Summary
O objetivo do protocolo aqui apresentado é estudar a resposta de transcriptomic de endosphere-isolado de Bacillus mycoides exsudados de raiz de batata. Este método facilita a identificação de genes de bactérias importantes envolvidos em interações planta-micróbio e em princípio aplicável a outros fungos endofíticos e plantas, com pequenos ajustes.
Abstract
Bactérias benéficas associadas a planta é um papel importante na promoção do crescimento e prevenção de doenças em plantas. A aplicação (PGPR) rizobactérias promotoras de crescimento da planta como agentes de biofertilizantes ou biocontrole tornou-se uma alternativa eficaz para o uso de fertilizantes convencionais e pode aumentar a produtividade das culturas a baixo custo. Interações planta-micróbio dependem de sinais de planta-secretada de acolhimento e uma reação diante de suas bactérias associadas. No entanto, os mecanismos moleculares de bactérias benéficas como respondem a seus associados de origem vegetal os sinais não são totalmente compreendidos. Avaliar a resposta de transcriptomic de bactérias exsudados de raiz é uma poderosa abordagem para determinar a expressão de gene bacteriano e regulamento sob condições rizosférico. Tal conhecimento é necessário compreender os mecanismos subjacentes envolvidos em interações planta-micróbio. Este artigo descreve um protocolo detalhado para estudar a resposta de transcriptomic de b. mycoides EC18, uma cepa isolada do endosphere a batata, exsudados de raiz de batata. Com a ajuda da recente tecnologia de sequenciamento de alta produtividade, este protocolo pode ser executado em várias semanas e produzem enormes conjuntos de dados. Primeiro, nós coletamos os exsudados de raiz em condições estéreis, após o qual eles são adicionados à b. mycoides culturas. O RNA destas culturas é isolado, usando um método de fenol/clorofórmio, combinado com um kit comercial e submetido a um controlo de qualidade por um instrumento automatizado de electroforese. Após o sequenciamento, análise de dados é executada com o pipeline de T-REx baseado na web e um grupo de genes diferencialmente expressos é identificado. Este método é uma ferramenta útil para facilitar novas descobertas sobre os genes de bactérias envolvidas em interações planta-micróbio.
Introduction
As plantas podem exsudato até 20% do carbono fixado durante a fotossíntese através de raízes para a rizosfera1, ou seja, a zona estreita de solo perto das raízes. Devido à maior disponibilidade de nutrientes, a rizosfera é um habitat adequado para diversos microorganismos, incluindo bactérias promotoras de crescimento vegetal. Os exsudados de raiz contêm uma variedade de compostos inorgânicos como íons, ácidos inorgânicos, oxigênio e água. No entanto, a maioria dos exsudados da raiz é formada por materiais orgânicos, que podem ser divididos em compostos de baixo peso molecular e alto peso molecular de compostos. Os compostos de baixo peso molecular incluem aminoácidos, ácidos orgânicos, açúcares, compostos fenólicos, ácidos graxos e uma matriz de metabólitos secundários. Os compostos de alto peso molecular consistem de mucilagem e proteínas de2,3. Microrganismos da rizosfera podem usar alguns destes compostos como fonte de energia para o crescimento e desenvolvimento. Os exsudados de raiz desempenham um papel importante na formação da comunidade de rhizobacterial, desde que os compostos vegetais produzidos no exsudado podem influenciar o comportamento das bactérias associadas a rizosfera afetando a expressão de genes específicos.
Compreender a resposta bacteriana exsudados de raiz é um passo fundamental em decifrar os mecanismos de interação planta-micróbio. Como a resposta bacteriana às interações planta-micróbio é o produto da expressão gênica diferencial, podem ser estudado pela análise do transcriptoma. Usando esse método, estudos anteriores identificaram vários importantes genes envolvidos em interações planta-micróbio. Em Pseudomonas aeruginosa, genes envolvidos no metabolismo, quimiotaxia e tipo de secreção II foram mostrados para responder a de exsudados de raiz de beterraba4. Ventilador et al. 5 estudou o perfil transcriptomic de b. amyloliquefaciens FZB42 em resposta exsudados de raiz de milho. Seus resultados mostram que, dos genes fortemente induzidos por exsudados da raiz, vários grupos estão envolvidos em vias metabólicas relacionadas com a utilização de nutrientes, quimiotaxia, motilidade e não-ribossomais síntese de peptídeos antimicrobianos e policetídeos.
A precisão desses estudos baseia-se na coleção de exsudados radiculares. Embora vários métodos descreveu a coleção de exsudados radiculares para finalidades diferentes, eles exigem instrumentos sofisticados ou não são executados em condições bem controladas6,7,8. Além disso, microrganismos inibindo a rizosfera podem influenciar a composição do exsudado de raiz, afetando a permeabilidade de membrana da célula de planta e danificar os tecidos da raiz, particularmente no caso dos consórcios de microorganismos9. Ao investigar a resposta microbiana exsudados de raiz, é importante usar bem definidas condições para evitar a alteração dos compostos por outros microorganismos10. Além disso, o RNA de alta qualidade é necessária para RNA-seq baseados em estudos de transcriptoma. No entanto, quando se lida com as estirpes não-modelo-bacteriana, os protocolos padrão ou jogos comerciais geralmente têm uma baixa eficiência devido a fatores desconhecidos ou propriedades especiais de crescimento.
O protocolo descrito aqui foi verificado usando b. mycoides, que é uma bactéria Gram-positiva, formadoras de esporos do filo Firmicute. É onipresente na rizosfera de várias espécies de plantas. Várias propriedades promover crescimento de planta têm sido relatadas para esta espécie, incluindo indução de resistência sistemática (ISR) na beterraba açucareira11, inibição do umedecimento-fora agente patogénico Pythium para pepino12, bem como nitrogênio fixação na rizosfera girassol13. No entanto, os mecanismos moleculares de sua interação com a planta hospedeira não são bem estudados.
O objetivo dos experimentos apresentados aqui é estudar a resposta de transcriptomic de endosphere-isolado b. mycoides exsudados de raiz de batata. Em suma, o protocolo consiste das seguintes etapas: primeiro, recolher exsudados de raiz de batata em condições estéreis. Em seguida, extrai o RNA de alta qualidade de células bacterianas tratadas com exsudados de raiz. A etapa final é a análise de dados usando o web-based T-REx gasoduto14. Este protocolo foi usado para identificar genes de b. mycoides que mostram uma mudança nos níveis de expressão em caso de contacto com exsudados de raiz e, portanto, podem desempenhar um papel importante nas interações planta-micróbio.
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Protocol
1. germinação de batata em condições esterilizadas
- Enxague a superfície de batata com água estéril. Banhar-se a batata em etanol a 70% e, depois, em 3% de hipoclorito de sódio, por 5 min cada. Enxágue novamente com água esterilizada para remover qualquer restante hipoclorito de sódio.
- Preparar os materiais necessários para a germinação e crescimento de tubérculos de batata; esterilizar os potes plásticos, cestas de enxertia, vermiculita e regar em autoclave a 121 ° C por 20 min.
Nota: Certifique-se que todos os materiais utilizados são autoclaváveis. Caso contrário, use outros métodos de esterilização. - Colocar a batata superfície-esterilizados para o cesto de enxertia e colocar isso em um pote esterilizado contendo vermiculita úmida.
- Manter o pote em uma câmara climática a 24 ° C durante três semanas. Defini-lo em ciclos de 16 h de luz (120 µmol m-2s-1) e 8 h de escuridão. Para evitar contaminações microbianas, use uma caixa de fibra de vidro grande para cobrir o pote.
2. recolha de exsudados de raiz de batata
- Quando o broto de brotos, transferência a cesta com a batata inteira para um copo esterilizado preenchido com 150 mL de água destilada esterilizada, com a batata tubérculos colocados logo acima da superfície da água e as raízes submersas na água (ver Figura 1). Manter as mudas em câmara climática e usar as mesmas configurações como antes [24 ° C; ciclos de 16 h de luz (120 µmol m-2s-1), 8 h das trevas].
- A partir do segundo dia, recolher a água que contém o exsudado e volte a encher o copo com água desionizada estéril. Executar a amostragem todos os dias até o sétimo dia após a transferência o seedling.
- Armazenar cada amostra separadamente a 4 ° C. Para cada amostra, espalhar 100 µ l em um Luria-Bertani (LB; triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, 0,5% NaCl) placa de ágar para verificar se há contaminação microbiana. Descarte as amostras contaminadas.
- Combinar as amostras coletadas de um seedling e concentrá-las por liofilização-los a-40 ° C, até um volume final de 150 mL.
3. cultivo de bactérias
- Marcam uma estirpe b. mycoides de um estoque de glicerol-80 ° C em uma placa de ágar LB e incubar a placa a 30 ° C durante a noite.
- Inocular um meio líquido de LB com uma única colônia da placa e crescer a cultura numa incubadora agitando a 200 rpm durante a noite a 30 ° C.
4. tratamento e recolha de amostras de bactérias
- Para comparar a curva de crescimento das bactérias tratadas com exsudados de raiz para um controlo negativo, prepare uma série de frascos contendo 50 mL de meio líquido LB. Adicionar 0,5 mL de cultura bacteriana durante a noite para todos os frascos e adicionar 0%, 5%, 10%, ou 15% (v/v) exsudado de raiz ou deionizada estéril para o meio, respectivamente.
- Use uma cultura com água desionizada, em vez de exsudados de raiz como um controle. Medir a densidade óptica em 600 nm (OD600) cada 1 h depois. Gera uma curva de crescimento plotando os valores de600 OD versus tempo.
Nota: Nós vimos que 10% dos exsudados da raiz não afetou o crescimento de b. mycoides (ver Figura 2); Esta proporção foi usada para experimentos de RNA-seq. - Diluir uma cultura de b. mycoides durante a noite com 90 mL de LB médio pré-aquecido e o OD inicial600 de ~ 0,05 num frasco de 300 mL. Adicionar 10 mL de exsudados de raiz para a cultura e incube a 30 ° C, durante 1 h.
- Use um tratamento de água desionizada estéril 10 mL como um controle. Coletar células de cultura de centrifugação a 9.000 x g por 2 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e imediatamente congelar a pelota em nitrogênio líquido, em seguida, guarde-a-80 ° C até o uso.
5. isolamento de RNA
Nota: Antes de iniciar o isolamento, prepare a bancada, cremalheiras e pipetas, limpá-las com uma solução de descontaminação de RNase (ver Tabela de materiais). Usando luvas de todos os tempos e certifique-se de todos os tubos, dicas e soluções são livre de RNase. Mantenha sempre as amostras no gelo quando possível.
- Adicionar 0,1% (v/v) de pyrocarbonate de dietilo (DEPC) para água ultrapura (100 µ l de DEPC por 100 mL de solução), misture bem e mantê-lo à temperatura ambiente durante a noite. Autoclave a mistura para inactivar o DEPC após o tratamento durante a noite. Use esta água ultrapura DEPC tratada para preparar o buffer TE [10 mM Tris-HCl (pH = 8); 1 mM EDTA] e uma solução de SDS (p/v) de 10%.
- Descongelar as pelotas de célula no gelo e suspender cada um em 400 µ l de tampão TE (DEPC). Transferi as suspensões para tubos de tampa de rosca de 2 mL.
- Premix 300 µ l de álcool de clorofórmio-isoamílico (24:1 v/v) e 300 µ l de fenol (ácido fenol, grau de RNA) e deixe a mistura repousar durante 5 min. Tome 500 µ l da fase orgânica superior para adicionar às células ressuspensa. Em seguida, adicione 50 µ l de SDS 10% e 0,5 g de grânulos de vidro (0,5 µm) no tubo.
- Feche a tampa firmemente e coloque o tubo em um homogeneizador de grânulo-moinho (ver Tabela de materiais). Execute uma homogeneização de pulso 3 × 45 s com um intervalo de 1 min no gelo.
- Centrifugar as amostras por 10 min a 11.000 x g (4 ° C) e transferir a fase superior para um novo tubo.
- Adicionar 500 µ l de álcool de clorofórmio-isoamílico (24:1) para a fase superior da etapa 5.5 e centrifugar a mistura por 5 min a 11.000 x g (4 ° C).
Nota: As etapas a seguir foram modificadas desde as instruções do fabricante de um isolamento de RNA baseado em filtro comercial vidro fibra kit (veja a Tabela de materiais). - Transferir 500 µ l da fase superior para um novo tubo, adicione 2 volumes (1 mL) de um tampão de Lise/vinculação e misture pipetando para cima e para baixo.
- Combinar os tubos do filtro e coleção (do kit de isolamento de RNA) e pipetar a mistura da etapa 5.7 no tubo do filtro. Centrifugar os tubos por 15 s em 8.000 x g e descarte o escoamento.
- Prepare-se 1,5 mL microcentrifuge tubos com 100 µ l de tampão de DNase, 10 µ l de DNase I e 5 µ l de um inibidor de RNase (ver Tabela de materiais). Adicione a mistura de solução preparada no filtro do tubo do filtro e incube-lo por 20-30 min em 15-25 ° C.
- Execute as etapas de lavagem de acordo com as instruções do fabricante. Use 50 µ l de um tampão de eluição para Eluir o RNA.
- Salve o RNA eluted a-80 ° C e coloque um filme plástico parafina em torno dele. Ao mesmo tempo, transferi alguns microlitros de amostra para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para executar uma verificação de qualidade.
6. sequenciamento e a verificação da qualidade do RNA
- Verifique o RNA com um espectrofotômetro microvolume.
Nota: Rácios de absorvância no 260/280 devem estar acima de 1.8 e rácios no 260/230 deve ultrapassar pelo menos 1.8, de preferência acima de 2.0. - Executar o RNA purificado em um instrumento de eletroforese automatizada utilizando a análise de RNA recomendo kit (veja a Tabela de materiais); o número de integridade do RNA (RIN) deve ser pelo menos acima de 7 para prosseguir.
- Usar um montante total de 3 µ g de RNA por amostra para gerar bibliotecas com uma preparação de biblioteca de RNA-Seq kit (veja a Tabela de materiais) seguindo as recomendações do fabricante.
Nota: Os preparativos da biblioteca foram sequenciados em uma plataforma de sequenciamento de alta produtividade e leituras emparelhado-final foram geradas.
7. dados análise usando o T-REx Pipeline baseado na Web
- Realizar uma filtragem de qualidade usando o FASTX-kit de ferramentas versão 0.0.13 (PQV escores de qualidade de > 20). Apare as leituras de RNA-Seq crus de sequências de adaptador com a ferramenta Trimmomatic.
Nota: Todas as análises a jusante foram baseadas em dados limpos com alta qualidade. - Baixar o banco de dados do genoma de ATCC 6462 NCBI b. mycoides (adesão NCBI n º: CP009692.1) e usá-lo como um genoma de referência para mapear o lê limpo usando Bowtie2/2.2.3.
- V0.6.1 de HTSeq de uso para contar o número de leituras mapeados para cada gene e as leituras por quilobase de transcrição por leituras mapeadas milhões (RPKM) de cada gene baseiam no comprimento do gene e leituras Conde mapeado para este gene.
- Para a análise dos dados pelo pipeline T-REx, use a tabela RPKM como entrada, bem como três arquivos descritivos: (i) um arquivo de fatores para descrever a experiência em fatores, (ii) um arquivo de contrastes para definir quais fatores serão comparados para expressão gênica diferencial e (iii) um arquivo de classe para descrever grupos de genes de interesse.
Nota: Os arquivos descritivos são formato de in.txt. Exemplos podem ser encontrados na página Web do T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Uma instrução detalhada para análise de dados usando o T-REx pode ser encontrada em uma publicação anterior por de Jong et al 14.
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Representative Results
Microorganismos associados a planta podem influenciar positivamente crescimento das plantas e a saúde. No entanto, os mecanismos das complexas interações entre plantas e seus simbiontes microbianos não são totalmente compreendidos. Exsudados de raiz desempenham um papel importante na regulação da atividade rhizobacterial e comportamento, e geralmente postula-se que a colonização microbiana de raízes se inicia com a atração de micróbios exsudados de raiz. O objetivo deste trabalho foi investigar a resposta de transcriptomic de rhizobacterial b. mycoides exsudados de raiz de batata. Para cumprir este, tubérculos de batata foram superfície esterilizada e germinadas em vermiculita autoclavada. Então os exsudados radiculares foram coletados como mostrado na Figura 1. A fim de excluir a possibilidade dos exsudados de raiz que afetam o crescimento bacteriano, até 15% de exsudados da raiz foram adicionadas à cultura de b. mycoides , e nenhuma mudança no crescimento foi detectada durante o tempo de medição (Figura 2). Assim, as mudanças de expressão de gene observadas neste estudo não foram provavelmente causadas por efeitos relacionados com o crescimento.
Após a colheita, os exsudados radiculares foram adicionados à cultura de b. mycoides na proporção de 10% (v/v), e o RNA total bacteriano foi isolado como descrito anteriormente. O RNA, em seguida, foi submetido a um controlo de qualidade por um instrumento automatizado de electroforese de que os resultados são mostrados na Figura 3. Figura 3A e 3B representam o RNA isolado do b. mycoides tratados com os exsudados de raiz e Figura 3 e 3D representam o RNA isolado do grupo controle. Todas as amostras marcaram um valor RIN acima de 9 com duas bandas claras correspondente para as subunidades de RNA 16S e 23S, demonstrando que o RNA de alta qualidade foi obtida por este protocolo.
Após a preparação da biblioteca, leituras de par-final foram obtidas com uma plataforma de sequenciamento de alta produtividade. As leituras de RNA-Seq crus foram cortadas das sequências de adaptador e mapeadas contra a sequência do genoma de referência. Dos dados resultantes, foi gerada a tabela RPKM. A análise do transcriptoma foi realizada com o pipeline de T-REx. O enredo de intensidade de relação de todos os genes diferencialmente expressos é mostrado na Figura 4. Em comparação com um controle, a adição de exsudados de raiz de batata induzido 715 genes diferencialmente expressos. Desses, 408 genes foram upregulated e 307 genes foram ativador15. A mudança relativa de alguns dos genes com expressão alterada está listada na tabela 1.
Figura 1: esquema de processo da coleção de exsudados de raiz batata. Os materiais utilizados são esterilizados em autoclave e a germinação é executada em uma câmara climática. Lave os tubérculos de batata com água esterilizada e banho-lo em 2-3% de hipoclorito por 5 min. de banho em 75% de etanol para min. 5 outro lugar a batata em uma cesta autoclavada e colocá-lo em um pote contendo vermiculita úmida. Crescer a batata em uma câmara climática para 3-4 semanas e depois transferir o cesto com o seedling de batata para um copo. Recolher os exsudados de raiz todos os dias e encher o copo com água esterilizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A curva de crescimento de b. mycoides com diferentes concentrações de exsudados de raiz de batata. a tensão EC18 foi cultivada em meio líquido LB, com a adição de exsudados de raiz de batata ou estéril H2O. OD600 foi medido a cada 1h e plotada versus tempo. Todos os grupos mostram um padrão de crescimento semelhante, indicando que até 15% de adição de exsudados da raiz não tem significativos efeitos sobre o crescimento de b. mycoides . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: verificação da qualidade do RNA pelo instrumento automatizado eletroforese. A e B representam o RNA isolado da b. mycoides tratado com exsudados radiculares, C e D representar o RNA isolado do grupo controle. Todas as amostras de RNA mostram duas bandas claras correspondente 23S e 16S rRNA e uma banda de ARNr 5S fraco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: trama de intensidade de relação para poder visualizar a expressão diferencial do gene de amostras de RNA-seq de b. mycoides em resposta exsudados de raiz de batata. A figura é gerada automaticamente pelo T-REx. O eixo x representa o nível de expressão do gene, e o eixo y representa a variação de dobra log2-transformadas. Os genes, sendo o montante e ativador têm valores de proporção log2 positivos e negativos. Os pontos na área listrada mostram genes que não são significativamente mais - ou sob-expresso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Marca de gene | Strand | Dobre a mudança | Anotação |
| BG05_RS09165 | + | 3.3 | proteína de efluxo multidrogas |
| BG05_RS20930 | + | 25,3 | proteína de membrana |
| BG05_RS10935 | + | 23.3 | fase da proteína de esporulação III AD |
| BG05_RS08990 | - | 11,8 | proteína de esporulação |
| BG05_RS16405 | + | 3.9 | IRCT família regulador transcricional |
| BG05_RS24905 | - | 3 | Alfa de subunidade do triptofano sintase |
| BG05_RS24920 | - | 2.3 | indol-3-glicerol fosfato sintase |
| BG05_RS22255 | - | 27 | acetolactato sintase |
| BG05_RS22250 | - | 6.5 | ketol-ácido reductoisomerase |
| BG05_RS22265 | - | 26,4 | aminoácidos de cadeia ramificada aminotransferase |
| BG05_RS18715 | - | 2.8 | pullulanase |
| BG05_RS18040 | + | -9.1 | proteína de germinação YpeB |
| BG05_RS16930 | + | -4,2 | ABC transporte ATP-proteína obrigatória do açúcar |
| BG05_RS27345 | + | -2.9 | Transportador MFS |
| BG05_RS19555 | - | -3.3 | Subunidade de transportador de celobiose PTS IIB |
| BG05_RS24345 | - | -2.7 | importador de putrescina |
| BG05_RS22525 | - | -12.4 | sintase de cardiolipina |
| BG05_RS15225 | - | -3.3 | proteína de membrana |
| BG05_RS18475 | + | -5,7 | proteína de membrana |
| BG05_RS19095 | + | -2.1 | proteína de germinação |
Tabela 1: Lista de genes diferencialmente expressos de um grupo de tratados de exsudados de raiz em comparação com um controle.
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Discussion
Interações planta-micróbio tem sido a hipótese de ser determinado por um equilíbrio afinado entre bactérias e plantas. Tais interações são altamente complexas e difíceis de estudar em um sistema natural, que é composto por diversas espécies microbianas, potencialmente atuando como consórcios. Este artigo descreve um protocolo simplificado para estudar a resposta bacteriana exsudados de raiz em condições bem controladas. O perfil do transcriptoma de rizobactérias, após a exposição exsudados de raiz, fornece informações detalhadas sobre adaptação bacteriana para o nicho de rizosfera. Este protocolo de coleção de exsudados de raiz não exige procedimentos complicados e equipamentos especializados. No entanto, todos os procedimentos devem efectuar-se sob condições estritamente estéreis e um controle de esterilidade deve ser incluído. Recomendamos crescendo vários tubérculos de batata em paralelo e descartando os contaminados. Modificações podem ser feitas para o presente protocolo se outras espécies de plantas estão sendo estudados. É importante usar um método adequado para esterilizar qualquer sementes/tubérculos, porque eles podem variar em tolerância para os desinfetantes aplicados.
Uma vez obtidos os exsudados de raiz, RNA de alta qualidade deve ser isolado das células bacterianas. Vários protocolos padrão que baseiam-se principalmente sobre o fenol/clorofórmio ou método de TRIzol e reagentes são demorados16. Os kits comerciais destinam-se principalmente de organismos-modelo, mas são menos aplicáveis aos outros. Este protocolo de isolamento de RNA que combina o método de fenol/clorofórmio e um kit de isolamento de RNA supera as desvantagens destes métodos. Além disso, um passo de grânulo batendo é incluído para homogeneizar as células b. mycoides normalmente agregam na cultura planctônica. Potencial de contaminação de DNA é removido por uma incubação extra com DNase antes da eluição. O elevado número RIN implica o isolamento do RNA intacto. Assim, este protocolo é especialmente eficiente e economia de tempo para estirpes bacterianas ambientais.
Após o sequenciamento de RNA, análise de dados é executada com o T-REx, um gasoduto de análise estatística baseada em web para14dados expressão do gene do RNA-seq. Esse pipeline é fácil de usar, especialmente para os biólogos sem conhecimento extensivo de Bioinformática. O arquivo de entrada é que fragmentos de RNA expressão nível dados brutos, tais como RPKM, por mil por milhão leituras mapeadas (FPKM), contagens por milhão leituras mapeadas (CPM), ou outras unidades de expressão do gene. Esses arquivos de valor de expressão de gene podem ser gerados por ferramentas disponíveis, incluindo SAMtools17BEDtools18e NGS-Trex19. Para executar a análise de RNA-seq, são necessários três outros arquivos de entrada. Esses arquivos são usados para definir os fatores que descrevem as experiências e as repetições, as comparações entre as várias condições experimentais e os grupos de genes de interesse. Quando os arquivos de entrada são carregados, o processo de análise só vai levar alguns minutos.
Diversos genes diferencialmente expressos de b. mycoides EC18, quando tratados com exsudados de raiz, estão listados na tabela 1. Entre eles, a expressão de vários genes que codificam proteínas de membrana é alterada. Genes relacionados com a esporulação ou processo de germinação são diferencialmente expressos. A expressão de genes envolvidos na esporulação também muda em b. subtilis quando co cultivadas com mudas de arroz, porque exsudados de raiz fornecem a energia necessária para o crescimento dinâmico da bacteriana células18. A expressão do IRCT regulador transcricional, que está relacionada com multirresistência e a degradação de compostos aromáticos em bactérias do solo, é upregulated. A cepa de exclusão IRCT de rizobactérias Klebsiella pneumoniae diminuiu a solubilização de fosfato mineral, em comparação com a estirpe selvagem-tipo19. Vários genes relacionados à síntese e metabolismo de aminoácidos são estimulados, enquanto os genes envolvidos no transporte de açúcar, incluindo um transportador PTS celobiose são ativador. Isto sugere que estirpe EC18 podem ter uma preferência metabólica de aminoácidos sobre açúcares na rizosfera. A função dos genes alterados pode ser mais estudados em situ , tornando o nocaute ou superexpressão mutantes. Em resumo, o protocolo descrito aqui permite uma identificação rápida de um grande número de genes de bactérias potencialmente importantes envolvidos em interações planta-micróbio.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Agradecemos Jakob Viel seus comentários úteis e sugestões. Agradecemos também a Anne de Jong por sua ajuda na análise bioinformática. Yanglei Yi e Zhibo Li são suportados pelo Conselho de bolsa da China (CSC). Agradecemos a NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) pelo apoio financeiro ao OPK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
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