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Summary
여기 장 장벽 위반 후 박테리아에서 파생 된 화합물의 입구를 모방 하는 프로토콜 제공 됩니다. Lipopolysaccharide sublethal 저용량 24 h 후 주입에 대 한 모니터링 했다 생쥐에 체계적으로 주입 했다. 프로 염증 성 cytokines의 표정은 비장, 간, 그리고 콜론에서 여러 시간 지점에서 결정 되었다.
Abstract
장 상피 방 벽에서 일반적으로 용납 되거나 무시 되는 microbiota 호스트를 구분 합니다. 이 방 벽의 위반 호스트, 호스트 순환 및 통제 염증으로 선 동적인 장 질병 (IBD), 환자에서 관찰 선도 하는 내부 장기로 세균 이나 박테리아 파생 제품의 입구에 발생 하는 증가 창 자 상피 침투성에 의해 특징.
호스트에 박테리아에서 파생 된 화합물의 입구를 모방 하는 endotoxemia 모델 어떤 lipopolysaccharide (LPS), 그램 음성 박테리아의 외부 세포 벽의 구성 요소에서에서 채택 되어, 쥐로 주입 했다. 이 연구에서 LPS의 sublethal 복용량 intraperitoneally 주사 하 고 쥐 8 h 질병의 점수를 사용 하 여 연속적으로 감시 되었다. 또한, 염증 성 cytokines Il6, Il1b, 및 Tnfa 의 수준을 다른 시간 지점에서 정량 하 여 비장, 간 및 콜론에 분석 되었다 식 LPS 주입 게시. 이 모델은 미생물 또는 신체 표면의 장벽 위반으로 인 한 세균성 파생 제품의 침공 후 면역 반응의 조사를 포함 하는 연구에 대 한 유용할 수 있었다.
Introduction
인간의 소장 진화 하는 동안 호스트와 상호 유익한 관계를 개발 했다 누가 microbiota을 형성 하는 미생물의 큰 컨소시엄 식민지 이다. 이 관계에서 호스트가 합니다 보안 틈새를 microbiota는 microbiota 비타민, 영양소 소화 및 병원 체에서 보호는 microbiota 있는1호스트를 제공 하는 반면. 호스트와는 microbiota 사이이 유익한 관계를 방해 하는 경우 질병을 개발할 수 있습니다, 선 동적인 장 질병 (IBD). IBD은 두 가지 주요 형태, Crohn의 질병 (CD) 및 궤 양성 대 장 염 (UC)에서 발생 하는 유전과 환경 요인에 의해 발생 하는 장의 multifactorial 만성 염증 성 질병 이다. 두 IBD 형태 사이의 유사성에도 불구 하 고 그들은 위치와 염증 성 수정의 성격에서 특정 차이 특징 이다. CD 동안 UC 비 과거 이며, 콜론으로 소화 관의 어느 부분에 잠재적으로 확장할 수 있는 재발 과거 염증 성 질환 이다. 또한, 돌연변이 뉴클레오티드 바인딩 oligomerization 도메인에 포함 된 단백질 2 (NOD2), 패턴 인식 수용 체 (PRR) muramyl dipeptide (민주당), 가장 그람 양성 및-부정적인 박테리아의 세포 벽의 구성 요소를 인식 하는 CD2와 관련 된. 또한, 대장균 (대장균), Listeria 및 Streptococci 와 그들의 제품 모두 찾아냈다 세포 내 장벽을 위반3후 호스트를 입력 CD 환자에. 박테리아 또는 그들의 제품 CD의 개발 하는 동안 호스트를 입력, 면역 시스템 항균 항 체4순환의 생산에 지도 하는 응답을 개발 한다. 어쩌면, IBD의 병 인에서 microbiota의 역할에 대 한 가장 설득력 있는 증거는 마우스 모델에서 유래한 다. 동물 항생제로 처리 됩니다 또는 마우스 세균 무료 (GF) 조건에서 보관 하는 경우, 질병의 심각도 IL-10-/-생쥐에서 GF 시설5,6대 장 염을 개발 하지 않는 그와 같은 대부분의 대 장 염 모델에서 감소 된다. 또한, 대 장 염도 불균형 구성 특징 이다 고 dysbiosis7라고 하는 부유를 감소 microbiota의 구성을 방해. IBD의 결과 미생물 및 미생물에서 파생 된 제품의 입구는 호스트에 될 수 있는 증가 창 자 침투성을 될 수 있습니다.
동물, 응용 Dextran 황산 나트륨 (DSS)의 상피 장벽은8의 증가 한 침투성을 선도 하는 장 상피 위반을 유도 합니다. 포털 LPS 농도 DSS colitis9동물에서 상승 된. 흥미롭게도, 동물 부족 C 유형 lectin 수용 체 특정 세포내 접착 분자-3 nonintegrin를 잡는 체 관련 1 (로그인-R1)는 보호 DSS colitis 및 LPS 유발 endotoxemia10에서. 호스트에 추가 보급, 세균 이나 박테리아 파생 제품 혈관 장벽11, 크고 작은 창 자 위치는 복 막 구멍, mesenteric 임 파선 또는 간12를 통과 해야 합니다. 이 시스템의 복잡성을 줄이기 위해, 정의 된 박테리아에서 파생 된 화합물이 사용 되었다. LPS, 복 (i.p.) 또는 정 맥 (i.v.) 후 endotoxemia를 주입13 interleukins Il6 표현 및 Ilb cytokine Tnfa LPS에 대 한 응답에서을 공부 하 고 쥐에 주입 했다.
LPS는 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMP) 지질 A의 구성 된 그람 음성 세균의 세포 벽 구성 요소로 표현 (LPS의 구조에서 주요 PAMP), 코어 올리고 당 및 O를 사이드 체인14. 수용 체 통행세 같이 4 (TLR4) 수지상 세포, 대 식 세포, 상피 세포에 의해 표현 LPS15, 적절 한 바인딩을 위한 공동 수용 체 필요한 인식 합니다. 급성 위상 단백질 LPS-바인딩 단백질 (LBP) 전송 LPS 차별화 14의 클러스터 (CD14), glycosylphosphatidylinositol 고정 막 단백질 복잡 한 형태로 LPS 바인딩합니다. CD14 더 LPS 림프 구 항 원 96 또는 라고도 MD 2 셔틀 TLR4의 세포 외 도메인 관련 됩니다. MD-2 LPS의 바인딩 TLR4/MD-2의 세포내 어댑터 분자는 하류 신호 통로14, 골수성 차별화 기본 포함 활성화를 모집 하는 구조적 변화를 유도 이합체 화를 용이 하 게 응답 유전자 88 (MyD88)-종속 통로는 사격 포함 하는 도메인 어댑터 유도 인터페론-β (TRIF)-종속 통로16. LPS TLR4에 의해의 인식 다음 NF κB 통로 활성화 하 고 TNFα, 일리노이-6와 일 1β17proinflammatory cytokines의 표정을 유도 한다.
특히, LPS는 동물, 동물, 주어진 LPS의 농도에 주입 하는 경우는 동물 및 다이어트의 유전 배경 간주 있다. 부패 시키는 충격, 저 혈압 및 다 수 기관 실패, 특징 이끌어 낸다 LPS의 높은 농도 그리고 마지막으로 죽음18. 마우스는 덜 민감한 LPS 인간에 비해 2-4 ng/kg 체중 (BW) 사이 LPS 농도 cytokine 폭풍19유도 수 있습니다. 마우스, 치 사 량 (LD50) 쥐 에서부터 사용 마우스 스트레인에 따라 10-25 mg/kg BW20 의 죽음을 유도 일반적으로 사용 되 마우스 긴장, C57Bl/6와 BALB/c에 대 한 치 사 량 50% (LD50)은 10 mg/kg BW. 반면, C3H/HeJ 및 C57BL/10ScCr 긴장 하 Tlr421돌연변이 유도 LPS endotoxemia에서 보호 됩니다. 따라서, Tlr4 불충분 한 쥐 hyporesponsive LPS22에 주사 하는. PARP1/마우스23 같은 다른 유전자 변형된 마우스 라인은 LPS 유발 독성 쇼크에 저항 한다.
마우스 모델 설명 여기 모방 신체의 표면의 장벽 위반 후 LPS 보급의 결과를 체계적으로 관리 하는 LPS의 sublethal 복용량을 사용 합니다. C56Bl/6 생쥐에서 사망 하지만 프로 염증 성 cytokines의 유도 방출을 선택한 LPS 농도 (2 mg/kg BW) 유도 하지 않았다.
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Protocol
마우스 사육 되었고 조건 하에서 특정 병원 체 무료 (SPF) 동물 시설에서 의학의 부, 바젤의 대학 (바젤, 스위스)의 유지. 모든 마우스 실험은 스위스 연방 및 Cantonal 규정 (동물 프로토콜 번호 2816 [구획의 바젤-스타트]) 수행 했다.
1입니다. LPS 솔루션의 준비
- 대장균 살 균 조건 하에서 0111:B4에서 순화 LPS의 주식 열고 5 mg/mL의 농도에 물에 그것을 다시 구성 합니다.
- 0.2 µ g / µ L의 작업 집중에 버퍼링 하는 멸 균 인산 염 분 (PBS)와 LPS 재고 희석.
2. 복 사출 마우스에 LPS의
- 0.5 mL 주사기에 층 류 기류에 30 G 바늘 솔루션 작업 LPS 발음
- 여성 C57Bl/6 마우스의 나이 10 주 (6) 무게와 주입 됩니다 LPS의 양을 계산: 10 µ L (2 µ g) /g 몸 무게.
참고: 예를 들어 마우스 무게 20 g, 다음 20 g x 10 µ L = 200 µ L LPS를 주입 해야 솔루션을 작업. - 부드럽게 하지만 단단히 마우스를 처리 하 고 한 손으로에서 동물을 제 지. 동물 수 일반적으로 호흡을 하지만 하지 트위스트 감 중 설정 인지 확인 합니다.
- 마우스 코를 주입에 대 한 복 부를 노출 바닥 쪽으로 약간 기울기. 왼쪽 또는 오른쪽 중간 선에서 낮은 복 부에 복 부와 주입 장소의 중간을 찾습니다. 컨트롤 마우스에 LPS 대신 i.p. PBS를 삽입할.
- 자유 재량으로 적절 한 볼륨 (볼륨 단계 2.2에서에서 계산) 주입 작업 솔루션 LPS의. 바늘 입력 했습니다 복 막 구멍으로 그렇지 않으면 복 부 근육 층에 잘못 주사 발생할 수 있는지 확인 합니다. 아직도, 이동 하지 마십시오 너무 깊이 바늘과 그 지역에 있는 내부 장기 부상 방지에 복 막 구멍으로.
- 감 금 소 당 최대 5 마우스 케이지를 신중 하 게 동물을 반환 합니다.
3입니다. 모니터는 쥐
- 발생과 endotoxemia의 심각도 대 한 8 h에 대 한 주입 후 주입 및 모든 2 h의 시간에 동물을 모니터링 합니다. 따라서, 이전에 게시 원고 24에서 적응 된 점수 시트 (표 1)를 사용 하 여.
-
표 1에 나열 된 다음 매개 변수에 대 한 LPS 주입 된 쥐를 점수
- 일반적으로 부드러운 모피의 모양을 확인 합니다. 모피 뻗 치고, 칼 날 달린 푹신한 모피 불편 하거나 통증을 나타내는 경우, 1, 2, 또는 3 그들을 점수.
- 마우스의 활동에 대 한 확인 합니다.
참고: 마우스 일반적으로 이동 자유롭게 먹고, 마시고, 등반, 전체 케이지 하지만 억제 또는 제한 된 활동 통증의 징조 수 있습니다. - 의식의 수준에 대 한 확인 하십시오.
참고: 마우스는 매우 호기심, 그리고 그들은 일반적으로 주변 조사 케이지 주위에 이동. 부족 또는 감소 운동 통증과 불편을 건의 할 수 있다. - 눈을 확인 하십시오.
참고: 건강 한 쥐에 완전히 열린 눈으로 예상 된다 하지만, 분 비, 가능 하 게 부분적으로 또는 완전 하 게 닫힌된 눈 통증의 표시 될 수 있습니다. - 호흡 속도를 확인 합니다.
참고: 건강 마우스 일반적으로 정상적이 고 급속 한 호흡 속도, 감소 된 호흡 속도 불편의 표시 될 수). - 호흡 품질에 대 한 확인 하십시오.
참고: 함께 또는 없이 헐 떡이 고 심한 흔적이 호흡 고통의 표시 이다.
4. 조직 샘플링 Ribonucleic 산 (RNA) 추출 및 균질 화
- 컬렉션/균질 튜브 준비: 추가 1 mL 단일 단계 RNA 격리 시 약 2 mL 튜브에 prefilled 1.4 m m 세라믹 분야와 함께.
- 적절 한 시간에 ((0 h) 전에 2 h, 4 h와 LPS 주입 후 8 h) exsanguination 뒤 마 취 과다 복용 (isoflurane)와 마우스를 안락사와 해 부와 함께 진행.
- 피부와 내부 장기와 복 부 구멍이 함께 노출 근육 레이어 컷.
- 조심 스럽게 비장, 간, 그리고 결 장 해 부, 지방에서 장기를 청소 하 고 얼음에 PBS에서 그들을 유지.
- 가 위 또는 메스를 사용 하 여 각 기관에서 작은 조각 (약 0.5 cm 긴) 그만.
참고: 그것은 항상 각 마우스 (간, 근 위 또는 원심 부분의 결 같은 엽)에 오르간의 대략 동일한 부분에서 조각을 하는 것이 중요. - 곧 건조 한 종이 티슈의 조각에 조직 및 RNA 격리 시에 완전히 몰입 확인 하 고 컬렉션/균질 튜브에.
- 고속 벤치탑 균질 화기에 조직 균질 비장, 간, 그리고 콜론 균질의 1 개 주기에서 사용 속도 6.00 30 같은 부드러운 조직에 대 한 s.
- 실 온에서 5 분에 대 한 샘플을 품 어.
- 신중 하 게 장소를 액체 질소에 튜브 동결 조직 lysate. RNA 분리까지 lysate-80 ° C에서 냉동 스냅을 저장 합니다.
5. 조직에서 RNA 추출
참고: RNA 격리 시 약, 클로 프롬, 및 알콜 유해 물질로 간주 됩니다. RNA 추출 화학 후드 수행 합니다. RNase 없는 환경을 유지 하기 위해 인증 RNase 무료 시 약 및 장비를 사용 합니다.
-
상 분리
- 냉동된 조직 lysate 얼음에 녹여
- 1000 x g 남아 있을 수 있습니다 남아 있는 조직 입자를 펠 렛을 4 ° C에서 5 분에 샘플 원심
- 새로운 nuclease 무료 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송.
- 200 µ L 얼음 클로 프롬 / 1 mL RNA 격리 시 약을 추가 하 고 10-15 s 손으로 적극적으로 악수.
- 실 온에서 2-3 분 동안 품 어.
- 12에서 원심 분리기, 4 ° c.에 15 분 동안 000 x g
참고: 샘플 이제 3 단계 포함 됩니다: 빨간색 페 놀-클로 프롬 위상과 interphase, 상단 무색 수성 단계 낮은. RNA는 위 수성 단계에 존재. - 위 수성 단계 (총 볼륨의 50%)와 전송 새로운 nuclease 무료 1.5 mL 튜브에 수집 합니다.
-
RNA 강 수
- 1 mL RNA 격리 시 당 0.5 mL 얼음 처럼 차가운 소 프로 파 놀을 추가 하 고 반전 튜브 5-6 번으로 부드럽게 혼합.
- 실 온에서 10-15 분 동안 품 어.
- 4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기
참고: RNA 펠 릿이이 단계에 표시 됩니다.
-
RNA 펠 릿의 세척
- 완전히 제거는 펠 렛을 방해 하지 않고는 소 프로 파 놀을 포함 하는 상쾌한.
- 1 mL RNA 격리 시 약 사용 초기 세포 당 1 mL 차가운 75% 에탄올과 펠 릿을 세척.
- 짧게 샘플 소용돌이입니다.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 원심 분리기 7500 (12000) x g에서 샘플
-
RNA를 용 해
- 완전히는 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한에 에탄올을 제거 합니다.
- 3-5 분 실 온에서 RNA 펠 릿 건조 화학 후드 아래 열린된 관 두고 (-건조 하지 마십시오 경우 그것은 RNA를 분해 하기 어려운 것으로).
- 신중 하 게 여기저기 pipetting으로 20-50 µ L nuclease 무료 물에 RNA 펠 릿을 디졸브.
- 더는 RNA의 솔루션을 개선 하기 위해 10-15 분 55 ° C에서 샘플을 품 어.
참고:이 단계에서 RNA는 추가 분석까지-80 ° C에 저장할 수 있습니다.
6입니다. 나머지 DNA의 소화
- 분 광 광도 계는 분 광 광도 계에는 약 수 (2 µ l)를 pipetting으로 RNA 농도 측정 하 고 권장된 농도를 조정 합니다.
- Max DNA 오염의 소화를 시작 합니다. 50 µ L nuclease 무료 물에는 10 µ g RNA
- DNase I 버퍼와 1 µ L rDNase 샘플 및 혼합 pipetting으로 부드럽게 나 고 아래로 x 10의 0.1 볼륨을 추가 합니다.
- 20-30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 소용돌이 DNase 비활성화 시 약 0.1 볼륨 피펫으로와 잘 혼합 하는 샘플을 추가 하 고.
- 가끔 손으로 혼합 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 1.5 분 동안 10000 x g에서 원심.
- 상쾌한 새 nuclease 무료 튜브에 RNA DNA 무료 포함 된 전송 합니다.
- 분 광 광도 계에 의해 RNA 농도 품질을 측정 합니다.
7. 반전 녹음 방송
- 반전 녹음 방송에 대 한 상용 Deoxyribonucleic acid cDNA 반전 녹음 방송 (RT) 키트를 사용 합니다.
참고: 여기, RNA의 2 µ g까지 되돌릴 수 있습니다 베낀. - 2 µ g RNA를 포함 하는 볼륨을 계산 합니다. 새로운 PCR 튜브에 2 µ g RNA 플라스틱
- 10 µ L의 최종 볼륨을 PCR 튜브에 샘플 nuclease 무료 물을 추가 합니다.
- 표 2 에 나열 된 다음과 같은 구성 요소를 혼합 하 여 마스터 믹스 2 x 준비
- 20 µ L의 총 볼륨 믹스 마스터 x 1를 10 µ l RNA 마스터 믹스 x 10 µ L 2를 추가 합니다.
- 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브 및 샘플 다운 스핀을 잠시 닫습니다.
- PCR Thermocycler에서 샘플을 놓고 표 3에 나열 된 설정을 설정 합니다.
- 추가 분석을 위해-20 ° C에서 생성 된 cDNA를 저장 합니다.
8. 정량적 PCR (정량)
- 상용 키트 정량 Pcr 반응을 수행 합니다.
- 자체 디자인과 intron 스패닝 뇌관의 템플릿 cDNA의 다른 농도와 사용 하기 전에 테스트. 표준 곡선을 작성 하 여 뇌관의 효능을 분석 하 고 뇌관을 사용 하 여 높은 효능과 올바른 녹는 곡선.
참고:이 실험에 사용 된 뇌관의 시퀀스는 표 2에 나열 됩니다. - 표 4에 설명 된 반응 설치 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 반응 384-잘 접시에서를 준비 합니다.
- 모든 솔루션 및 알루미늄 호 일을 사용 하 여 반응 혼합물이 준비 될 때 젖 지 접시를 방지 하기 위해 얼음에 플레이트를 유지.
- Triplicates 모든 반응을 수행 합니다.
- 표 5에 나열 된 설정을 사용 하 여 thermocycler에 PCR 반응을 수행 합니다.
- triplicates에서 모든 반응에 대 한 평균 Ct 값을 계산 합니다. Glycerinealdehyde-3-인산 염-효소 식 수준에 모든 대상 유전자를 정상화 (Gapdh) 2^(-ΔCt)를 계산 하 여 내부 관리 유전자.
참고: 모든 대상 유전자 평균 Ct와 > 35 검출 한계에서 것으로 간주 되었다.
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Representative Results
장 장벽 위반 후 발생 하는 세균 이나 박테리아 파생 제품의 입구 후 호스트에 대 한 결과 모방, LPS는 C57Bl/6 마우스 sublethal 복용량 (2 µ g/g 몸 무게)에 주입 했다. 모든 단일 마우스 모니터링 되었고, 쥐의 모양, 동물, 눈의 상태와 호흡 속도 및 품질 (표 1)의 활동을 포함 하는 점수 시트에 나열 된 매개 변수를 endotoxemia의 발생에 대 한 득점 . 동물은 LPS의 주입 후 6 ~ 10 h를 만족 하 고 (그림 1) 24 시간 이내에 회수 하는 질병의 임상 표시를 보였다. 개별 마우스 LPS의 주입 후 희생된 2h, 4h, 및 8 h를 했다. 비장, 간, 그리고 콜론에서 조직 조각은 수집 했다. RNA이이 기관 으로부터 격리 되었고 역 cDNA를 복사할. cDNA는 정량에 사용 되는 뇌관으로 Il6 (그림 2A) Il1b (그림 2B), TNFa (그림 2C) 및 Il10 (그림 2D) 식 수준을 결정 하 정량에 대 한 템플릿으로 사용 되었다 표 6에 나와 있습니다. Il6 표현에에서 주입 후 비장 및 콜론, 4 h 주입 후 2 h를 만족. Il1b, TNFa, 및 Il10 의 식 비장, 간, 그리고 콜론에서 주사 후 4 h 만족. 주입 후 8 시간 이내 Il6, Il1b, TNFa, 및 Il10 의 식 초기 수준으로 반환.
그림 1: LPS 주입 (2 µ g/g 몸 무게) 유도 C57Bl/6mice에서 endotoxemia의 임상 표시. LPS의 2 µ g/g 몸 무게의 주입, 후 개별 마우스 모양 및 동물의 활동을 포함 하는 표 1에 제시 질병 점수와 함께 감시 되었다 그들의 눈 및 호흡 속도 품질의 모든 2 h 12 h와 후미에 24 시간 개방 어 LPS 주입. 질병 점수 (y 축)은 각각 시간 (x 축)에 얼룩이. ± SD 각 시간 마다 4-5 마우스에 대 한 제시를 의미 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: LPS 주입 (2 µ g/g 몸 무게) C57Bl/6 마우스 프로 염증 성 cytokines의 표정을 유도 한다. LPS의 2 µ g/g 몸 무게와 Il6 (A), (B) Il1b 식 수준 마우스 주입 했다, Tnfa (C) 와 Il10 (D) 지정 된 시간에 정량 비장, 간, 그리고 콜론에 의해 분석 되었다 주입 후 포인트입니다. Cytokine 식 레벨 모두 Gapdh의 표현에 정상화 했다. ± SD 각 시간 마다 4-5 마우스 표시 됩니다 의미 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1: 질병 점수 시트 LPS 주입 후 C57Bl/6 마우스 모니터. LPS 주입 후 모니터링 되는 매개 변수입니다. 동물 12 h 동안 주입 후 매 2 시간을 모니터링 했다 하 고 테이블에 나열 된 모든 개별 매개 변수에 대 한 점수 부여 했다. 각 동물에 대 한 최종 점수는 모든 개별 점수의 합계를 나타냅니다. 이것은 참조24에서 적응 이다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
| 금액 | 시 약 |
| 2 µ L/샘플 | RT 버퍼 x 10 |
| 0.8 µ L/샘플 | 25 x deoxynucleotide (dNTP) 믹스 (100 mM) |
| 1 µ L/샘플 | RT 무작위 뇌관 |
| 4.2 µ L/샘플 | nuclease 무료 물 |
표 2: 시 약 반전 녹음 방송에 대 한 마스터 믹스를 준비 하는데.
| 온도 | 시간 |
| 25 ° C | 10 분 |
| 37 ° C | 120 분 |
| 37 ° C | 5 분 |
| 4 ° C | 보류 |
표 3: Thermocycler 설정 반전 녹음 방송에 대 한 사용.
| 금액 | 시 약 |
| 5 µ L/잘 | 믹스 마스터 x 2 |
| 0.05 µ L/잘 | 참조 염료 |
| 500 nM 마지막/잘 | 앞으로 뇌관 |
| 500 nM 마지막/잘 | 반전 뇌관 |
| 10와 100 사이 ng/글쎄, 우리 사용 40 ng/잘 | 서식 파일 cDNA 템플릿 희석 버퍼에 희석 (이 버퍼의 1/100 희석 nuclease 무료 물에서 되었고 템플릿 cDNA를 희석 하는 데 사용). 어디 서식 파일에 추가 됩니다 반응 색상 변경으로 블루에서 그린 웰 스의 시각화 수 희석이 버퍼에서 서식 파일 |
| 10 µ L/잘의 최종 볼륨을 nuclease 무료 물 | nuclease 무료 물 |
표 4: PCR 반응의 설명입니다.
| 온도 | 시간 | |
| 95 ° C | 2 분 | |
| 95 ° C | 5 s | 40 주기 |
| 60 ° C | 20 s | |
| 95 ° C | 15 s | 녹는 곡선 analaysis |
| 60 ° C | 1 분 | |
| 95 ° C | 15 s |
표 5: Thermocycler 설정 PCR에 사용입니다.
| 뇌관 | 시퀀스 | 용융 온도 | 제품 길이 |
| Il6 F | TCG 개 그 GCT TAA TTA CAC ATG TTC T | 60.3 | 94 혈압 |
| Il6-R | GCATCATCGTTGTTCATACAATCA | 58.2 | |
| Il1b F | TGTGAAATGCCACCTTTTGA | 56.1 | 94 혈압 |
| Il1b-R | GTCAAAGGTTTGGAAGCAG | 57.2 | |
| Il10-F | ATCGATTTCTCCCCTGTGAA | 56.2 | 108 bp |
| Il10-R | TGTCAAATTCATTCATGGCCT | 56.1 | |
| Tnfa F | CCACCACGCTCTTCTGTCTAC | 60.4 | 103 혈압 |
| Tnfa-R | AGGGTCTGGGCCATAGAACT | 60 | |
| Gapdh F | CATCAAGAAGGTGGTGAAGC | 56.7 | 199 혈압 |
| Gapdh-R | CCTGTTGCTGTAGCCGTATT | 58 |
표 6: 정량 Pcr 반응에 사용 되는 뇌관. 정량에 대 한 마우스 cytokines 및 내부 관리 유전자를 검출 하는 데 사용 하는 뇌관의 순서 Gapdh.
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Discussion
이 프로토콜 미생물-파생 제품에 의해 침공 후 발생 하는 면역 프로세스를 모방 합니다. 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 마우스 선, 쥐의 위생 상태, LPS, endotoxemia, 발생과 실험 종료의 시간 포인트에 대 한 동물의 모니터링의 복용량의 선택. 가장 중요 한 것은, 마우스 스트레인의 유전 배경 고려 될 수 있다. 다른 마우스 긴장 다른 민감성 LPS에 있다. 예를 들어 C3H/HeJ 및 C57BL/10ScCr 마우스 LPS에 강한 endotoxemia21,25유도. 또한, 동물의 위생 상태는 LPS에서 endotoxemia의 과정을 좌우할 지도 모른다. 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 동물 가장 일반적으로 사용 됩니다. 이 마우스는 병원 체의 정의 된 목록에서 무료 하지만이 동물의 완전 한 microbiota 구성26,27알 수 없습니다. 살 균 세균 무료 또는 axenic (그는 microbiota을 항구 하지 않는) 동물은 SPF 마우스26다릅니다. 아마, axenic 동물 한 미생물 또는 미생물 (gnotobiotic 동물)의 컨소시엄의 식민 SPF 동물8에 비해 LPS 주입 후 IL-19, 같은 유전자의 표정을 좌우할 지도 모른다. 또한, 점수 시트는 복 막 구멍24지저분한 솔루션 주입에 의해 유도 된 패 혈 증 모델에 대 한 점수 시트 사용 된 제안 되었습니다. 이 sheetcan 지역 동물 복지 위원회 논의 지역의 요구에 맞게 수 있습니다. 특히, 종료에 대 한 기준을 로컬 동물 복지 위원회와 논의 될 필요가 있다. 이 실험 점수 > 12 이루어집니다 또는 하나의 개별 매개 변수에 대 한 최대 점수에 도달 하면 중지 했다. 이 실험에서 어떤 동물도 8 동물에서 LPS (2 µ g/g 몸 무게)의 주입 후 12의 질병 점수를 초과 했습니다. 이 연구 결과 간, cytokines Il6, Il1b, TNFa 및 Il10 의 식을 보여주는 비장 및 LPS의 주입 후 콜론 선물 된다. 반면, Il6 식 정점 비장에 콜론 LPS 주입 후 2 h 및 간에서 LPS 주사 후 4 h Il1b TNFa , Il10 의 식 비장, 간에 콜론, LPS 주사 후 4 h를 만족. 8 h 식 Il6, 내 Il1b TNFa , Il10 비장, 간, 결 장 초기 수준으로 반환. 질병의 심각도 정점으로 6 h 10 h 사이 LPS 주입 후 Il6, Il1b, TNFa 및 Il10 의 표현을 나타내는 기준선 수준에 이미 돌아왔다 때 그 Il6, 표현의 증가 Il1b TNFa , Il10 발생 합니다 빠르게 LPS 주입 후 하지만 그 다른 유전자의 활동 LPS 주입 후 다른 패턴을 표시할 수 있습니다. 이러한 cytokines의 식 수 또한 ELISA, 정량 이외에 고려 될 수 있는 의해 동물의 혈액에서 단백질 수준에서 분석할 수 있습니다.
수정 및 기술 문제 해결 질병 점수 > 12에 도달 하면 경우에 필요 하다. 따라서, LPS의 복용량 감소 하 여 더 나은 사용된 마우스 선 및 실험의 조기 종료를 방지 하려면 현지 조건에 조정 있다. 주어진된 게놈 영역을 삭제 하거나 유전자 overexpressing 유전자의 조작 쥐의 LPS에 민감성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예비 실험에서 불필요 한 피해와이 실험 동물에 죽음을 피하기 위해 적절 한 복용량에 LPS의 복용량을 적정 수 있습니다. 메모의 다른 세균 파생 제품 및 잘못 주사와 LPS의 오염을 피할 수 있다. 또한, LPS 주입 후 관심의 유전자의 표정의 활동 결정 될 필요가 있다.
한계는이 기술은 장 장벽 위반 후 호스트에 미생물 제품의 보급의 결과에 정보를 제공 하지만 장 장벽 위반 하 고 원인에 리드 하는 이벤트 정보를 제공 하지 것 이다 그는 IBD를 트리거합니다. 물론,이 모델은 DSS colitis 모델로 colitis 모델 하지만 호스트에 미생물 제품의 입구의 결과 공부 colitis 모델 외에도 유용할 수 있습니다. 또한, LPS의 i.p. 주입 복 막 구멍, 있는 작고 큰 창 자 위치는 중단 됩니다. 이 호스트에 복 막 구멍에서 파생 된 장내 세균 제품의 전 좌를 용이 하 게 수 있습니다.
이 모델의 중요성은 정의 PAMP 사용 하는 사실 이다. 전체 박테리아, 지저분한 솔루션24 의 i.p. 주입 또는 복 막 염 cecal 결 찰 및 펑크28, 미생물의 광대 한 배열에 의해 유도 된다 정화 조 복 막 염 모델의 i.p. 주입을 포함 하 여 다른 모델에 또는 그들의 제품 질병을 유도 한다. 또한, 마우스에 LPS의 주입 단순한 접근 이며 cecal 결 찰 및 펑크에 의해 유도 된 정화 조 복 막 염에서 수술을 필요로 하지 않습니다.
이 모델의 추가 응용 프로그램은 endotoxemia 또는 LPS 유발 된 패 혈 증 컨텍스트에서 피부 장벽의 위반 같은 호스트에 박테리아에서 파생 된 제품의 전 좌에 의해 특징 또는의 위반을 조사 하는 것을 목표로 하는 연구는 비뇨 생식 기의 요 로입니다. 결론적으로, 모든 실험실 환경에서 사용할 수 있는 간단한 모델입니다. 지역 조건에 따라 적응 지역 요구 필요를 있을 수 있습니다. 특히, 점수 시트 실험을 수행 하기 전에 지방 자치 단체와 함께 논의 하고있다. 이 방법은 세균 이나 박테리아 파생 제품 입력 호스트 배리어 위반이 발생 한 후 호스트에 대 한 결과 모방 하기 위해 사용 되었다. 이것은 특히 IBD 장 장벽 위반의 발생은 질병의 병 리에서 일반적인 이벤트의 기초 조사 연구에 관련 있을 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
JHN는 스위스 국립 재단 (SNSF 310030_146290)에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | K1081 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, | Applied Biosystems, Foster City, CA, USA | 4368813 | |
| RNase-Free DNase Set, | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| LPS Escherichia coli O111:B4 | Invivogen, San Diego, CA, USA. | tlrl-eblps | |
| Omnican 50 Single-use insulin syringe | B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany | 9151125 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologie, Santa Clara, USA | not applicable | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf, Hamburg, Germany | not applicable | |
| Centrifuge Mikro 220R | Hettich, Kirchlengern, Germany | not applicable | |
| Dissection tools | Aesculap, Tuttlingen, Germany | not applicable | |
| Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System | M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA | not applicable | |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | not applicable | |
| TRI Reagent | Zymo Research, Irvine, CA, USA | R2050-1 |
References
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면역학 그리고 감염 문제 135 Lipopolysaccharide endotoxemia colitis 선 동적인 장 질병 장벽 위반 cytokinesErratum
Formal Correction: Erratum: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach
Posted by JoVE Editors on 08/04/2018.
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An erratum was issued for: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach
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Katarina Raduolovic
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Katarina Radulovic
