Summary
Het doel van het hier gepresenteerde protocol is het bestuderen van de reactie van de transcriptomic van endosphere-geïsoleerde Bacillus mycoides op aardappel wortel exsudaat. Deze methode vereenvoudigt de identificatie van belangrijke bacteriële genen die betrokken zijn in plant-microbe interacties en is in principe van toepassing op andere endofyten en planten, met kleine aanpassingen.
Abstract
Nuttige plant-geassocieerde bacteriën spelen een belangrijke rol in het bevorderen van de groei en het voorkomen van de ziekte in planten. De toepassing van plant groeibevorderende rhizobacteria (PGPR) als biofertilizers of biocontrol agenten is uitgegroeid tot een effectief alternatief voor het gebruik van conventionele meststoffen en gewas productiviteit tegen lage kosten kan verhogen. Plant-microbe interacties, is afhankelijk van host plant-uitgescheiden signalen en een reactie erop door hun bijbehorende bacteriën. Echter reageren de moleculaire mechanismen van hoe nuttige bacteriën op de bijbehorende plantgerelateerde signalen worden niet volledig begrepen. Beoordeling van de reactie van de transcriptomic van bacteriën op wortel exsudaat is een krachtige aanpak om de bacteriële genexpressie en verordening onder rhizospheric omstandigheden. Deze kennis is noodzakelijk om te begrijpen van de onderliggende mechanismen die betrokken zijn in plant-microbe interacties. Dit witboek beschrijft een gedetailleerd protocol om te bestuderen van de transcriptomic reactie van B. mycoides EC18, een stam die geïsoleerd van de aardappel-endosphere, met exsudaat van de wortel van de aardappel. Met de hulp van recente hoge gegevensdoorvoer sequencing-technologie, kan dit protocol worden uitgevoerd in verschillende weken en produceren enorme datasets. Eerst, verzamelen we de wortel exsudaat onder steriele condities, waarna ze worden toegevoegd aan B. mycoides culturen. RNA van deze culturen is geïsoleerd met behulp van een fenol/chloroform methode in combinatie met een commerciële kit en onderworpen aan een kwaliteitscontrole door een geautomatiseerde elektroforese instrument. Na sequencing, data-analyse wordt uitgevoerd met de web gebaseerde T-REx-gasleiding en een groep van differentially uitgedrukte genen wordt geïdentificeerd. Deze methode is een nuttig instrument om nieuwe ontdekkingen op de bacteriële genen die betrokken zijn in plant-microbe interacties.
Introduction
Planten kunnen afgescheiden tot 20% van de koolstof vast tijdens de fotosynthese door wortels in de rhizosfeer1, dat wil zeggen, de smalle zone van de bodem in de buurt van de wortels. Als gevolg van de hogere beschikbaarheid van nutriënten is de rizosfeer een geschikt leefgebied voor verschillende micro-organismen, met inbegrip van plantengroei bevordering van bacteriën. De wortel exsudaat bevatten een aantal anorganische verbindingen als ionen, anorganische zuren, zuurstof en water. De meerderheid van de wortel exsudaat wordt echter gevormd door organische materialen, die kunnen worden onderverdeeld in laag molecuulgewicht verbindingen en ultrahoog moleculair gewicht verbindingen. De laagmoleculaire bestanddelen bevatten aminozuren, organische zuren, suikers, fenolische verbindingen, vetzuren en een array van secundaire metabolieten. De verbindingen van ultrahoog moleculair gewicht bestaan uit mucilage en eiwitten2,3. Rhizosfeer micro-organismen kunnen sommige van deze verbindingen gebruiken als een bron van energie voor groei en ontwikkeling. De wortel exsudaat spelen een belangrijke rol bij het vormgeven van de rhizobacterial Gemeenschap, omdat de plant-geproduceerde verbindingen in het exsudaat het gedrag van de rhizosfeer-geassocieerde bacteriën beïnvloeden kunnen door de expressie van specifieke genen beïnvloeden.
Inzicht in de bacteriële reactie op wortel exsudaat is een belangrijke stap in het ontcijferen van de plant-microbe interactie mechanismen. Zoals de bacteriële reactie op plant-microbe interacties het product van differentiële genexpressie is, kan het worden bestudeerd door transcriptome analyse. Met behulp van deze methode, vastgesteld eerdere studies verscheidene belangrijke genen die betrokken zijn in plant-microbe interacties. In Pseudomonas aeruginosa, genen die betrokken zijn in het metabolisme, chemotaxis en type II secretie geleerd om te reageren op de bieten wortel exsudaat van4. Sexy et al. 5 studeerde de transcriptomic profilering van B. amyloliquefaciens FZB42 in antwoord op maïs root exsudaat. Hun resultaten tonen aan dat van de genen sterk geïnduceerd door de wortel exsudaat, verschillende groepen bij betrokken zijn in de metabolische banen met betrekking tot het gebruik van de voedingsstoffen, chemotaxis, beweeglijkheid en niet-ribosomal synthese van antimicrobiële peptiden en polyketiden.
De nauwkeurigheid van deze studies, is afhankelijk van de hoeveelheid exsudaat van de wortel. Hoewel verschillende methoden de hoeveelheid exsudaat van de wortel voor verschillende doeleinden beschreven hebben, ze eisen van geavanceerde instrumenten of worden niet uitgevoerd in goed gecontroleerde omstandigheden6,7,8. Bovendien micro-organismen rhizosfeer-remmende invloed kunnen uitoefenen op wortel afgescheiden compositie door het beïnvloeden van de plant cel membraan permeabiliteit en beschadiging van de wortel weefsels, met name in het geval van consortia van micro-organismen9. Bij het onderzoeken van de microbiële reactie op wortel exsudaat, is het belangrijk om duidelijk omschreven Gebruiksvoorwaarden teneinde wijziging van de verbindingen met andere micro-organismen10. Bovendien, kwalitatief hoogwaardige RNA is nodig voor RNA-seq transcriptome studies gebaseerde. Echter, bij de behandeling van niet-model-bacteriële spanningen, de standaard protocollen of commerciële kits hebben meestal een lage efficiëntie als gevolg van onbekende factoren of speciale groei eigenschappen.
Het protocol hier beschreven werd geverifieerd met behulp van B. mycoides, die is een gram-positieve, spore-vormende bacterie van de Firmicute stam. Het is alomtegenwoordig in de rizosfeer van verschillende plantensoorten. Verschillende plant groei bevorderen van eigenschappen zijn gemeld voor deze soorten, waaronder inductie van systematische weerstand (ISR) in suikerbieten11, remming van de demping-off pathogen Pythium voor komkommer12, evenals stikstof fixatie in de rhizosfeer zonnebloem13. De moleculaire mechanismen van de interactie met een waardplant zijn echter niet goed bestudeerd.
Het doel van de experimenten die hier gepresenteerd is om te studeren van de reactie van de transcriptomic van endosphere-geïsoleerde B. mycoides op aardappel wortel exsudaat. Kortom, het protocol bestaat uit de volgende stappen: ten eerste, het verzamelen van exsudaat van de wortel van de aardappel onder steriele omstandigheden. Vervolgens uittreksel kwalitatief hoogwaardige RNA van bacteriecellen behandeld met exsudaat van de wortel. De laatste stap is de analyse van de gegevens met behulp van de web gebaseerde T-REx pijpleiding14. Dit protocol werd gebruikt voor het identificeren van B. mycoides genen die tonen een verschuiving in expressie niveaus bij contact met exsudaat van wortel en aldus een belangrijke rol kunnen spelen in plant-microbe interacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. het ontkiemen van aardappel in gesteriliseerde voorwaarden
- Spoel het oppervlak van de aardappel met steriel water. Baad de aardappel in 70% ethanol en 3% natriumhypochloriet, voor elke 5 min. Spoel het weer met steriel water te verwijderen van alle resterende natriumhypochloriet.
- Bereiden van de materialen die nodig zijn voor het ontkiemen en groeien aardappelknollen; de plastic potten, engraftment manden, vermiculiet, steriliseren en water in autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten.
Opmerking: Zorg ervoor dat alle gebruikte materialen autoclaaf zijn. Anders, andere steriliserende methoden gebruiken. - Zet de aardappel oppervlak-gesteriliseerd in de mand van de engraftment, en plaats dit in een gesteriliseerde met autoclaaf pot met vochtige vermiculiet.
- Houd de pot in een klimaat kamer bij 24 ° C gedurende drie weken. Zet deze dan op de cycli van 16 h van licht (120 µmol m-2s-1) en 8 h van duisternis. Om te voorkomen dat microbiële verontreinigingen, door een grote glazen vezel vak te gebruiken ter dekking van de pot.
2. het verzamelen van exsudaat van de wortel van de aardappel
- Wanneer de scheuten stronk, transfer de mand met de hele aardappel in een gesteriliseerde bekerglas gevuld met 150 mL gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water, met de aardappel knollen geplaatst net boven het wateroppervlak en de wortels in het water ondergedompeld (Zie Figuur 1). Houd de zaailing in de zaal van het klimaat, en dezelfde instellingen gebruiken als voorheen [24 ° C; cycli van 16 h van licht (120 µmol m-2s-1), 8 h van duisternis].
- Vanaf de tweede dag, het water met het exsudaat verzamelen en vullen van het bekerglas af met steriel gedeïoniseerd water. De bemonstering uit te voeren elke dag tot de zevende dag na het overbrengen van de zaailing.
- Opslaan van elk monster afzonderlijk bij 4 ° C. Voor elk monster, verspreid 100 µL op een Luria-Bertani (LB; 1% trypton, gistextract 0,5%, 0,5% NaCl) agarplaat om te controleren op microbiële verontreinigingen. Gooi de verontreinigde monsters.
- Combineer de verzamelde monsters van een zaailing, en concentreren ze door hen te vriesdrogen bij-40 ° C tot een eindvolume van 150 mL.
3. de groeiende bacteriën
- Strijk een stam van B. mycoides uit een voorraad van glycerol-80 ° C op een bord van de agar LB, en na een nacht bebroeden de plaat bij 30 ° C.
- Inoculeer een opgietvloeistof LB met een één kolonie van de plaat, en groeien van de cultuur in een schudden incubator bij 200 rpm's nachts bij 30 ° C.
4. behandeling en bemonstering van bacteriën
- Bereid een reeks van maatkolven met 50 mL LB opgietvloeistof om te vergelijken de groeikromme van de bacteriën die met exsudaat van de wortel getrakteerd op een negatieve controle. Voeg 0,5 mL van de overnachting bacteriecultuur toe aan alle kolven en 0%, 5%, 10% of 15% (v/v) wortel afgescheiden of steriel gedeïoniseerd water toevoegen aan het medium, respectievelijk.
- Een cultuur met gedeïoniseerd water in plaats van wortel exsudaat als een besturingselement gebruiken. Meten van de extinctie op 600 nm (OD600) elke 1 h daarna. Genereer een groeicurve door het uitzetten van de OD600 waarden tegen de tijd.
Opmerking: We zagen dat 10% van de wortel exsudaat niet de groei van B. mycoides beïnvloedde (Zie Figuur 2); deze verhouding was gebruikt voor RNA-seq experimenten. - Verdun een overnachting B. mycoides cultuur met 90 mL voorverwarmde LB middellange tot de eerste OD600 van ~ 0.05 in een kolf van 300 mL. Voeg 10 mL van exsudaat van de wortel tot de cultuur en Incubeer het bij 30 ° C gedurende 1 uur.
- Gebruik een 10 mL steriel gedeïoniseerd waterbehandeling als een besturingselement. Verzamelen van cellen uit de cultuur door middel van centrifugeren bij 9000 x g gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, en onmiddellijk bevriezen de pellet in vloeibare stikstof, waarna het bij-80 ° C bewaren tot gebruik.
5. RNA isolatie
Opmerking: Voordat u begint het isolement, bereiden de werkbank, rekken en pipetten door het reinigen met een oplossing van de decontaminatie RNase (Zie Tabel van materialen). Draag handschoenen te allen tijde, en ervoor te zorgen dat alle buizen, tips en oplossingen worden RNase-vrij. Houd altijd de monsters op ijs indien mogelijk.
- 0,1% (v/v) van diethyl-pyrocarbonate (DEPC) toevoegen aan ultrazuiver water (100 µL van DEPC per 100 mL oplossing), meng het goed en houd het bij kamertemperatuur 's nachts. Autoclaaf dit mengsel aan de inactivering van het DEPC na de nachtelijke behandeling. Dit DEPC-behandelde ultrazuiver water ter voorbereiding van de buffer TE gebruiken [10 mM Tris-HCl (pH = 8); 1 mM EDTA] en een oplossing van 10% (m/v) SDS.
- Ontdooi de cel pellets op het ijs en schorten elk in 400 µL van buffer TE (DEPC). Breng de schorsingen in 2 mL schroefdop buizen.
- Meng 300 µL van chloroform-Isoamylalcohol (24:1 v/v) en 300 µL van fenol (zure fenol, RNA rang) en laat het mengsel gedurende 5 minuten staan. Nemen 500 µL van de organische bovenste fase toe te voegen aan de geresuspendeerde cellen. Voeg vervolgens 50 µL van 10% SDS en 0,5 g van glaskralen (0,5 µm) in de buis.
- Sluit de dop stevig en plaatst u de buis in een kraal-molen homogenizer (Zie Tabel van materialen). Het uitvoeren van een 3 × 45 s pulse homogenisering met een interval van 1 minuut op ijs.
- Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 11.000 x g (4 ° C), en de bovenste fase overbrengen in een nieuwe buis.
- Vanuit stap 5.5 500 µL van chloroform-Isoamylalcohol (24:1) toevoegen aan de bovenste fase samen en Centrifugeer het mengsel gedurende 5 minuten bij 11.000 x g (4 ° C).
Opmerking: De volgende stappen werden gewijzigd vanuit de fabrikant instructie van een commerciële glasvezel filter gebaseerde RNA isolatie kit (Zie Tabel van materialen). - 500 µL van de bovenste fase overbrengen in een verse buis, voeg 2 delen (1 mL) voor een buffer lysis/bindende en meng het door het pipetteren omhoog en omlaag.
- Combineer de filter en collectie buizen (uit de RNA isolatie kit) en Pipetteer het mengsel uit stap 5.7 aan de filter-buis. Centrifugeer de buizen voor 15 s bij 8.000 x g en negeren de doorstroming.
- Bereiden van 1,5 mL microcentrifuge buizen met 100 µL van 10 µL van DNase DNase buffer ik en 5 µL van een RNase-remmer (Zie Tabel van materialen). De bereide oplossing mix toevoegen op het filter van de filter-buis en Incubeer het 20-30 min bij 15-25 ° C.
- Voer de stappen wassen volgens de instructie van de fabrikant. Hiermee kunt u dat 50 µL van een buffer elutie elueer de RNA.
- Sla de eluted RNA bij-80 ° C en zet een plastic paraffine film eromheen. Op hetzelfde moment, door een paar microliters van het monster te overbrengen in een tube microcentrifuge 1,5 mL een kwaliteitscontrole uitvoeren.
6. RNA kwaliteitscontrole en Sequencing
- Controleer de RNA met een spectrofotometer microvolume.
Opmerking: De absorptie ratio's op 260/280 moet boven 1.8 en ratio's op 260/230 moet boven ten minste 1,8, bij voorkeur boven 2.0. - Run de gezuiverde RNA in een geautomatiseerde elektroforese instrument met behulp van de analyse van de RNA aanbevelen kit (Zie Tabel van materialen); het RNA integriteit nummer (RIN) moet ten minste boven 7 om verder te gaan.
- Een totaal bedrag van 3 RNA µg per monster te gebruiken voor het genereren van bibliotheken met een RNA-Seq bibliotheek voorbereiding kit (Zie Tabel van materialen) na de aanbevelingen van de fabrikant.
Opmerking: De bibliotheek voorbereidingen waren sequenced op een high-throughput sequencing platform en gekoppeld-einde leest zijn gegenereerd.
7. de data-analyse met behulp van de webgebaseerde pijpleiding T-REx
- Een kwaliteit filteren met behulp van de FASTX-Toolkit versie 0.0.13 wordt uitgevoerd (Phred kwaliteitsscores van > 20). Snijd de rauwe RNA-Seq leesbewerkingen van de sequenties van de adapter met het hulpprogramma Trimmomatic.
Opmerking: Alle downstream analyses werden gebaseerd op schone gegevens met hoge kwaliteit. - Download de B. mycoides ATCC 6462 NCBI genoomdatabase (NCBI toetreding nr.: CP009692.1) en gebruik het als een referentie-genoom voor het toewijzen van de schone leest met behulp van Bowtie2/2.2.3.
- Gebruik HTSeq v0.6.1 om te tellen de leest nummers toegewezen aan elk gen en het leest per kilobase van afschrift per miljoen toegewezen leest (RPKM) van elk gen op basis van de lengte van de graaf van het gen en leest toegewezen aan dit gen.
- Voor de analyse van de gegevens door de T-REx-pijpleiding, de RPKM-tabel te gebruiken als input, evenals drie beschrijvende bestanden: (i) een bestand van de factoren te beschrijven het experiment in factoren, (ii) een contrasten-bestand om te bepalen welke factoren zullen worden vergeleken voor differentiële genexpressie , en (iii) een klassebestand te beschrijven van groepen genen van belang.
Opmerking: De beschrijvende bestanden zijn in.txt formaat. Voorbeelden zijn te vinden op de website van T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Een gedetailleerde instructies voor data-analyse met behulp van de T-REx kan worden gevonden in een eerdere publicatie door de Jong et al. 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plant-geassocieerde micro-organismen kunnen positief beïnvloeden plantengroei en gezondheid. De mechanismen van de complexe interacties tussen planten en hun microbiële symbionten worden echter niet volledig begrepen. Root exsudaat spelen een belangrijke rol bij het reguleren van de activiteit van de rhizobacterial en het gedrag en het is over het algemeen gepostuleerd dat de microbiële kolonisatie van de wortels met de aantrekkingskracht van microben te wortel exsudaat initieert. Het doel van dit werk was te onderzoeken van de reactie van de transcriptomic van rhizobacterial B. mycoides aan aardappel wortel exsudaat. Om te voldoen aan dit, waren aardappelknollen oppervlak gesteriliseerd en ontkiemd in gesteriliseerde met autoclaaf vermiculiet. Vervolgens werden de wortel exsudaat verzameld, zoals afgebeeld in Figuur 1. Om het uitsluiten van de mogelijkheid van het exsudaat van de wortel op het gebied van de bacteriële groei, maximaal 15% van de wortel exsudaat werden toegevoegd aan de B. mycoides cultuur, en geen verandering in de groei werd ontdekt tijdens het meten tijd (Figuur 2). Dus werden de gen expressie wijzigingen waargenomen in deze studie waarschijnlijk niet veroorzaakt door groei-effecten.
Na het verzamelen, het exsudaat van root zijn toegevoegd aan de B. mycoides cultuur bij een verhouding van 10% (v/v) en de bacteriële totaal RNA werd geïsoleerd zoals hiervoor is beschreven. Het RNA werd het vervolgens onderworpen aan een kwaliteitscontrole door een geautomatiseerde elektroforese instrument waarvan de resultaten worden weergegeven in Figuur 3. Figuur 3A en 3B vertegenwoordigen de RNA geïsoleerd van B. mycoides behandeld met exsudaat van de wortel en Figuur 3 c en 3D vertegenwoordigen de RNA geïsoleerd uit de controlegroep. Alle monsters scoorde een RIN waarde boven 9 met twee duidelijke bands die overeenkomt met de 16S en 23S RNA subeenheden, aan te tonen dat kwalitatief hoogwaardige RNA werd verkregen door dit protocol.
Na de voorbereiding van de bibliotheek, werden paar-end leest verkregen met een hoge gegevensdoorvoer sequencing-platform. De ruwe RNA-Seq leest werden bijgesneden uit de adapter sequenties en toegewezen tegen het genoom van de referentie. Van de daaruit voortvloeiende gegevens, werd de RPKM-tabel gegenereerd. De transcriptome analyse werd uitgevoerd met de T-REx-gasleiding. De verhouding intensiteit plot van alle de differentially uitgedrukte genen wordt weergegeven in Figuur 4. Ten opzichte van een besturingselement veroorzaakte de toevoeging van exsudaat van de wortel van de aardappel 715 genen differentieel worden uitgedrukt. Voor degenen, 408 genen waren upregulated en 307 genen waren werden15. De relatieve verandering van enkele van de genen met gewijzigde expressie is vermeld in tabel 1.
Figuur 1: Process scheme van de collectie van aardappel wortel exsudaat. De gebruikte materialen zijn gesteriliseerde met autoclaaf en de kiemkracht wordt uitgevoerd in een kamer van het klimaat. De knollen van de aardappel met gesteriliseerd water wassen en het bad in 2-3% NaOCl voor 5 min. het bad in 75% ethanol voor een andere 5 min. plaats de aardappel in een gesteriliseerde met autoclaaf mand en zet het in een pot met vochtige vermiculiet. Groeien de aardappel in een klimaat-kamer voor 3-4 weken, en dan de mand met de aardappel zaailing overbrengen in een bekerglas. Verzamelen de wortel exsudaat dagelijks en vullen van het bekerglas af met gesteriliseerd water. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: De groeikromme van B. mycoides met verschillende concentraties van exsudaat van de wortel van de aardappel. De spanning EC18 werd gekweekt in een opgietvloeistof LB met de toevoeging van exsudaat van de wortel van de aardappel of steriele H2O. OD600 was gemeten elke 1 h en tegen de tijd uitgezet. Alle groepen tonen een vergelijkbaar groeipatroon, waaruit blijkt dat tot 15% van de wortel exsudaat toevoeging geen significante effecten heeft op de B. mycoides groei. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: RNA kwaliteitscontrole onder het instrument voor geautomatiseerde elektroforese. A en B vertegenwoordigen de RNA geïsoleerd van de B. mycoides behandeld met exsudaat van de wortel en C en D vertegenwoordigen de RNA geïsoleerd uit de controlegroep. Alle RNA monsters tonen twee duidelijke bands overeenkomt met 23S en 16S rRNA en een zwakke 5S rRNA band. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: verhouding intensiteit perceel voor het visualiseren van differentiële genexpressie van RNA-seq monsters van B. mycoides in reactie op aardappel wortel exsudaat. De afbeelding wordt automatisch gegenereerd door T-REx. De x-as het gen expressie niveau vertegenwoordigt, en de y-as vertegenwoordigt de verandering van de vouw log2-getransformeerd. De up - en werden genen hebben positieve en negatieve log2 verhouding waarden. De punten in het gestreepte gebied geven aan genen die niet aanzienlijk boven - of onder-uitgedrukt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Gene tag | Strand | Vouw wijzigen | Aantekening |
| BG05_RS09165 | + | 3.3 | Multidrug efflux eiwit |
| BG05_RS20930 | + | 25.3 | Membraan eiwit |
| BG05_RS10935 | + | 23.3 | stadium III sporevorming eiwit AD |
| BG05_RS08990 | - | 11,8 | sporevorming eiwit |
| BG05_RS16405 | + | 3.9 | IclR familie transcriptionele regelgever |
| BG05_RS24905 | - | 3 | tryptofaan synthase subeenheid alpha |
| BG05_RS24920 | - | 2.3 | indool-3-glycerol fosfaat synthase |
| BG05_RS22255 | - | 27 | acetolactate synthase |
| BG05_RS22250 | - | 6.5 | ketol-zuur reductoisomerase |
| BG05_RS22265 | - | 26.4 | vertakte keten aminozuur aminotransferase |
| BG05_RS18715 | - | 2.8 | pullulanase |
| BG05_RS18040 | + | -9.1 | Kieming eiwit YpeB |
| BG05_RS16930 | + | -4.2 | suiker ABC vervoerder ATP-bindend-proteïne |
| BG05_RS27345 | + | -2.9 | MFS transporter |
| BG05_RS19555 | - | 3,3- | PTS cellobiose vervoerder subeenheid IIB |
| BG05_RS24345 | - | -2.7 | als putrescine importeur |
| BG05_RS22525 | - | -12.4 | cardiolipin synthase |
| BG05_RS15225 | - | 3,3- | Membraan eiwit |
| BG05_RS18475 | + | -5.7 | Membraan eiwit |
| BG05_RS19095 | + | -2.1 | Kieming eiwit |
Tabel 1: Lijst van differentially uitgedrukte genen van een wortel exsudaat-testgroep ten opzichte van een besturingselement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plant-microbe interacties hebben zijn hypothetische nader te bepalen door een fijn afgestemde evenwicht tussen bacteriën en planten. Deze interacties zijn zeer complex en moeilijk te bestuderen in een natuurlijk systeem, die bestaat uit diverse microbiële soorten, potentieel hoedanigheid van consortia. Dit document beschrijft een vereenvoudigde protocol om te bestuderen van de bacteriële reactie op wortel exsudaat onder goed gecontroleerde omstandigheden. Het profiel van de transcriptome van rhizobacteria, bij blootstelling aan wortel exsudaat, verstrekt gedetailleerde informatie over bacteriële aanpassing aan de rhizosfeer niche. Dit wortel exsudaat collectie protocol vereist geen ingewikkelde procedures en gespecialiseerde apparatuur. Echter alle procedures moeten worden uitgevoerd onder strikt steriele omstandigheden en een besturingselement steriliteit moet worden opgenomen. Het is raadzaam om groeien verschillende aardappelknollen parallel en teruggooi van degene die besmet. Wijzigingen kunnen worden aangebracht bij dit protocol als andere plantensoorten worden bestudeerd. Het is belangrijk om het gebruik van een geschikte methode om alle zaden/knollen steriliseren omdat ze in tolerantie voor de te gebruiken ontsmettingsmiddelen toegepast variëren kunnen.
Zodra de wortel exsudaat worden verkregen, moet kwalitatief hoogwaardige RNA worden geïsoleerd uit de bacteriële cellen. Verschillende reagentia en standaardprotocollen die voornamelijk zijn gebaseerd op de fenol/chloroform of TRIzol methode zijn tijdrovende16. De commerciële kits zijn meestal ontworpen voor modelorganismen maar minder gelden voor anderen. Dit RNA-isolatie-protocol die de methode van fenol/chloroform en een RNA isolatie kit combineert ondervangt de nadelen van deze methoden. Bovendien, een kraal-kloppend stap is opgenomen om het homogeniseren B. mycoides cellen die meestal in de planktonische cultuur aggregaat. Potentiële DNA verontreiniging wordt verwijderd door een extra incubatie met DNase vóór elutie. Het hoge aantal RIN impliceert het isolement van intact RNA. Dit protocol is dus vooral efficiënte en tijdbesparende voor milieu bacteriestammen.
Na RNA sequencing, data-analyse wordt uitgevoerd met T-REx, een web-based statistische analyse pijpleiding voor RNA-seq gen expressie gegevens14. Deze pijpleiding is gebruiksvriendelijk, vooral voor biologen zonder uitgebreide bioinformatics kennis. Het invoerbestand is dat de ruwe RNA expressie niveau gegevens, zoals RPKM, aantal fragmenten per kilobase per miljoen toegewezen leest (FPKM), tellingen per miljoen toegewezen leest (CPM) of andere gen expressie eenheden. Dergelijke gen expressie waarde bestanden kunnen worden gegenereerd door de beschikbare instrumenten waaronder SAMtools17, BEDtools18en NGS-Trex19. Om de RNA-seq-analyse uitvoeren, zijn drie andere invoerbestanden nodig. Deze bestanden worden gebruikt voor het definiëren van de factoren die de experimenten en het wordt gerepliceerd, de vergelijkingen tussen de verschillende experimentele omstandigheden, en de groepen van genen van belang beschrijven. Wanneer de input-bestanden zijn geüpload, is de analyseproces duurt slechts een paar minuten.
Meerdere differentially uitgedrukte genen van B. mycoides EC18, wanneer behandeld met exsudaat van de wortel, zijn vermeld in tabel 1. Onder hen, wordt de uitdrukking van verschillende genen coderend voor membraaneiwitten gewijzigd. Genen aan de sporevorming gerelateerde of kiemkracht proces zijn differentially uitgedrukte. De expressie van genen die betrokken zijn bij sporevorming ook veranderingen in B. subtilis als mede gekweekt met rijst zaailingen, omdat root exsudaat de energie die nodig is leveren voor de dynamische groei van bacteriële18 cellen. De expressie van de IclR transcriptionele regulator, die gerelateerd is aan multidrug resistentie en de aantasting van aromatische verbindingen in bodem bacteriën, is upregulated. De IclR schrapping stam van rhizobacteria Klebsiella pneumoniae is de minerale fosfaat solubilisatie, vergeleken met de wild-type stam19afgenomen. Meerdere genen gerelateerd aan metabolisme van aminozuren en synthese worden gestimuleerd, terwijl genen die betrokken zijn in het vervoer van de suiker met inbegrip van een cellobiose PTS transportwagen werden. Dit suggereert dat stam EC18 wellicht een metabole voorkeur voor aminozuren over suikers in de rizosfeer. De functie van de veranderde genen kan verder worden bestudeerd in situ door knock-out of overexpressie mutanten. Kortom kunnen via het protocol beschreven hier een snelle identificatie van een groot aantal potentieel belangrijke bacteriële genen die betrokken zijn in plant-microbe interacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij danken Jakob Viel voor zijn nuttige opmerkingen en suggesties. Wij danken ook Anne de Jong voor zijn hulp bij de analyse van de bio-informatica. Yanglei Yi en Zhibo Li worden ondersteund door de China Scholarship Raad (CSC). Wij danken NWO-Trekweerstand Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) voor hun financiële steun aan de OPK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
- Haichar, F. eZ., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
