, इस प्रोटोकॉल कई हफ्तों में किया जा सकता है और बड़े पैमाने पर डेटासेट का उत्पादन । सबसे पहले, हम बाँझ शर्तों के तहत जड़ exudates इकट्ठा, जिसके बाद वे mycoides संस्कृतियों के लिए जोड़ रहे हैं । इन संस्कृतियों से आरएनए एक वाणिज्यिक किट के साथ संयुक्त एक phenol/क्लोरोफॉर्म विधि का उपयोग कर अलग है और एक स्वचालित ट्रो साधन द्वारा गुणवत्ता नियंत्रण के अधीन है । अनुक्रमण के बाद, डेटा विश्लेषण वेब आधारित टी-रेक्स पाइपलाइन के साथ किया जाता है और विभेदक व्यक्त जीन के एक समूह की पहचान की है । इस विधि के जीवाणु जीन संयंत्र में शामिल-सूक्ष्म जीव बातचीत पर नई खोजों की सुविधा के लिए एक उपयोगी उपकरण है ।

Introduction

पौधों को जड़ों के माध्यम से rhizosphere1, यानी, जड़ों के पास मिट्टी के संकीर्ण क्षेत्र में प्रकाश संश्लेषण के दौरान तय की कार्बन के 20% तक रिसाव सकता है । उच्च पोषक तत्व की उपलब्धता के कारण, rhizosphere विविध सूक्ष्मजीवों के लिए एक उपयुक्त निवास स्थान है, जिसमें पौधे की वृद्धि बैक्टीरिया को बढ़ावा देना है । जड़ exudates आयनों, अकार्बनिक एसिड, ऑक्सीजन, और पानी की तरह अकार्बनिक यौगिकों की एक सीमा होते हैं । तथापि, जड़ exudates के बहुमत कार्बनिक पदार्थों, जो कम आणविक वजन यौगिकों और उच्च आणविक वजन यौगिकों में विभाजित किया जा सकता द्वारा बनाई है । कम आणविक वजन यौगिकों अमीनो एसिड, कार्बनिक एसिड, शर्करा, phenolic यौगिकों, फैटी एसिड, और माध्यमिक चयापचयों की एक सरणी शामिल हैं । उच्च आणविक वजन यौगिकों कफ और प्रोटीन से मिलकर बनता है2,3. Rhizosphere सूक्ष्मजीवों विकास और विकास के लिए एक ऊर्जा स्रोत के रूप में इन यौगिकों में से कुछ का उपयोग कर सकते हैं । जड़ exudates rhizobacterial समुदाय को आकार देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के बाद से संयंत्र के exudates में उत्पादित यौगिकों विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करने से rhizosphere-जुड़े बैक्टीरिया के व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं.

जड़ exudates के जीवाणु की प्रतिक्रिया को समझना संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत तंत्र को समझने में एक महत्वपूर्ण कदम है । के रूप में संयंत्र के जीवाणु प्रतिक्रिया-सूक्ष्म जीव बातचीत अंतर जीन अभिव्यक्ति का उत्पाद है, यह transcriptome विश्लेषण द्वारा अध्ययन किया जा सकता है । इस विधि का प्रयोग, पिछले अध्ययनों कई महत्वपूर्ण संयंत्र में शामिल जीन की पहचान-सूक्ष्म जीव बातचीत । Pseudomonas aeruginosaमें, चयापचय, chemotaxis, और प्रकार द्वितीय स्राव में शामिल जीन को चीनी चुकंदर जड़ exudates4का जवाब दिखाया गया । फैन एट अल. 5 ने मक्का रूट exudates के जवाब में amyloliquefaciens FZB42 के transcriptomic profile का अध्ययन किया । उनके परिणाम बताते है कि, दृढ़ता से रूट exudates द्वारा प्रेरित जीन की, कई समूहों चयापचय रास्ते पोषक तत्व उपयोग, chemotaxis, गतिशीलता, और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स और polyketides के गैर राइबोसोमल संश्लेषण से संबंधित में शामिल हैं ।

इन अध्ययनों की सटीकता रूट exudates के संग्रह पर निर्भर करता है । हालांकि कई तरीकों अलग प्रयोजनों के लिए रूट exudates के संग्रह का वर्णन किया है, वे या तो परिष्कृत उपकरणों की मांग या अच्छी तरह से नियंत्रित शर्तों6,7,8में नहीं किया जाता है । इसके अलावा, rhizosphere-बाधा सूक्ष्मजीवों संयंत्र कोशिका झिल्ली पारगम्यता को प्रभावित करने और जड़ ऊतकों को नुकसान पहुँचाए, विशेष रूप से सूक्ष्मजीवों9के consortia के मामले में जड़ रिसाव रचना को प्रभावित कर सकते हैं । जब रूट exudates के माइक्रोबियल प्रतिक्रिया की जांच, यह अच्छी तरह से परिभाषित शर्तों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है क्रम में अंय सूक्ष्मजीवों10द्वारा यौगिकों के परिवर्तन से बचने के लिए । इसके अलावा, आरएनए-seq आधारित transcriptome अध्ययन के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए की आवश्यकता है । हालांकि, जब गैर से निपटने-मॉडल-बैक्टीरियल उपभेदों, मानक प्रोटोकॉल या वाणिज्यिक किट आमतौर पर एक कम अज्ञात कारकों या विशेष वृद्धि संपत्तियों के कारण दक्षता है ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित बी mycoides, जो एक ग्राम सकारात्मक, बीजाणु है Firmicute जाति के जीवाणु बनाने का उपयोग कर सत्यापित किया गया था । यह विभिन्ना पादप प्रजातियों के rhizosphere में सर्वत्र व्याप्त है. कई संयंत्र विकास के गुणों को बढ़ावा देने के इस प्रजाति के लिए सूचित किया गया है, व्यवस्थित प्रतिरोध की प्रेरण सहित (ISR) में चीनी चुकंदर11, के निषेध-बंद भिगोना रोगज़नक़12ककड़ी के लिए Pythium , साथ ही साथ नाइट्रोजन सूरजमुखी rhizosphere13में निर्धारण । हालांकि, एक मेजबान संयंत्र के साथ अपनी बातचीत के आणविक तंत्र अच्छी तरह से अध्ययन नहीं कर रहे हैं ।

यहाँ प्रस्तुत प्रयोगों का उद्देश्य आलू की जड़ exudates को endosphere-पृथक बी. mycoides की transcriptomic प्रतिक्रिया का अध्ययन करना है. संक्षेप में, प्रोटोकॉल निंनलिखित चरणों के होते हैं: सबसे पहले, बाँझ शर्तों के तहत आलू जड़ exudates लीजिए । फिर, जड़ exudates के साथ इलाज बैक्टीरियल कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता आरएनए निकालने. अंतिम चरण डेटा विश्लेषण वेब आधारित टी-रेक्स पाइपलाइन14का उपयोग कर रहा है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग B. mycoides जीन पहचानने के लिए किया जाता है जो रूट-exudates के साथ संपर्क पर अभिव्यक्ति के स्तर में बदलाव दिखाते हैं और इस प्रकार पौधे-सूक्ष्म जीव इंटरैक्शन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं.

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Protocol

1. निष्फल परिस्थितियों में अंकुरित आलू

  1. आलू की सतह को बाँझ पानी से कुल्ला करे । ७०% इथेनॉल में आलू स्नान और फिर 3% सोडियम हाइपोक्लोराइट में, 5 मिनट के लिए प्रत्येक । इसे फिर से कुल्ला बाँझ पानी के साथ किसी भी शेष सोडियम हाइपोक्लोराइट को दूर करने के लिए ।
  2. अंकुरण और आलू कंद उगाने के लिए आवश्यक सामग्री तैयार करें; प्लास्टिक के बर्तन, engraftment टोकरी, vermiculite, और पानी 20 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर उन्हें autoclaving द्वारा निष्फल ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सभी सामग्री का इस्तेमाल किया autoclavable हैं । अंयथा, अंय बंध्याकरण विधियों का उपयोग करें ।
  3. engraftment टोकरी में सतह-निष्फल आलू रखो, और एक autoclaved गीला vermiculite युक्त बर्तन में इस जगह है ।
  4. तीन सप्ताह के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर एक जलवायु चैंबर में बर्तन रखो । प्रकाश के 16 ज (१२० µmol एम-2एस-1) और अंधेरे के 8 ज के चक्र पर सेट करें । माइक्रोबियल संदूषण से बचने के लिए, बर्तन को कवर करने के लिए एक बड़े ग्लास फाइबर बॉक्स का उपयोग करें ।

2. आलू की जड़ Exudates का संग्रह

  1. जब अंकुरित हो जाती है, तो पूरे आलू के साथ टोकरी को autoclaved के पानी की १५० मिलीलीटर से भरा एक निष्फल चोंच में, पानी की सतह के ऊपर रखे आलू के कंद के साथ और पानी में जलमग्न जड़ों के साथ स्थानांतरित करें ( चित्र 1देखें) । जलवायु चैंबर में अंकुर रखो, और पहले के रूप में एक ही सेटिंग्स का उपयोग करें [24 ° c; प्रकाश के 16 एच के चक्र (१२० µmol एम-2एस-1), 8 अंधेरे के एच] ।
  2. पर दूसरे दिन से, exudates युक्त पानी इकट्ठा, और बाँझ पानी के साथ चोंच फिर से भरना । अंकुर स्थानांतरित करने के बाद सातवें दिन तक हर दिन नमूना प्रदर्शन ।
  3. प्रत्येक नमूने अलग से 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । प्रत्येक नमूने के लिए, एक Luria-Bertani पर फैले १०० µ एल (पौंड; 1% tryptone, ०.५% खमीर निकालने, ०.५% NaCl) आगर प्लेट माइक्रोबियल संदूषणों के लिए जांच करने के लिए । दूषित नमूनों को त्यागें ।
  4. एक अंकुर के एकत्र नमूनों का मिश्रण है, और उंहें फ्रीज द्वारा ध्यान केंद्रित-४० ° c १५० मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को सुखाने ।

3. बढ़ते बैक्टीरिया

  1. लकीर एक पौंड आगर प्लेट पर एक-८० ° c ग्लिसरॉल शेयर से एक बी mycoides तनाव, और 30 डिग्री सेल्सियस रात भर में थाली मशीन ।
  2. थाली से एक भी कॉलोनी के साथ एक पौंड तरल मध्यम Inoculate, और २०० rpm पर एक मिलाते हुए मशीन में संस्कृति बढ़ती 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ।

4. उपचार और बैक्टीरिया का नमूना

  1. एक नकारात्मक नियंत्रण करने के लिए रूट exudates के साथ इलाज बैक्टीरिया की वृद्धि वक्र तुलना करने के लिए, पौंड तरल मध्यम के ५० मिलीलीटर युक्त कुप्पी की एक श्रृंखला तैयार करते हैं । सभी कुप्पी के लिए रातोंरात बैक्टीरियल संस्कृति के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें, और या तो जोड़ने 0%, 5%, 10%, या 15% (वी/वी) रूट रिसाव या बाँझ जल मध्यम करने के लिए, क्रमशः ।
  2. एक नियंत्रण के रूप में जड़ exudates के बजाय पानी के साथ एक संस्कृति का प्रयोग करें । ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) हर 1 घंटे बाद में ऑप्टिकल घनत्व को मापने । समय बनाम आयुध डिपो६०० मूल्यों की साजिश रचने के द्वारा एक वृद्धि वक्र उत्पन्न करते हैं ।
    नोट: हमने देखा है कि जड़ exudates के 10% बी mycoides के विकास को प्रभावित नहीं किया ( चित्रा 2देखें); इस अनुपात में आरएनए-seq प्रयोगों के लिए प्रयोग किया गया.
  3. पूर्व के ९० मिलीलीटर के साथ एक रात mycoides संस्कृति पतला-गरम पौंड मध्यम के प्रारंभिक आयुध डिपो६०० ~ ०.०५ के एक ३०० मिलीलीटर कुप्पी में । संस्कृति के लिए रूट exudates के 10 मिलीलीटर जोड़ें और 1 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर यह मशीन ।
  4. एक नियंत्रण के रूप में एक 10 मिलीलीटर बाँझ जल उपचार का उपयोग करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ९,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा संस्कृति से कोशिकाओं को इकट्ठा । supernatant त्यागें, और तुरंत तरल नाइट्रोजन में गोली फ्रीज, तो यह दुकान पर-८० ° c उपयोग तक ।

5. आरएनए अलगाव

नोट: अलगाव शुरू करने से पहले, कार्यक्षेत्र, रैक तैयार है, और उंहें एक RNase दूषण समाधान के साथ सफाई से पिपेट ( सामग्री की तालिकादेखें) । सभी समय पर दस्ताने पहनते हैं, और सुनिश्चित करें कि सभी ट्यूबों, सुझावों, और समाधान RNase मुक्त कर रहे हैं । संभव होने पर नमूनों को हमेशा बर्फ पर रखें ।

  1. जोड़ें ०.१% (v/v) diethyl pyrocarbonate (DEPC) के ultrapure पानी के लिए (१०० µ एल के DEPC प्रति १०० मिलीलीटर समाधान), यह अच्छी तरह से मिश्रण है, और यह कमरे के तापमान पर रात भर रखने के लिए । मिश्रण को आटोक्लेव रात भर उपचार के बाद DEPC को निष्क्रिय कर दीजिये । इस DEPC-स्वास्थ्यकर्मी ultrapure पानी का उपयोग ते बफर तैयार करने के लिए [10 mm Tris-HCl (pH = 8); 1 mm EDTA] और एक 10% एसडीएस (w/v) समाधान ।
  2. पिघल बर्फ पर सेल छर्रों और प्रत्येक निलंबित ते (DEPC) बफर के ४०० µ एल में । 2 मिलीलीटर पेंच कैप ट्यूबों में निलंबन स्थानांतरण ।
  3. Premix ३०० µ एल के क्लोरोफॉर्म-isoamyl अल्कोहल (24:1 v/और ३०० µ एल के phenol (एसिड phenol, आरएनए ग्रेड), और मिश्रण 5 मिनट के लिए खड़े करने के लिए अनुमति देते हैं । ले reसस्पैंड कोशिकाओं को जोड़ने के लिए कार्बनिक ऊपरी चरण के ५०० µ एल । फिर 10% एसडीएस और कांच के मोती (०.५ µm) के ०.५ ग्राम के ५० µ एल जोड़ें ट्यूब में ।
  4. टोपी मजबूती से बंद करो और एक मनका मिल homogenizer में ट्यूब जगह ( सामग्री की तालिकादेखें) । बर्फ पर एक 1 मिनट के अंतराल के साथ एक 3 × ४५ एस पल्स homogenization प्रदर्शन ।
  5. ११,००० x g (4 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक, और एक नई ट्यूब के लिए ऊपरी चरण हस्तांतरण ।
  6. क्लोरोफॉर्म-isoamyl शराब (24:1) के चरण ५.५ से ऊपरी चरण के लिए ५०० µ एल जोड़ें और ११,००० x जी (4 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिनट के लिए मिश्रण केंद्रापसारक ।
    नोट: निम्न चरणों का एक वाणिज्यिक ग्लास फाइबर फिल्टर-आधारित आरएनए आइसोलेशन किट के निर्माता के निर्देश से संशोधित किया गया ( सामग्री की तालिकादेखें).
  7. स्थानांतरण ५०० µ ऊपरी चरण के एल एक ताजा ट्यूब करने के लिए, 2 खंड (1 मिलि) एक lysis/बाइंडिंग बफ़र जोड़ें और इसे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण ।
  8. फ़िल्टर और संग्रह ट्यूबों (आरएनए अलगाव किट से) का मिश्रण है और फिल्टर ट्यूब करने के लिए कदम ५.७ से मिक्सचर पिपेट । ८,००० x जी पर 15 एस के लिए ट्यूबों केंद्रापसारक और प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
  9. DNase बफर के १०० µ एल के साथ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों तैयार करें, DNase मैं के 10 µ एल, और एक µ अवरोध करनेवाला के 5 RNase एल ( सामग्री की तालिकादेखें). फ़िल्टर ट्यूब के फिल्टर पर तैयार समाधान मिश्रण जोड़ें, और 15-25 डिग्री सेल्सियस पर 20-30 मिनट के लिए यह मशीन ।
  10. निर्माता के निर्देश के अनुसार धुलाई चरण निष्पादित करें । आरएनए elute करने के लिए एक रेफरेंस बफर के ५० µ एल का उपयोग करें ।
  11. -८० डिग्री सेल्सियस पर eluted आरएनए बचाओ, और इसके चारों ओर एक प्लास्टिक आयल फिल्म डाल दिया । एक ही समय में, एक गुणवत्ता की जांच करने के लिए नमूना के कुछ microliters एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब हस्तांतरण ।

6. आरएनए गुणवत्ता की जांच और अनुक्रमण

  1. एक microvolume spectrophotometer के साथ आरएनए की जाँच करें ।
    नोट: 260/280 पर अवशोषक अनुपात १.८ से ऊपर होना चाहिए, और 260/230 पर अनुपात कम से ऊपर होना चाहिए १.८, अधिमानतः २.० से ऊपर ।
  2. ( सामग्री की तालिकादेखें) की सिफारिश आरएनए विश्लेषण किट का उपयोग कर एक स्वचालित ट्रो साधन में शुद्ध आरएनए भागो; आरएनए वफ़ादारी संख्या (रिण) कम से कम 7 से ऊपर आगे बढ़ना चाहिए.
  3. एक आरएनए-Seq पुस्तकालय तैयारी किट के साथ पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए नमूना प्रति आरएनए के 3 µ g की कुल राशि का उपयोग करें निर्माता की सिफारिशों का पालन ( सामग्री की तालिकादेखें).
    नोट: लायब्रेरी की तैयारी एक उच्च-प्रवाह sequencing प्लेटफ़ॉर्म पर अनुक्रम थे और युग्मित-अंत पढ़ता जनरेट किए गए थे ।

7. डेटा विश्लेषण वेब आधारित पाइपलाइन टी-रेक्स का उपयोग

  1. FASTX-टूलकिट संस्करण 0.0.13 (Phred गुणवत्ता स्कोर > 20) का उपयोग करते हुए एक गुणवत्ता फ़िल्टरिंग निष्पादित करें । ट्रिम कर दीजिए कच्चे आरएनए-Seq Trimmomatic उपकरण के साथ एडाप्टर अनुक्रम से पढ़ता है ।
    नोट: सभी अनुप्रवाह विश्लेषण उच्च गुणवत्ता के साथ स्वच्छ डेटा पर आधारित थे ।
  2. डाउनलोड mycoides ATCC ६४६२ NCBI जीनोम डाटाबेस (NCBI प्रवेश No.: सीपी 009692.1) और इसे साफ मानचित्रण के लिए एक संदर्भ जीनोम के रूप में उपयोग Bowtie2/2.2.3 का उपयोग कर पढ़ता है ।
  3. का प्रयोग करें HTSeq v 0.6.1 गणना करने के लिए प्रत्येक जीन के लिए मैप की संख्या पढ़ता है और प्रति लाख प्रतिलिपि के kilobase प्रति पढ़ता है मैप (RPKM) प्रत्येक जीन के जीन की लंबाई और पढ़ता है गणना के आधार पर इस जीन के लिए मैप ।
  4. T-REx पाइपलाइन द्वारा डेटा के विश्लेषण के लिए, इनपुट के रूप में RPKM तालिका का उपयोग करें, साथ ही तीन वर्णनात्मक फ़ाइलें: (i) कारकों में प्रयोग का वर्णन करने के लिए एक कारक फ़ाइल, (ii) एक विरोधाभासों फ़ाइल को परिभाषित करने के लिए जो कारकों अंतर जीन अभिव्यक्ति के लिए तुलना की जाएगी , और (iii) एक वर्ग के लिए ब्याज की जीन के समूहों का वर्णन फ़ाइल ।
    नोट: वर्णनात्मक फ़ाइलें. txt स्वरूप में हैं । उदाहरण टी-रेक्स (http://genome2d.molgenrug.nl/) के वेबपेज पर पाया जा सकता है । टी REx का उपयोग कर डेटा विश्लेषण के लिए एक विस्तृत अनुदेश डी जोंग एट अल द्वारा एक पिछले प्रकाशन में पाया जा सकता है । 14.

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Representative Results

संयंत्र जुड़े सूक्ष्मजीवों सकारात्मक संयंत्र विकास और स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकते हैं । हालांकि, पौधों और उनके माइक्रोबियल symbionts के बीच जटिल बातचीत के तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं । जड़ exudates rhizobacterial गतिविधि और व्यवहार को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और यह आम तौर पर माने है कि जड़ों की माइक्रोबियल औपनिवेशीकरण रूट exudates करने के लिए रोगाणुओं के आकर्षण के साथ शुरू होता है । इस काम का मकसद आलू की जड़ exudates को rhizobacterial बी mycoides की transcriptomic प्रतिक्रिया की जांच करना था । इस को पूरा करने के लिए, आलू कंद सतह निष्फल और autoclaved vermiculite में अंकुरित थे । फिर रूट exudates के रूप में चित्र 1में दिखाया एकत्र किया गया । बैक्टीरियल विकास को प्रभावित करने वाले रूट exudates की संभावना को शासन करने के लिए, अप करने के लिए रूट exudates के 15% को बी mycoides संस्कृति में जोड़ा गया, और विकास में कोई परिवर्तन नहीं मापने के समय (चित्रा 2) के दौरान पता चला था । इस प्रकार, इस अध्ययन में मनाया जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की संभावना वृद्धि से संबंधित प्रभाव के कारण नहीं थे ।

संग्रह के बाद, रूट exudates एक 10% अनुपात में बी mycoides संस्कृति को जोड़ा गया (v/वी), और बैक्टीरियल कुल आरएनए पहले वर्णित के रूप में अलग किया गया था । आरएनए तो एक स्वचालित ट्रो साधन है जिसमें से परिणाम चित्रा 3में दिखाए जाते है द्वारा एक गुणवत्ता की जांच के अधीन था । 3 डी चित्रा और 3 बी mycoides जड़ exudates के साथ इलाज से अलग आरएनए का प्रतिनिधित्व करते हैं, और आंकड़ा 3 सी और 3d आरएनए नियंत्रण समूह से पृथक प्रतिनिधित्व करते हैं । सभी नमूनों 16S और 23S आरएनए उपइकाई के लिए इसी दो स्पष्ट बैंड के साथ 9 से ऊपर एक रिण मूल्य बनाए, का प्रदर्शन है कि उच्च गुणवत्ता आरएनए इस प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त किया गया था.

लायब्रेरी तैयारी के बाद, युग्म-अंत पढ़ता एक उच्च-प्रवाह sequencing प्लेटफ़ॉर्म के साथ प्राप्त किए गए थे । कच्चे आरएनए-Seq पढ़ता एडाप्टर दृश्यों से छंटनी की और संदर्भ जीनोम अनुक्रम के खिलाफ मैप किया गया । परिणामी डेटा की, RPKM तालिका जनरेट किया गया था । टी-रेक्स पाइपलाइन के साथ transcriptome विश्लेषण किया गया था । सभी अंतर व्यक्त जीन की अनुपात तीव्रता भूखंड चित्रा 4में दिखाया गया है । के रूप में एक नियंत्रण के साथ तुलना में, आलू रूट exudates के अलावा ७१५ जीन प्रेरित करने के लिए अंतर व्यक्त किया जाएगा । उन में से ४०८ जीन विनियमित थे, और ३०७ जीन15downregulated थे । बदल अभिव्यक्ति के साथ जीन में से कुछ के सापेक्ष परिवर्तन 1 तालिकामें सूचीबद्ध है ।

Figure 1
चित्रा 1: आलू रूट exudates के संग्रह की प्रक्रिया योजना । प्रयुक्त सामग्री autoclaved और अंकुरण एक जलवायु चैंबर में किया जाता है । आलू कंद को निष्फल पानी से धोकर, 5 मिनट के लिए 2-3% NaOCl में स्नान करें । यह एक और 5 मिनट के लिए ७५% इथेनॉल में स्नान । आलू को एक autoclaved टोकरी में रखें और गीले vermiculite से युक्त बर्तन में रख दें । 3-4 सप्ताह के लिए एक जलवायु चैंबर में आलू बढ़ने, और फिर एक चोंच के लिए आलू के अंकुर के साथ टोकरी हस्तांतरण । हर दिन जड़ exudates लीजिए और निष्फल पानी के साथ चोंच फिर से भरना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: आलू की जड़ exudates के विभिन्न सांद्रता के साथ बी mycoides की वृद्धि वक्र । तनाव EC18 आलू जड़ exudates या बाँझ एच2O. OD६०० के अलावा के साथ एक तरल पौंड मध्यम में उगाया गया था हर 1 घंटे मापा गया था और समय बनाम साजिश रची । सभी समूहों के एक समान विकास पैटर्न दिखाने के लिए, यह दर्शाता है कि अप करने के लिए 15% जड़ exudates इसके अलावा mycoides विकास पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: स्वचालित ट्रो साधन द्वारा आरएनए गुणवत्ता की जाँच करें । A और b mycoides से पृथक आरएनए का प्रतिनिधित्व करते हैं जो रूट exudates और सी और डी के साथ व्यवहार किया जाता है जो नियंत्रण समूह से पृथक आरएनए का प्रतिनिधित्व करते हैं । सभी आरएनए नमूने 23S और 16S rRNA और एक कमजोर 5 एस rRNA बैंड के लिए इसी दो स्पष्ट बैंड दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: आरएनए के अंतर जीन अभिव्यक्ति visualizing के लिए अनुपात तीव्रता साजिश-आलू रूट exudates के जवाब में mycoides के seq नमूने । यह आंकड़ा स्वचालित रूप से टी-रेक्स द्वारा उत्पंन होता है । X-अक्ष जीन व्यंजक स्तर का प्रतिनिधित्व करता है, और Y-अक्ष log2-रूपांतरित फ़ोल्ड परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है । ऊपर जा रहा है जीन-और downregulated सकारात्मक और नकारात्मक log2 अनुपात मूल्यों है । धारीदार क्षेत्र में डॉट्स कि काफी अधिक नहीं है जीन संकेत मिलता है-या के तहत व्यक्त की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

जीन टैग कतरा फ़ोल्ड बदलें एनोटेशन
BG05_RS09165 + ३.३ बहुऔषध समाप्ति प्रोटीन
BG05_RS20930 + २५.३ झिल्ली प्रोटीन
BG05_RS10935 + २३.३ स्टेज III sporulation प्रोटीन विज्ञापन
BG05_RS08990 - ११.८ sporulation प्रोटीन
BG05_RS16405 + ३.९ IclR परिवार transcriptional पर्सेंट
BG05_RS24905 - 3 tryptophan सिंथेस उपइकाई अल्फा
BG05_RS24920 - २.३ इण्डोल-3-ग्लिसरॉल फॉस्फेट सिंथेस
BG05_RS22255 - 27 acetolactate सिंथेस
BG05_RS22250 - ६.५ ketol-एसिड reductoisomerase
BG05_RS22265 - २६.४ बंटी-जंजीर अमीनो अम्ल aminotransferase
BG05_RS18715 - २.८ pullulanase
BG05_RS18040 + -९.१ अंकुरण प्रोटीन YpeB
BG05_RS16930 + -४.२ चीनी एबीसी ट्रांसपोर्टर एटीपी-बाध्यकारी प्रोटीन
BG05_RS27345 + -२.९ MFS ट्रांसपोर्टर
BG05_RS19555 - -३.३ अंक cellobiose ट्रांसपोर्टर उपइकाई IIB
BG05_RS24345 - -२.७ putrescine आयातक
BG05_RS22525 - -१२.४ cardiolipin सिंथेस
BG05_RS15225 - -३.३ झिल्ली प्रोटीन
BG05_RS18475 + -५.७ झिल्ली प्रोटीन
BG05_RS19095 + -२.१ अंकुरण प्रोटीन

तालिका 1: एक नियंत्रण के साथ तुलना में एक रूट exudates-इलाज समूह के विभेदक व्यक्त जीन की सूची ।

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Discussion

संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत बैक्टीरिया और पौधों के बीच एक पतले देखते संतुलन द्वारा निर्धारित किया जा करने के लिए परिकल्पना की गई है । इस तरह के बातचीत के अत्यधिक जटिल और एक प्राकृतिक प्रणाली है, जो विविध माइक्रोबियल प्रजातियों, संभवतः consortia के रूप में अभिनय शामिल में अध्ययन करने के लिए मुश्किल हैं । यह कागज एक सरलीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए अच्छी तरह से नियंत्रित शर्तों के तहत जड़ exudates को बैक्टीरियल प्रतिक्रिया का अध्ययन । rhizobacteria के transcriptome प्रोफ़ाइल, रूट exudates के लिए जोखिम पर, rhizosphere आला करने के लिए बैक्टीरियल अनुकूलन पर विस्तृत जानकारी प्रदान करता है । इस रूट exudates संग्रह प्रोटोकॉल जटिल प्रक्रियाओं और विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, सभी प्रक्रियाओं को सख्ती से बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए और एक बांझपन नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए । हम समानांतर में कई आलू कंद बढ़ रही है और दूषित लोगों को त्यागने की सलाह देते हैं । संशोधनों के इस प्रोटोकॉल बनाया जा सकता है अगर अंय प्रजातियों के पौधे का अध्ययन किया जा रहा है । यह एक उपयुक्त विधि का उपयोग करने के लिए किसी भी बीज/कंद निष्फल क्योंकि वे सहिष्णुता में कीटाणुनाशक लागू करने के लिए भिंन हो सकते है महत्वपूर्ण है ।

एक बार जड़ exudates प्राप्त कर रहे हैं, उच्च गुणवत्ता आरएनए बैक्टीरियल कोशिकाओं से अलग किया जाना चाहिए । विभिंन रिएजेंट और मानक प्रोटोकॉल है कि मुख्य रूप से phenol/क्लोरोफॉर्म या TRIzol विधि पर आधारित है समय लेने वाली16। वाणिज्यिक किट ज्यादातर मॉडल जीवों के लिए तैयार हैं, लेकिन दूसरों के लिए लागू कम कर रहे हैं । phenol/क्लोरोफॉर्म विधि और एक आरएनए आइसोलेशन किट को जोड़ती है कि इस आरएनए आइसोलेशन प्रोटोकॉल इन विधियों के नुकसान पर काबू । इसके अलावा, एक मनका-धड़कन कदम homogenize mycoides कोशिकाओं है कि आम तौर पर planktonic संस्कृति में समग्र के लिए शामिल है । संभावित डीएनए संदूषण DNase के साथ एक अतिरिक्त गर्मी से पहले रेफरेंस के लिए हटा दिया है । उच्च रिण संख्या बरकरार आरएनए के अलगाव का तात्पर्य है । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से कुशल और समय पर्यावरण जीवाणु उपभेदों के लिए बचत है ।

आरएनए अनुक्रमण के बाद, डेटा विश्लेषण टी-रेक्स, आरएनए-seq जीन अभिव्यक्ति डेटा14के लिए एक वेब आधारित सांख्यिकीय विश्लेषण पाइपलाइन के साथ किया जाता है । इस पाइपलाइन विशेष रूप से व्यापक bioinformatics ज्ञान के बिना जीव के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल है । इनपुट फ़ाइल कच्ची आरएनए अभिव्यक्ति स्तर डेटा, जैसे RPKM, प्रति दस लाख मैप किए गए kilobase (FPKM), प्रति दस लाख मैप किए गए पढ़ता (CPM), या अन्य जीन व्यंजक इकाइयों गिना जाता है । इस तरह के जीन अभिव्यक्ति मूल्य फ़ाइलें SAMtools17, BEDtools18, और NGS-Trex19सहित उपलब्ध उपकरणों के द्वारा उत्पंन किया जा सकता है । आरएनए-seq विश्लेषण चलाने के लिए, तीन अन्य इनपुट फ़ाइलों की आवश्यकता है । इन फ़ाइलों को कारकों है कि प्रयोगों और दोहराने का वर्णन परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जाता है, विभिंन प्रायोगिक शर्तों के बीच तुलना, और ब्याज की जीन के समूहों । जब इनपुट फ़ाइलें अपलोड कर रहे हैं, विश्लेषण प्रक्रिया केवल कुछ मिनट लग जाएगा ।

कई विभेदक व्यक्त mycoides EC18, जब रूट exudates के साथ इलाज के जीन, 1 तालिकामें सूचीबद्ध हैं । उनमें, कई जीन झिल्ली प्रोटीन एंकोडिंग की अभिव्यक्ति बदल दिया है । sporulation या अंकुरण प्रक्रिया से संबंधित जीन विभेदक रूप से व्यक्त किए जाते हैं. sporulation में शामिल जीन की अभिव्यक्ति भी बी सबटिलिस में परिवर्तन जब चावल अंकुर के साथ सह संस्कृति, क्योंकि रूट exudates18बैक्टीरियल कोशिकाओं के गतिशील विकास के लिए आवश्यक ऊर्जा की आपूर्ति । IclR transcriptional नियामक की अभिव्यक्ति है, जो बहुऔषध प्रतिरोध और मिट्टी के जीवाणुओं में सुगंधित यौगिकों के क्षरण से संबंधित है, को विनियमित है । rhizobacteria Klebsiella निमोनिया के IclR विलोपन तनाव खनिज फॉस्फेट solubilization, जंगली प्रकार तनाव19के साथ तुलना में कमी आई है । एमिनो एसिड चयापचय और संश्लेषण से संबंधित कई जीन उत्तेजित कर रहे हैं, जबकि एक cellobiose अंक ट्रांसपोर्टर सहित चीनी परिवहन में शामिल जीन downregulated हैं. यह पता चलता है कि तनाव EC18 rhizosphere में शर्करा पर अमीनो एसिड के लिए एक चयापचय पसंद हो सकता है । बदली हुई जीन की कार्यप्रणाली को नॉकआउट या प्रम्यूटेंट बनाकर सीटू में आगे की पढ़ाई की जा सकती है. संक्षेप में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल संभावित महत्वपूर्ण जीवाणु संयंत्र में शामिल जीन की एक बड़ी संख्या की एक त्वरित पहचान-सूक्ष्म जीव बातचीत में सक्षम बनाता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम उनके उपयोगी टिप्पणियों और सुझावों के लिए Jakob Viel धंयवाद । हम भी bioinformatics विश्लेषण में उनकी मदद के लिए ऐनी डी जोंग धंयवाद । Yanglei यी और Zhibo ली को चीन छात्रवृत्ति परिषद (सीएससी) द्वारा समर्थित किया गया है । हम Back2Roots को उनके वित्तीय समर्थन के लिए NWO-TTW Perspectief Programma TKI (OPK-AF-१५५१०) का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium hypochlorite Sigma  CAS: 7681-52-9  10-15%  active chlorine
Luria-Bertani (LB) broth
incubater New Brunswick Scientific Innova 4000
spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Genesys 20
liquid nitrogen
glass beads Sigma G8893 0.5 µm
2.0 ml tube with screw cap RNase free
1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube RNase free
Bead mill homogenizer BioSpec 607 Mini_beadbeater
centrifuge Eppendorf 5430
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) sigma CAS: 1609-47-8
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) sigma CAS: 151-21-3  10% solution prepared with DEPC treated MQ water
TE buffer 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8
phenol Sigma RNA grade
chloroform-isoamyl alcohol  prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature
High pure RNA isolation kit Roche 11828665001
RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780 RNase-Zap
Automated electrophoresis instrument Agilent 2100 Bioanalyzer
Microvolume spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Nanodrop ND-1000
RNA quality analysis kit Agilent RNA 6000 Nano kit 
RNase inhibitor Thermo Fisher Scientific RiboLock
Directional RNA library Prep kit NEB Ultra For Illumina

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References

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Tags

जीव विज्ञान अंक १३७ बैसिलस mycoides rhizobacteria transcriptome आलू जड़ exudates पादप-सूक्ष्म जीव संपर्क आरएनए अलगाव आरएनए-seq
Plant-सूक्ष्म जीव जनसंवाद: आलू की जड Exudates को <em>बैसिलस Mycoides</em> की Transcriptional प्रतिक्रिया
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Yi, Y., Li, Z., Kuipers, O. P.… More

Yi, Y., Li, Z., Kuipers, O. P. Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates. J. Vis. Exp. (137), e57606, doi:10.3791/57606 (2018).

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