Summary
Målet med det protokoll som presenteras här är att studera transcriptomic svar endosphere-isolerade Bacillus mycoides potatis rot exudat. Denna metod underlättar identifiering av viktiga bakteriella gener som är involverade i växt-mikrobinteraktioner och är i princip tillämplig på andra endophytes och växter, med mindre justeringar.
Abstract
Nyttiga växt-associerade bakterier har en viktig roll i att främja tillväxt och förebygga sjukdom hos växter. Tillämpningen av växt tillväxt-främja rhizobacteria (PGPR) som biogödsel eller Agrilus agenter har blivit ett effektivt alternativ till användning av konventionella gödningsmedel och kan öka grödornas avkastning till låg kostnad. Växt-mikrobinteraktioner beror på värd växt-utsöndras signaler och en reaktion härefter av deras associerade bakterier. Men svarar molekylära mekanismer för hur nyttiga bakterier på deras associerade vegetabiliska signaler inte är helt klarlagda. Att bedöma transcriptomic svar bakterier root exudat är en kraftfull metod att bestämma bakteriell genuttryck och förordning under rhizospheric förhållanden. Sådan kunskap är nödvändigt att förstå de underliggande mekanismerna som är involverade i växt-mikrobinteraktioner. Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för att studera transcriptomic svar B. mycoides EG18, en stam som isolerad från potatis endosphere, i potatis rot exudat. Med hjälp av senaste hög genomströmning sekvenseringsteknologi, kan detta protokoll utföras i flera veckor och producerar massiva datamängder. Först, vi samlar in de roten exudat under sterila förhållanden, varefter de läggs till B. mycoides kulturer. RNA från dessa kulturer är isolerade med en fenol/kloroform-metoden kombinerat med ett kommersiella kit och utsattes för kvalitetskontroll av ett automatiserat elektrofores instrument. Efter sekvensering, analys av data sker med rörledningen webbaserade T-REx och en grupp av Differentiellt uttryckta gener har identifierats. Denna metod är ett användbart verktyg för att underlätta nya upptäckter på bakteriell genernas växt-mikrobinteraktioner.
Introduction
Växter kan exsudat upp till 20% av kolet fast under fotosyntesen genom rötter i odlingsbädden1, dvs, den smala zonen av jord nära rötterna. På grund av den högre näringsämnen tillgängligheten är odlingsbädden en lämpliga habitat för olika mikroorganismer, inklusive växt-tillväxt främjande bakterier. De roten exudat innehåller en rad oorganiska föreningar som joner, oorganiska syror, syre och vatten. Men bildas majoriteten av de roten exudat av organiskt material, som kan delas in i lågmolekylära föreningar och hög molekylvikt föreningar. De lågmolekylära föreningarna inkluderar aminosyror, organiska syror, sockerarter, fenolföreningar, fettsyror och en rad sekundära metaboliter. Den höga molekylvikt föreningar består av algblomningen och proteiner2,3. Odlingsbädden mikroorganismer kan använda några av dessa föreningar som energikälla för tillväxt och utveckling. De roten exudat spelar en viktig roll i att forma rhizobacterial gemenskapen eftersom de växtproducerade föreningarna i exudat kan påverka beteendet hos odlingsbädden-associerade bakterier genom som påverkar uttrycket av specifika gener.
Förstå den bakteriella svaren på roten exudat är ett viktigt steg i att dechiffrera växt-mikrob interaktion mekanismer. Växt-mikrobinteraktioner bakteriell svar är produkten av differentiell genuttryck, kan det studeras genom transkriptom analys. Med den här metoden identifieras tidigare studier flera viktiga gener som är involverade i växt-mikrobinteraktioner. I Pseudomonas aeruginosavisat gener involverade i ämnesomsättning, Kemotaxis och typ II sekretion sig svara på sockerbetor rot exudat4. Fläkten et al. 5 studerade transcriptomic profilering av B. amyloliquefaciens FZB42 svar på majs rot exudat. Resultaten visar att flera grupper av gener starkt induceras av de roten exudat, är involverade i metaboliska vägar rör näringsämnen utnyttjande, Kemotaxis, motilitet och icke-ribosomal syntesen av antimikrobiella peptider och polypetider.
Riktigheten i dessa studier bygger på insamling av roten exudat. Även om flera metoder har beskrivit insamling av roten exudat för olika ändamål, de antingen kräver sofistikerade instrument eller utförs inte i välkontrollerade förhållanden6,7,8. Dessutom odlingsbädden-hämmande mikroorganismer kan påverka rot exsudat sammansättning genom att påverka växten cellmembranet permeabilitet och skada roten vävnader, särskilt i fråga om konsortier av mikroorganismer9. När du undersöker den mikrobiella svaren på roten exudat, är det viktigt att använda väl definierade villkor för att undvika förändring av föreningar av andra mikroorganismer10. Dessutom krävs hög kvalitet RNA för RNA-seq baserade transkriptom studier. Dock när man arbetar med icke-modell-bakteriella stammar, har den standard protokoll eller kommersiella kit oftast en låg verkningsgrad på grund av särskilda tillväxt egenskaper eller okända faktorer.
Protokollet beskrivs här verifierades med B. mycoides, som är en grampositiv, sporbildande bakterie Firmicute Kongospråken. Det är allestädes närvarande i odlingsbädden av olika växtarter. Flera växt tillväxt att främja boenden har rapporterats för denna art, inklusive induktion av systematiska motstånd (ISR) i sockerbetor11, hämning av dämpning-off patogenen Pythium för gurka12, liksom kväve fixering i solros odlingsbädden13. Molekylära mekanismer för dess interaktion med en värdväxt är dock inte väl studerat.
Syftet med de experiment som presenteras här är att studera transcriptomic svar endosphere-isolerade B. mycoides potatis rot exudat. Kort sagt, protokollet består av följande steg: först, samla potatis rot exudat under sterila förhållanden. Extrahera sedan högkvalitativa RNA från bakterieceller som behandlats med roten exudat. Det sista steget är dataanalys med hjälp av den webbaserade T-REx pipeline14. Detta protokoll användes för att identifiera B. mycoides gener som visar en förändring i uttrycket nivåer vid kontakt med root-exudat och därmed kan spela en viktig roll i växt-mikrobinteraktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. gror potatis i steriliserade villkor
- Skölj potatis ytan med sterilt vatten. Bada i potatis i 70% etanol och sedan i 3% natriumhypoklorit, för 5 min varje. Skölj igen med sterilt vatten för att avlägsna alla återstående natriumhypoklorit.
- Förbereda material behövs för gror och växer potatisknölar; sterilisera plast krukor, engraftment korgar, vermikulit och vatten genom autoklavering dem vid 121 ° C i 20 min.
Anmärkning: Se till att alla material som används är autoklaverbart. Annars Använd andra sterilisering metoder. - Sätta potatis yta-steriliseras i engraftment korgen och placera detta i en Ånghärdad kastrull innehållande vått vermikulit.
- Förvara potten i en klimatkammare vid 24 ° C i tre veckor. Ställ den på cykler av 16 h av ljus (120 µmol m-2s-1) och 8 h av mörker. Undvik mikrobiell kontamination genom att använda ett stort glas fiber låda för att täcka potten.
2. samla potatis Root exudat
- När de skjuter sprout, överföring korgen med hela potatisen i en steriliserad bägare fylld med 150 mL Ånghärdad avjoniserat vatten, med potatis knölar placeras strax ovanför vattenytan och rötterna nedsänkt i vattnet (se figur 1). Håll plantan i en klimatkammare och använda samma inställningar som tidigare [24 ° C; cykler 16 h av ljus (120 µmol m-2s-1), 8 h mörkrets].
- Från den andra dagen på, samla in vattnet som innehåller exudat och fylla bägaren med sterilt avjoniserat vatten. Utföra provtagning varje dag fram till den sjunde dagen efter överföring plantan.
- Lagra varje prov separat vid 4 ° C. För varje prov, sprida 100 µL på en Luria-Bertani (LB; 1% trypton, 0,5% jästextrakt, 0,5% NaCl) agarplatta att kontrollera mikrobiell kontamination. Kassera kontaminerade proverna.
- Kombinera de insamlade proverna av en Groddplanta, och koncentrera dem genom frystorkning dem vid-40 ° C till en slutlig volym av 150 mL.
3. växande bakterier
- Streak en B. mycoides stam en lagervara glycerol-80 ° C på en LB agarplattan och inkubera plattan vid 30 ° C över natten.
- Inokulera ett LB flytande medium med en enda koloni från plattan, och växa kulturen i en skakande inkubator på 200 rpm övernattning på 30 ° C.
4. behandling och provtagning av bakterier
- För att jämföra tillväxtkurvan av bakterier behandlas med roten exudat till en negativ kontroll, förbereda en serie mätkolvar innehållande 50 mL LB flytande medium. Tillsätt 0,5 mL övernattning bakteriella kulturen till alla kolvar, och lägga till antingen 0%, 5%, 10% eller 15% (v/v) roten exsudat eller sterilt avjoniserat vatten till medium, respektive.
- Använda en kultur med avjoniserat vatten i stället för roten exudat som en kontroll. Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) varje 1 h efteråt. Generera en tillväxtkurva genom plottning OD600 -värdena mot tiden.
Obs: Vi såg att 10% av de roten exudat inte påverkade tillväxten av B. mycoides (se figur 2). Detta förhållande användes för RNA-seq experiment. - Späd en övernattning B. mycoides kultur med 90 mL före värmde LB medium till den inledande OD600 av ~ 0,05 i en 300 mL-mätkolv. Tillsätt 10 mL av roten exudat till kulturen och inkubera det vid 30 ° C i 1 h.
- Använd en 10 mL sterilt avjoniserat vattenbehandling som en kontroll. Samla in celler från kulturen genom centrifugering vid 9 000 x g under 2 minuter vid 4 ° C. Tag bort supernatanten, och omedelbart frysa pelleten i flytande kväve och sedan förvara den vid-80 ° C fram till användning.
5. RNA isolering
Obs: Innan du börjar isolering, förbereder den workbench, rack och pipetter av rengöra dem med en RNase sanering lösning (se Tabell för material). Använd handskar hela tiden, och se till att alla rör, tips och lösningar är RNase-fria. Håll alltid proverna på isen när det är möjligt.
- Lägga till 0,1% (v/v) av dietyleter pyrocarbonate (DEPC) i ultrarent vatten (DEPC 100 µL per 100 mL lösning), blanda väl och förvara det i rumstemperatur över natten. Autoklav blandningen för att inaktivera DEPC efter nattens behandling. Använd denna DEPC-behandlad ultrarent vatten för att förbereda TE bufferten [10 mM Tris-HCl (pH = 8) 1 mm EDTA] och en 10% SDS (w/v) lösning.
- Tina cell pellets på isen och upphäva varje i 400 µL av TE (DEPC) buffert. Över upphängningarna till 2 mL skruvlock rör.
- Premix 300 µL av kloroform-isopentanol (24:1 v/v) och 300 µL av fenol (sura fenol, RNA grade) och låt blandningen stå i 5 min. Ta 500 µL av den organiska övre fasen att lägga till de återsuspenderade cellerna. Sedan Tillsätt 50 µL 10% SDS och 0,5 g av glaspärlor (0,5 µm) i röret.
- Stäng locket ordentligt och placera röret i en pärla-mill Homogenisatorer (se Tabell för material). Utföra en 3 × 45 s puls homogenisering med 1 min intervall på is.
- Centrifugera proverna för 10 min vid 11 000 x g (4 ° C), och överför den övre fasen till en ny tub.
- Tillsätt 500 µL av kloroform-isopentanol (24:1) till den övre fasen från steg 5,5 och centrifugera blandningen för 5 min vid 11 000 x g (4 ° C).
Obs: Följande steg ändrades från tillverkarens anvisning av en kommersiell glas fiber filter-baserade RNA isolering kit (se Tabell för material). - Överföra 500 µL av den övre fasen till en frisk slang, tillsätt 2 volymer (1 mL) av Lys/bindande buffert och blanda genom pipettering upp och ner.
- Kombinera filter och samling rören (från RNA isolering kit) och Pipettera blandningen från steg 5,7 filterröret. Centrifugera rören för 15 s vid 8 000 x g och kassera genomflöde.
- Förbereda 1,5 mL mikrocentrifugrör med 100 µL av DNAS buffert, 10 µL av DNAS jag och 5 µL av ett RNase inhibitor (se Tabell för material). Lägg den beredda lösning mix på filtret i filterröret, och inkubera det i 20-30 min vid 15-25 ° C.
- Utför tvätt steg enligt tillverkarens anvisning. Använd 50 µL av en eluering buffert för att eluera RNA.
- Spara de eluerade RNA vid-80 ° C, och sätta en plast paraffin filma runt den. Samtidigt, att överföra några mikroliter av provet till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör att utföra en kvalitetskontroll.
6. RNA kvalitetskontroll och sekvensering
- Kontrollera RNA med en microvolume spektrofotometer.
Obs: Absorbansen nyckeltal på 260/280 bör vara över 1,8, och nyckeltal på 260/230 bör ovan minst 1,8, helst över 2.0. - Kör den renade RNA i ett automatiserat elektrofores instrument med hjälp av rekommendera RNA analys kit (se Tabell för material); RNA integritet numret (RIN) måste vara minst över 7 för att fortsätta.
- Använda en total mängd 3 µg RNA per prov för att generera bibliotek med en RNA-Seq bibliotek förberedelse kit (se Tabell för material) efter tillverkarens rekommendationer.
Obs: Biblioteket förberedelserna var sekvenserade i en hög genomströmning sekvensering plattform och Parade-end läsningar genererades.
7. data analys med hjälp av webbaserade-Pipeline T-REx
- Utföra en kvalitet filtrering med FASTX-Toolkit version 0.0.13 (Phred kvalitetsresultat > 20). Trimma den råa RNA-Seq läser från adaptern sekvenser med verktyget Trimmomatic.
Obs: Alla efterföljande analyserna baserades på ren data med hög kvalitet. - Ladda ner databasen B. mycoides ATCC 6462 NCBI genomet (NCBI anslutning nr: CP009692.1) och använda den som en referens genomet för kartläggning av den rena läser med hjälp av Bowtie2/2.2.3.
- Användning HTSeq v0.6.1 att räkna läsningar siffrorna mappas till varje gen och läser per kilobase av avskrift per miljon mappade läsningar (RPKM) av varje gen baserat på längd av genen och läser räkningen mappas till denna gen.
- För analysen av data genom rörledningen T-REx, använda tabellen RPKM som input, as well as tre beskrivande filer: (i) en faktorer fil att beskriva experimentet i faktorer (ii) en kontraster fil att definiera vilka faktorer kommer att jämföras för differentiell genuttryck , och (iii) en klassfil att beskriva grupper av gener av intresse.
Obs: De beskrivande filerna är in.txt format. Exempel kan hittas på webbsidan av T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). En detaljerad instruktion för analys av data med hjälp av T-REx kan hittas i en tidigare publikation av de Jong et al. 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Växt-associerade mikroorganismer kan positivt påverka växternas tillväxt och hälsa. Mekanismerna av komplexa interaktioner mellan växter och deras mikrobiell symbionter är dock inte helt klarlagt. Root exudat spelar en viktig roll i reglering av rhizobacterial verksamhet och beteende, och det antas allmänt att mikrobiell kolonisering av rötter inleder med dragningen av mikrober till roten exudat. Syftet med detta arbete var att undersöka transcriptomic svar rhizobacterial B. mycoides till potatis rot exudat. För att uppfylla detta, var potatisknölar yta steriliseras och grodde i Ånghärdad vermikulit. Sedan samlades de roten exudat som visas i figur 1. För att utesluta möjligheten att de roten exudat påverkar bakteriell tillväxt, upp till 15% av de roten exudat lades till B. mycoides kulturen, och ingen förändring i tillväxt upptäcktes under mättiden (figur 2). Således orsakats de gen uttryck förändringar observerades i denna studie inte sannolikt av tillväxt-relaterade effekter.
Efter samlingen, de roten exudat lades till B. mycoides kulturen i förhållandet 10% (v/v), och den bakteriella total-RNA isolerades som tidigare beskrivits. RNA var sedan genomgå en kvalitetskontroll av ett automatiserat elektrofores instrument som resultaten visas i figur 3. Figur 3A och 3B representerar RNA isoleras från B. mycoides behandlas med de roten exudat och figur 3 c och 3D representerar RNA isoleras från kontrollgruppen. Alla prover gjorde ett RIN värde över 9 med två tydliga band motsvarar de 16S och 23S RNA-subenheter, visar att hög kvalitet RNA erhölls av detta protokoll.
Efter biblioteket förberedelse erhölls par-end läsningar med en hög genomströmning sekvensering plattform. Den råa RNA-Seq läser var klippta från adaptern sekvenser och mappas mot sekvensen genome hänvisning. Av uppgifterna som framkommer genererades tabellen RPKM. Transkriptom analys utfördes med rörledningen T-REx. Baserat på intensitet handlingen i alla Differentiellt uttryckta generna visas i figur 4. Jämfört med en kontroll inducerad tillägg av potatis rot exudat 715 gener differentially uttrycks. Av dem, 408 gener uppreglerad och 307 gener var nedreglerade15. Den relativa förändringen av några av generna med förändrad uttryck är listade i tabell 1.
Figur 1: Process system för insamling av potatis rot exudat. Materialen är autoklaveras och grobarhet utförs i en klimatkammare. Tvätta potatis knölen med steriliserat vatten och bad det i 2-3% NaOCl för 5 min. bad det i 75% etanol för en annan 5 min. plats potatis i en Ånghärdad korg och satt det i en gryta innehållande vått vermikulit. Odla potatis i en klimatkammare 3-4 veckor, och sedan överföra korgen med potatis plantan till en bägare. Samla de roten exudat varje dag och fylla bägaren med steriliserat vatten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tillväxtkurvan av B. mycoides med olika koncentrationer av potatis rot exudat. Stammen EG18 odlades i en flytande LB-medium med tillägg av potatis rot exudat eller steril H2O. OD600 var mätt varje 1 h och plottas mot tiden. Alla grupper Visa en liknande tillväxtmönster, vilket tyder på att upp till 15% av roten exudat tillägg har inga signifikanta effekter på B. mycoides tillväxt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: RNA kvalitetskontroll av instrumentet automatiserade elektrofores. A och B utgör RNA isoleras från den B. mycoides behandlas med roten exudat, C och D representerar RNA isoleras från kontrollgruppen. Alla de RNA-proverna visar två tydliga band motsvarar 23S och 16S rRNA och en svag 5S rRNA band. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: baserat på intensitet plot för att visualisera differentiell genuttryck av RNA-seq prover av B. mycoides svar på potatis rot exudat. Siffran genereras automatiskt av T-REx. X-axeln representerar nivån gen uttryck och y-axeln representerar log2-omvandlad fold ändringen. Generna är upp- och nedreglerade har positiva och negativa log2 baserat på värden. Punkterna i området randig anger gener som inte påtagligt över - eller under-uttryckt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Gen tagg | Strand | -Faldig förändring | Anteckning |
| BG05_RS09165 | + | 3.3 | Multidrug efflux protein |
| BG05_RS20930 | + | 25,3 | membranprotein |
| BG05_RS10935 | + | 23,3 | stadium III sporulering protein AD |
| BG05_RS08990 | - | 11,8 | sporulering protein |
| BG05_RS16405 | + | 3.9 | IclR familj transkriptionell regulator |
| BG05_RS24905 | - | 3 | tryptofan-syntas subenhet alpha |
| BG05_RS24920 | - | 2.3 | Indol-3-glycerol fosfat syntas |
| BG05_RS22255 | - | 27 | acetolactate synthase |
| BG05_RS22250 | - | 6.5 | ketol-syra reductoisomerase |
| BG05_RS22265 | - | 26,4 | Grenade aminosyran aspartataminotransferas |
| BG05_RS18715 | - | 2.8 | pullulanase |
| BG05_RS18040 | + | -9,1 | grobarhet protein YpeB |
| BG05_RS16930 | + | -4,2 | socker ABC transportör ATP-bindande protein |
| BG05_RS27345 | + | -2,9 | MFS transportör |
| BG05_RS19555 | - | -3,3 | PTS cellobiose transportör subenhet IIB |
| BG05_RS24345 | - | -2,7 | dimetylsulfat importör |
| BG05_RS22525 | - | -12,4 | kardiolipin syntas |
| BG05_RS15225 | - | -3,3 | membranprotein |
| BG05_RS18475 | + | -5,7 | membranprotein |
| BG05_RS19095 | + | -2,1 | grobarhet protein |
Tabell 1: Lista över Differentiellt uttryckta gener av en rot exudat-behandlade gruppen jämfört med en kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Växt-mikrobinteraktioner har antagit hypotesen för att bestämmas av ett finstämt balans mellan bakterier och växter. Sådana interaktioner är mycket komplexa och svåra att studera i ett naturligt system, som omfattar olika mikrobiella arter, potentiellt egenskap konsortier. Detta dokument beskriver ett förenklat protokoll för att studera den bakteriella svaren på roten exudat under väl kontrollerade förhållanden. Transkriptom profilen för rhizobacteria, vid exponering för roten exudat, ger detaljerad information om bakteriell anpassning till rhizosfären nisch. Detta root exudat samling protokoll kräver inte komplicerade förfaranden och specialutrustning. Men alla procedurer måste utföras under strikt sterila förhållanden och en sterilitet kontroll bör inkluderas. Vi rekommenderar växer flera potatisknölar parallellt och kasta de förorenade. Ändringar kan göras till detta protokoll om andra växtarter studeras. Det är viktigt att använda en lämplig metod för att sterilisera alla frön/knölar eftersom de kan variera i tolerans mot de desinfektionsmedel som tillämpas.
När de roten exudat erhålls, måste högkvalitativa RNA isoleras från bakteriecellerna. Olika reagenser och standardprotokoll som baseras främst på fenol/kloroform eller TRIzol metoden är tidskrävande16. De kommersiella kit är oftast utformade för modellorganismer men är mindre tillämpliga på andra. Detta RNA isolering protokoll som kombinerar metoden fenol/kloroform och ett RNA isolering kit övervinner nackdelarna med dessa metoder. Dessutom ingår en pärla-slog steg att homogenisera B. mycoides celler som normalt aggregerar i plankton kultur. Potentiella DNA föroreningar avlägsnas genom en extra inkubation med DNAS före eluering. Den höga RIN nummer innebär isolering av intakt RNA. Detta protokoll är alltså särskilt effektiva och tidsbesparande för miljömässiga bakteriestammar.
Efter RNA-sekvensering, analys av data utförs med T-REx, en webbaserad statistisk analys rörledning för RNA-seq gen uttryck data14. Denna rörledning är användarvänlig, särskilt för biologer utan omfattande bioinformatik kunskap. Indatafilen är RNA uttryck nivå rådata, såsom RPKM, fragment per kilobase per miljon mappade läsningar (FPKM), räknas per miljon mappade läsningar (CPM) eller andra enheter för uttryck av gener. Sådana gen uttryck värde filer kan skapas av tillgängliga verktyg inklusive SAMtools17, BEDtools18och NGS-Trex19. För att köra den RNA-seq analysen, behövs tre andra indata-filer. Dessa filer används för att definiera de faktorer som beskriver experimenten och replikerar, jämförelser mellan de olika experimentella villkor, och grupperna av gener av intresse. När ingående filerna är uppladdade, tar analysprocessen bara ett par minuter.
Flera Differentiellt uttryckta gener av B. mycoides EG18, när de behandlas med roten exudat, listas i tabell 1. Bland dem ändras uttrycket av flera gener som kodar för membranproteiner. Gener besläktade med sporulering eller grobarhet processen är Differentiellt uttryckta. Uttrycket av gener involverade i sporulering ändras även i B. subtilis när Co odlade med ris plantor, eftersom roten exudat levererar den energi som krävs för den dynamiska tillväxten av bakteriell celler18. Ett uttryck för den IclR transkriptionell regulator, som är relaterade till multidrug motstånd och nedbrytningen av aromatiska föreningar i jordbakterier, är uppreglerad. IclR radering stam av rhizobacteria Klebsiella pneumoniae har minskat den mineraliska fosfat lösbarhet, jämfört med vildtyp stam19. Flera gener besläktade aminosyror metabolism och syntesen stimuleras, medan gener involverade i socker transport inklusive cellobiose PTS transportör är nedreglerade. Detta tyder på att stammen EG18 kan ha en metabolisk preferens för aminosyror över socker i rhizosfären. Funktionen av de förändrade generna kan finnas ytterligare studerade i situ genom att göra knockout eller överuttryck mutanter. Sammanfattningsvis kan protokollet beskrivs här en snabb identifiering av ett stort antal potentiellt viktiga bakteriella gener som är involverade i växt-mikrobinteraktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Jakob Viel för hans hjälpsamma kommentarer och förslag. Vi tackar också Anne de Jong för hans hjälp i bioinformatik analysen. Yanglei Yi och Zhibo Li stöds av Kina stipendium rådet (CSC). Vi tackar NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) för sitt finansiella stöd till OPK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
- Haichar, F. eZ., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
