Summary
सूक्ष्म जीवों के जीनोमिक अनुक्रमण के दौरान संदूषण एक बड़ी समस्या बनी हुई है । यहां, हम एक विधि दिखाने के लिए एक नमूना से एक tardigrade के जीनोम के रूप में छोटे के रूप में जीनोमिक डीएनए के पूरे जीनोम प्रवर्धन के साथ कम से कम के लिए संदूषण के जोखिम को ंयूनतम ।
Abstract
Tardigrades सूक्ष्म जानवर है कि एक ametabolic राज्य में प्रवेश anhydrobiosis बुलाया जब सुखाना सामना कर रहे है और उनके मूल राज्य में लौट सकते है जब पानी की आपूर्ति की है । इस तरह के tardigrades जोखिम जीवाणु संक्रमण के रूप में सूक्ष्म पशुओं के जीनोमिक अनुक्रमण है कि कई बार गलत व्याख्याओं की ओर जाता है, उदाहरण के लिए, इन पशुओं में क्षैतिज जीन हस्तांतरण की सीमा के बारे में । यहां, हम एक ultralow इनपुट विधि प्रदान करने के लिए tardigrade के जीनोम अनुक्रम, Hypsibius dujardini, एक ही नमूना से । एक एकल व्यक्ति से ५० ~ २०० स्नातकोत्तर जीनोमिक डीएनए के एक कुशल निष्कर्षण के साथ कठोर धुलाई और contaminant अपवर्जन के साथ काम करके, हम एक डीएनए अनुक्रमण साधन के साथ अनुक्रम पुस्तकालय का निर्माण किया । इन पुस्तकालयों अत्यधिक reproducible और निष्पक्ष थे, और अनुक्रम के अंय एच dujardini जीनोम के साथ पढ़ता एक सूचना का विश्लेषण संदूषण की एक ंयूनतम राशि दिखाई । इस विधि unculturable tardigrades कि पिछले विधियों का उपयोग कर अनुक्रम नहीं किया जा सकता करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
Tardigrades सूक्ष्म जानवर है कि एक ametabolic जब सुखाना का सामना करना पड़ anhydrobiosis बुलाया राज्य में प्रवेश कर सकते हैं । वे पानी के अवशोषण से ठीक1,2. ametabolic राज्य में, tardigrades विभिन्न चरम वातावरण को सहन करने में सक्षम हैं, जो चरम तापमान3 और दबाव4,5, पराबैंगनी प्रकाश6की एक उच्च खुराक, एक्स-रे, और गामा किरणों शामिल 7 , 8, और ब्रह्मांडीय अंतरिक्ष9। जीनोमिक डेटा anhydrobiosis के आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए एक अपरिहार्य आधार है ।
tardigrades के जीनोम के अनुक्रम के पिछले प्रयास जीवाणु संदूषण10,11, 12,13,14के लक्षण दिखाई दिया है । ऐसे छोटे जीवों से जीनोमिक अनुक्रमण पशुओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है और जीवाणु संक्रमण के लिए प्रवण है; इसलिए, हम पहले tardigrade का एक नमूना से शुरू एक ultralow इनपुट विधि का उपयोग कर,15संदूषणों के जोखिम को कम करने के लिए एक अनुक्रमण प्रोटोकॉल की स्थापना की है । इन आंकड़ों का प्रयोग, हम आगे एक उच्च गुणवत्ता पुनर्अनुक्रमण और एच dujardini16,17के जीनोम के विधानसभा का आयोजन किया है । यहाँ हम विस्तार से एक एकल tardigrade व्यक्ति से जीनोमिक अनुक्रमण के लिए इस विधि का वर्णन (चित्रा 1). इस sequencing विधि की मांयता इस काग़ज़ के फ़ोकस से बाहर है और पहले से ही हमारी पिछली रिपोर्ट16में गहन रूप से चर्चा की गई है ।
इस विधि के दो भागों शामिल है: एक एकल tardigrade के अलगाव संभव सबसे कम संदूषण के साथ, और उच्च गुणवत्ता pictogram डीएनए के स्तर निष्कर्षण । tardigrade भूखे है और पानी के साथ अच्छी तरह से कुल्ला, साथ ही साथ एंटीबायोटिक दवाओं, और 500X आवर्धन के साथ एक खुर्दबीन के नीचे मनाया के लिए किसी भी जीवाणु संक्रमण को हटाने सुनिश्चित करते हैं । पिछले अनुमान और माप बताते है कि tardigrade के एक एकल व्यक्ति लगभग ५०-२०० जीनोमिक डीएनए के स्नातकोत्तर16, जो फ्रीज-गल चक्र द्वारा या मैनुअल homogenization द्वारा काइटिन exoskeleton खुर द्वारा निकाला जाता है शामिल हैं । इस जीनोमिक डीएनए पुस्तकालय निर्माण के लिए प्रस्तुत किया है और एक डीएनए अनुक्रमण साधन पर अनुक्रम । एक अतिरिक्त सूचना विश्लेषण उच्च गुणवत्ता अनुक्रमण, साथ ही पिछले tardigrade अनुक्रमण परियोजनाओं की तुलना में संदूषण के निम्न स्तर से पता चलता है.
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Protocol
1. तैयारी
- एक ९०-mm प्लास्टिक कल्चर डिश में विलायक के रूप में आसुत जल (dw) का उपयोग कर 2% agarose जेल तैयार करें, और DW के साथ एक 1% पेनिसिलिन/streptomycin कॉकटेल के 10 मिलीलीटर । जेल 2-3 सप्ताह के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर स्थापित एक मशीन में संग्रहित किया जा सकता है ।
नोट: 10 डिग्री सेल्सियस से नीचे जेल के किसी भी भंडारण से बचें, के लिए कम तापमान agarose जेल हटना होगा, जेल और संस्कृति डिश दीवार जिसमें tardigrades फंस सकता है के बीच एक मामूली अंतराल में जिसके परिणामस्वरूप ।
2. नमूना तैयारी और Contaminant अपवर्जन
- एक एकल tardigrade लीजिए, यह तैयार आगर प्लेट पर जगह है, और किसी भी शेष कणों को दूर करने के लिए DW के साथ 2x 3x धो लो ।
- आंतों से किसी भी अतिरिक्त भोजन को दूर करने के लिए 24 ज के लिए 18-22 ° c पर tardigrade की मशीन ।
- किसी भी जीवाणु संदूषण को हटाने और एक P10 पिपेट का उपयोग कर एक साफ स्लाइड गिलास पर दूषित जानवर जगह के लिए 2-6 एच के लिए पेनिसिलिन/streptomycin एंटीबायोटिक दवाओं में भूखे tardigrade रखें ।
- 500X आवर्धन पर एक खुर्दबीन के नीचे tardigrade निरीक्षण और पुष्टि करते है कि कोई शेष बैक्टीरिया हैं ।
नोट: एक stereomicroscope के साथ उच्च आवर्धन इष्टतम है, लेकिन एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप एक coverslip लागू करने के बिना वैकल्पिक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है. - तरल की एक अधिकतम 5 µ एल के साथ एक P10 पिपेट का उपयोग कर व्यक्ति को इकट्ठा, यह एक कम बाध्यकारी पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) ट्यूब में जगह है, और संभव के रूप में अधिक से अधिक तरल के रूप में हटा दें ।
नोट: microtubes, पीसीआर ट्यूबों, और पिपेट सुझाव सभी के लिए डीएनए की हानि को कम करने के लिए बाध्यकारी होना चाहिए ।
नोट: जितनी जल्दी हो सके एक homogenization आचरण, तेजी से सुखाना या पशु की मौत के लिए काफी जीनोमिक डीएनए को नुकसान पहुंचा सकता है ।
3. Homogenization और डीएनए निष्कर्षण
- Homogenize पशु अपने जीनोमिक डीएनए (gDNA) निम्न विधियों में से एक के साथ प्राप्त करने के लिए ।
नोट: यह निंनलिखित डीएनए निष्कर्षण चरणों में सामग्री की तालिका में दिखाया निर्दिष्ट किट का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, अंय किट के लिए (या तो कॉलम और मनका आधारित) यह बहुत कम निवेश पर प्रभावी नहीं हैं । जीनोमिक lysis बफर ०.५% बीटा-mercaptoethanol के साथ प्रयोग करने से पहले की आपूर्ति की गई है ।- फ्रीज और गल चक्र के साथ पशु Homogenize18।
- तुरंत कदम २.५ के बाद, tardigrade युक्त पीसीआर ट्यूब के लिए lysis बफर के १०० µ एल जोड़ें ।
- 10 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में पीसीआर ट्यूब प्लेस और 10 मिनट के लिए, यह एक गर्मी ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म ब्लॉक करने के लिए ले जाएँ । इस चरण 2x दोहराएं ।
नोट: homogenization पर्याप्त नहीं है या मैन्युअल क्रशिंग के बाद किया जा सकता है जब यह चरण दोहराया जा सकता है ।
- मैंयुअल रूप से पशु क्रश ।
- तुरंत २.५ कदम निंनलिखित, एक stereomicroscope के तहत, पीसीआर ट्यूब दीवार के खिलाफ जानवर दबाकर पिपेट के P10 टिप के साथ व्यक्ति को कुचलने, और तुरंत lysis बफर के १०० µ एल जोड़ें ।
नोट: यह एक stereomicroscope के तहत इस प्रक्रिया का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि tardigrade आसानी से दूर पर्ची कर सकते हैं, और अक्षम कुचल gDNA निकालने के लिए एक विफलता में परिणाम होगा । सुनिश्चित करें कि tardigrade छल्ली टूट गया है ताकि lysis बफर जीव घुसपैठ कर सकते हैं ।
- तुरंत २.५ कदम निंनलिखित, एक stereomicroscope के तहत, पीसीआर ट्यूब दीवार के खिलाफ जानवर दबाकर पिपेट के P10 टिप के साथ व्यक्ति को कुचलने, और तुरंत lysis बफर के १०० µ एल जोड़ें ।
- फ्रीज और गल चक्र के साथ पशु Homogenize18।
- lysis के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ट्यूब की मशीन हो ।
नोट: ंयूनतम 30 मिनट की एक कुशल lysis के लिए आवश्यक है, लेकिन अब गर्मी हो सकती है । - lysis मिश्रण का पूरा वॉल्यूम (१०० µ l) को क्लीन १.५-mL कम-बाइंडिंग microtube पर स्थानांतरित करें ।
- जोड़ें १०० µ l lysis बफ़र कम बाइंडिंग पीसीआर ट्यूब के लिए उपयोग किया गया था कि homogenization और अब खाली है, और मिश्रण pipetting के बाद, यह १.५-एमएल कम बाइंडिंग microtube चरण ३.३ में उपयोग करने के लिए स्थानांतरण । इस चरण 2x दोहराएं ।
- चरण ३.४ में, के रूप में जोड़ें ३०० µ l lysis बफ़र के लिए कम बाइंडिंग पीसीआर ट्यूब, और, pipetting के बाद, मिश्रण करने के लिए ले जाएँ १.५-एमएल कम बाइंडिंग microtube. १.५-एमएल कम बाध्यकारी microtube इस कदम के बाद मिश्रण के ६०० µ एल शामिल होना चाहिए ।
नोट: इन चरणों के लिए पीसीआर ट्यूब दीवार से बंधे gDNA के नुकसान को कम करने के लिए कर रहे हैं, नमूना कई बार धोने से । - एक संग्रह ट्यूब में रखा स्पिन स्तंभ के लिए lysis मिश्रण के ६०० µ एल की कुल जोड़ें और 1 मिनट के लिए १०,००० x g पर यह केंद्रापसारक ।
- फिर से स्तंभ के माध्यम से प्रवाह लागू करते है और यह १०,००० x g पर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
नोट: यह चरण gDNA के अधिकांश स्तंभ से बाउंड है यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । - स्पिन कॉलम को धोने बफर के ५०० µ एल जोड़ें और यह 1 मिनट के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक । स्पिन स्तंभ को क्लीन १.५-एमएल microtube में स्थानांतरित करें ।
- 10 मिमी Tris के 20 µ एल लागू करें-एचसीएल, पीएच ८.५, स्पिन कॉलम के लिए, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए रुको, और 1 मिनट के लिए १०,००० x g पर यह केंद्रापसारक ।
नोट: रेफरेंस बफ़र EDTA शामिल नहीं होना चाहिए, के लिए यह पुस्तकालय तैयारी एंजाइमों के साथ हस्तक्षेप. - फिर से स्पिन कॉलम के माध्यम से प्रवाह लागू होते हैं, और कमरे के तापमान पर मशीन के 5 मिनट के बाद, यह 1 मिनट के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक
नोट: इस कदम के लिए स्तंभ के लिए बाध्य gDNA के अधिक से अधिक रेफरेंस सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
4. पुस्तकालय निर्माण अनुक्रम
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डीएनए विखंडन
- gDNA eluant के 15 µ एल स्थानांतरण डीएनए विखंडन के लिए एक 15-µ एल microtube के लिए और एक तालिका के ऊपर microcentrifuge का उपयोग कर 1 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक ।
नोट: सामग्री की तालिका में दिखाए गए निर्दिष्ट microtube एक कम इनपुट के लिए इष्टतम है । कम मात्रा sonication के साथ विखंडन महत्वपूर्ण है, और यह डीएनए के अत्यंत कम एकाग्रता के कारण एंजाइमी विखंडन के साथ प्रतिस्थापित नहीं किया जा सकता है । - gDNA को ५५० bp में खंडित करें ।
नोट: ५५० बीपी सेटिंग्स हम इस्तेमाल निंनानुसार हैं: पीक घटना शक्ति = 30 डब्ल्यू, शुल्क फैक्टर = 20%, फट प्रति चक्र = ५०, उपचार समय = 23 एस । - एक पूरी तरह से pipetting के बाद, खंडित डीएनए मिश्रण के 10 µ एल स्थानांतरण एक साफ कम बाध्यकारी पीसीआर ट्यूब करने के लिए ।
नोट: प्रयोग यहां रोका जा सकता है । 4 डिग्री सेल्सियस या-20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए की रक्षा ।
- gDNA eluant के 15 µ एल स्थानांतरण डीएनए विखंडन के लिए एक 15-µ एल microtube के लिए और एक तालिका के ऊपर microcentrifuge का उपयोग कर 1 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक ।
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पुस्तकालय निर्माण अनुक्रम
नोट: यह पूरी तरह से निम्नलिखित प्रक्रियाओं में सामग्री की तालिका में निर्दिष्ट किट का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, इनपुट डीएनए की कम राशि के कारण.- टेंपलेट तैयारी बफर और 1 µ एल के टेंपलेट तैयारी एंजाइम के 2 µ एल जोड़ें और उंहें एक पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिश्रण ।
- निम्न शर्तों के साथ एक थर्मल साइकिल चालक पर टेम्पलेट तैयारी प्रतिक्रिया प्रदर्शन: 22 ° c 25 मिनट के लिए, ५५ ° c 20 मिनट के लिए, 4 ° c होल्ड करें, और १०१-१०५ ° c पर एक गर्म ढक्कन । एक बार प्रतिक्रिया पूर्ण होने पर, अगले चरण पर आगे बढ़ें ।
- पुस्तकालय संश्लेषण बफर के 1 µ एल जोड़ें और 1 µ एल के पुस्तकालय संश्लेषण एंजाइम के लिए खाका तैयार प्रतिक्रिया उत्पाद और ४० मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण गर्मी (एक 4 डिग्री सेल्सियस के साथ पकड़). एक बार प्रतिक्रिया पूर्ण होने पर, अगले चरण पर आगे बढ़ें ।
- पुस्तकालय प्रवर्धन मास्टर मिश्रण के 30 µ एल जोड़ें (पुस्तकालय प्रवर्धन बफर के 25 µ एल, पुस्तकालय प्रवर्धन एंजाइम के 1 µ एल, और 4 µ एल के nuclease-मुक्त पानी) और 5 µ के एल अनुक्रमण रिएजेंट.
- एक पिपेट के साथ अच्छी तरह से सब कुछ मिश्रण है और एक तालिका के साथ संक्षेप में मिश्रण केंद्रापसारक ।
- 1 तालिकामें प्रस्तुत शर्तों के साथ एक पीसीआर प्रदर्शन ।
| तापमान | समय | चक्र |
| ७२ ˚ ग | 3 मिनट | |
| ८५ ˚ ग | 2 मिनट | |
| ९८ ˚ ग | 2 मिनट | |
| ९८ ˚ ग | 20 सेकंड | 4 चक्र |
| ६७ ˚ ग | 20 सेकंड | |
| ७२ ˚ ग | ४० सेकंड | |
| ९८ ˚ ग | 20 सेकंड | 16 चक्र |
| ७२ ˚ ग | ५० सेकंड | |
| 4 ˚ ग | पकड़ |
तालिका 1: पीसीआर शर्तें ।
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पीसीआर उत्पादों का शुद्धिकरण
नोट: यह चरण अंय शुद्धि पद्धतियों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है । यदि एक वैकल्पिक विधि का प्रयोग किया जाता है, एक spectrophotometer का उपयोग करने के परिणामस्वरूप डीएनए शुद्धता के लिए जांच करने के लिए सुनिश्चित करें । 260/280 और 260/230 के अवशोषक अनुपात दोनों १.८ से ऊपर होना चाहिए ।- चुंबकीय मोतियों की ५० µ एल जोड़ें, समाधान 10x पिपेट, और यह संक्षिप्त एक तालिका के साथ microcentrifuge के साथ केंद्रापसारक ।
- कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए समाधान की मशीन ।
- यह 5 मिनट या समाधान पूरी तरह से स्पष्ट हो जाता है जब तक के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर मशीन, और supernatant को हटा दें ।
- जोड़ें २०० µ हौसले से तैयार ८०% कम एक चुंबक स्टैंड पर बाध्यकारी पीसीआर ट्यूब के लिए इथेनॉल, 30 एस के लिए रुको, और supernatant निकालें । इस चरण 2x दोहराएं । मोतियों को परेशान न करें ।
- संक्षेप में एक तालिका के साथ कम बाध्यकारी पीसीआर ट्यूब केंद्रापसारक केंद्रापसारक और चुंबकीय स्टैंड पर किसी भी अतिरिक्त इथेनॉल को दूर करना । हवा-मोतियों को सुखाएं लेकिन सूखने से बचें ।
- 10 mM Tris-HCl के 15 µ l के साथ मोतियों को रिसस्पेंड, पीएच ८.५, अच्छी तरह से समाधान पिपेट ताकि चुंबकीय मोती homogeneously वितरित कर रहे हैं, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए ट्यूब मशीन, और एक संक्षिप्त केंद्रापसारक के बाद, यह 2 के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर मशीन min जब तक समाधान साफ़ है ।
नोट: यह sequencing रसायन के साथ हस् तक्षेप करती के लिए रेफरेंस बफ़र EDTA शामिल नहीं करना चाहिए । - supernatant स्थानांतरण, गोली से परेशान बिना, एक नया कम बाध्यकारी पीसीआर ट्यूब करने के लिए ।
नोट: प्रयोग यहां रोका जा सकता है । लंबे समय तक भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या एटी-20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए की रक्षा ।
5. गुणवत्ता की जांच, ठहराव, और डीएनए के अनुक्रम
नोट: डीएनए की कम राशि के कारण इस चरण से पहले गुणवत्ता जांच का आयोजन नहीं किया जाता है ।
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डीएनए लाइब्रेरी साइज वितरण का सत्यापन
नोट: आकार वितरण के एक डिजिटल रिपोर्टिंग के साथ अंय उच्च-संवेदी ट्रो सिस्टम का उपयोग किया जा सकता है ।- कमरे के तापमान के लिए ट्रो बफर रिएजेंट और जेल कारतूस (सीमा में 25-१,००० bp) लौटें ।
- अनुक्रमण पुस्तकालय के 1 µ एल के साथ ट्रो बफर एजेंट के 3 µ एल जोड़ें और उन्हें एक भंवर के साथ 1 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिश्रण है, और संक्षेप में एक तालिका के साथ उंहें केंद्रापसारक ।
- आचरण ट्रो और संबद्ध सॉफ्टवेयर के साथ पुस्तकालय आकार वितरण मांय । मुख्य टुकड़ा चोटी मोटे तौर पर के बारे में ३०० से १,००० बीपी को लेकर होना चाहिए ।
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डीएनए ठहराव
नोट: अन्य प्रतिदीप्ति-आधारित विधियों या मात्रात्मक पीसीआर भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन spectrophotometry से बचना चाहिए, के रूप में यह अनुक्रमणित लायब्रेरीज़ को बढ़ाता है के लिए पर्याप्त सटीक नहीं है ।- समाधान बफर और फ्लोरोसेंट रिएजेंट के 4 µ एल के ७९६ µ एल जोड़ें और उंहें अच्छी तरह से मिश्रण । एक परख ट्यूब करने के लिए दो परख ट्यूबों और १९७ µ एल के लिए काम समाधान के १९० µ एल तिरस्कृत ।
- प्रत्येक परख ट्यूब के लिए डीएनए की ज्ञात सांद्रता के साथ मानकों के 10 µ एल जोड़ने के काम समाधान के १९० µ l युक्त, और 3 µ परख ट्यूब के लिए तैयार पुस्तकालय के एल १९७ युक्त काम समाधान के µ l ।
- भंवर ट्यूबों संक्षेप में और उंहें एक तालिका के ऊपर केंद्रापसारक पर केंद्रापसारक । 3-µ एल सेटिंग्स के साथ एक fluorometer का उपयोग डीएनए मात्रा ।
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डीएनए लाइब्रेरी अनुक्रम
नोट: sequencing प्लेटफ़ॉर्म निर्दिष्ट लाइब्रेरी निर्माण किट के साथ संगत होना आवश्यक है ।- निर्माता के प्रोटोकॉल पर आधारित sequencing लायब्रेरी तैयार करें ।
- sequencing साधन में एजेंट कैसेट और फ्लो सेल सेट और निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद sequencing भागो जानकारी दर्ज करें ।
- sequencing चलाएँ ।
नोट: हम दो sequencing रन का आयोजन किया है: एक नमूना चलाने के लिए, साथ ही एक रन में मल्टीप्लेक्स चार नमूने.
6. गणनात्मक विश्लेषण
- बेस-कॉल और, यदि आवश्यक हो तो, division the reads.
- FastQC19के साथ अनुक्रम डेटा की गुणवत्ता को मांय करें ।
नोट: प्राप्त डेटा की अधिक गहराई से मांयता के लिए, हमारी पिछली रिपोर्ट16देखें ।
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Representative Results
Contaminant बहिष्करण:
इस प्रोटोकॉल tardigrade की एक पूरी तरह से धोने और एंटीबायोटिक दवाओं के उपचार के साथ एक नसबंदी के लिए संदूषण को कम करना शामिल है । यह भी इन प्रक्रियाओं की पूर्णता सुनिश्चित करने के लिए एक दृश्य जांच प्रक्रिया शामिल है । सत्यापन (प्रोटोकॉल के चरण २.४) के दौरान किए गए एक माइक्रोस्कोप छवि चित्रा 2में दिखाया गया है । जब एक 500X इज़ाफ़ा पर मनाया, बैक्टीरियल कोशिकाओं छोटे कणों कि tardigrade व्यक्ति के आसपास कदम के रूप में देखा जा सकता है ।
डीएनए लाइब्रेरी की गुणवत्ता का सत्यापन:
निर्मित डीएनए की कुल राशि-Seq पुस्तकालय लगभग १०९.५ एनजी (७.३ एनजी/µ एल एक्स 15 µ एल)16है । फ़्रेग्मेंटेशन की लंबाई वितरण को मांय करने के लिए, एक ट्रो प्रतिमान आरेख 3 के समान होना चाहिए । हम एक डीएनए कतरनी प्रणाली के साथ ५५० बीपी के लिए विखंडन आकार सेट के रूप में, पुस्तकालय अनुक्रमण एडेप्टर सहित ५५०-६०० बीपी, होना चाहिए । यह देखा जा सकता है कि अनुक्रम पुस्तकालय के बहुमत २००-१००० बीपी के बीच में निहित है और दोहराने के बीच संगत है (N1-N4) ।
अनुक्रम डेटा विश्लेषण:
डीएनए sequencing लगभग 20-करने के लिए 25-M युग्मित प्रति रन पढ़ता जनरेट किया गया । गुणवत्ता की मांयता FastQC (चित्रा 4) का उपयोग कर आयोजित किया गया । अनुक्रम पढ़ने के साथ गुणवत्ता का वितरण एक ३००-बीपी युग्मित भागो की खासियत है ।
चित्र 1: इस प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो । यह आंकड़ा इस प्रोटोकॉल का सारांश दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : एक बैक्टीरिया मुक्त tardigrade के प्रतिनिधि फोटो । यह आंकड़ा एक प्रदूषित (बाएं) tardigrade और साफ (सही) tardigrade (Hypsibius dujardini), आगे बढ़ाया छवियों (नीचे) के साथ के चित्र से पता चलता है । रॉड के आकार का tardigrade के आसपास की कोशिकाओं को दूषित कर रहे है और एक तीर से संकेत दिया । स्केल बार इंगित करता है १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 : निर्माण डीएनए लाइब्रेरी के अंश लंबाई वितरण की मांयता । यह कक्ष sequencing लायब्रेरी आकार का वितरण दिखाता है । बैंगनी और हरी लाइनों १,५०० और 25 बीपी, क्रमशः ऊपरी और निचले मार्करों संकेत मिलता है । L = सीढ़ी, एस = 1 नमूना/भागो, N1-N4 = 4 प्रतिकृति/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : FastQC के साथ डीएनए-Seq गुणवत्ता की मांयता का उदाहरण । अनुक्रम प्रदर्शन को मान्य करने के लिए FastQC को डीएनए-Seq डेटा प्रस्तुत किया गया. आधार अनुक्रम गुणवत्ता प्रति DRR055040 के लिए एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाया गया है (DDBJ अनुक्रम पढ़ें पुरालेख DRA00445516) । (A) यह पैनल अग्रेषित पढ़ता (R1) दिखाता है । (B) यह पैनल रिवर्स पढ़ता (R2) दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
बैक्टीरियल संदूषण सूक्ष्म जीवों के जीनोमिक अनुक्रमण के लिए एक खतरा बन गया है । जबकि tardigrade जीनोम अनुक्रमण पर पिछले अध्ययनों से बाहर फ़िल्टर्ड है व्यापक सूचना के तरीकों का उपयोग कर संदूषण12,20, हम एक ही व्यक्ति से जीनोम अनुक्रम के लिए संदूषण के जोखिम को कम । के बाद से एक व्यक्ति tardigrade शामिल लगभग ५०-२०० जीनोमिक डीएनए के स्नातकोत्तर16 और काइटिन exoskeleton की एक मोटी परत में, संदूषण और उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए निष्कर्षण के बहिष्कार इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण बिंदु हैं । मौजूदा tardigrades संस्कृतियों अपूतित नहीं कर रहे हैं, और जंगली से एकत्र उन सतह पर दूषित पदार्थों का एक बहुत ले, साथ ही उनकी आंतों में भोजन की बनी हुई है । tardigrades के पिछले जीनोम अनुक्रमण परियोजनाओं का अनुक्रम है १०,०००-१००,००० व्यक्तियों सामूहिक रूप से एक नमूना12,14, जिसका अर्थ है परिणाम बहुत जीवाणु पदार्थों से प्रभावित होने की संभावना है । उनकी रिपोर्ट में Boothby एट अल. उनके नकारात्मक phototaxis व्यवहार14का उपयोग करके एच dujardini व्यक्तियों एकत्र, और समूह के किसी भी विरोधी बैक्टीरियल तरीकों को रोजगार नहीं किया ।
नेत्रहीनों की जांच करने के लिए अगर वहां संदूषण हैं, हम एंटीबायोटिक दवाओं में tardigrade मशीन (पेनिसिलिन/streptomycin) और एक 500X माइक्रोस्कोप के तहत व्यक्ति की जांच की । एक व्यक्ति को अलग और ध्यान से यह किसी भी दूषित पदार्थों के लिए निरीक्षण करके, हम संभव संदूषणों के जोखिम को कम किया । संदूषण के निंन स्तर sequencing डेटा से16के रूप में अच्छी तरह से पुष्टि की गई । डीएनए निष्कर्षण के लिए के रूप में, हम मैनुअल homogenization, साथ ही थर्मल homogenization18कार्यरत हैं । तरल नाइट्रोजन और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए tardigrade व्यक्ति को जमा करके, दरारें काइटिन exoskeleton में प्रेरित किया गया, और lysis बफर शरीर घुसना और कोशिकाओं लाइसे करने में सक्षम था । जब डीएनए उपज प्रत्याशित से कम रहता है, दोनों थर्मल और मैनुअल homogenization उपज को अधिकतम करने के लिए आयोजित किया जा सकता है ।
इस आलेख में बताई गई विधि में कई सीमाएं हैं । सबसे पहले, homogenization द्वारा फ्रीज और गल चक्र सूत्रकृमि पर एक अध्ययन से लागू किया गया था; इस प्रकार, विधि केवल ecdysozoa के खिलाफ प्रभावी हो सकता है । दूसरा, डीएनए सीक्वेंस लाइब्रेरी फेज के दौरान डीएनए अंशों के प्रवर्धन के कारण पीसीआर त्रुटियों की संभावना को नजरअंदाज नहीं किया जा सकता । इस प्रकार, उच्च-सटीकता पढ़ता (यानी, SNP विश्लेषण) की आवश्यकता है जो विश्लेषण के लिए अनुक्रम डेटा अनुशंसित नहीं है । इसके अलावा, जैसा कि हम प्रोटोकॉल में कहा गया है, निर्दिष्ट SNA-Seq सामग्री की तालिका में दिखाया किट का उपयोग बिल्कुल महत्वपूर्ण है, इनपुट डीएनए की कम राशि के कारण. यह डीएनए लाइब्रेरी निर्माण किट ligates प्रवर्धन से पहले Illumina अनुकूलक अनुक्रम; इसलिए, यह लायब्रेरी PacBio या ट्विटर तकनीक का उपयोग कर लंबी पढ़ने के लिए sequencing के लिए लागू नहीं किया जा सकता है । अंत में, इस प्रोटोकॉल के दौरान निर्मित डीएनए पुस्तकालय की गुणवत्ता की जांच केवल एक बार होता है, अनुक्रमण पुस्तकालय निर्माण के बाद । इसके कारण डीएनए के कम इनपुट के बाद से सबसे ज्यादा डीएनए ठहराव और ट्रो तरीके से डीएनए का ५०-२०० पीजी का पता नहीं लगा पा रहा है. इसलिए, हम ट्रो (चित्रा 1) और प्रतिदीप्ति आधारित quantifications के रूप में, केवल पीसीआर प्रवर्धन के बाद गुणवत्ता की जांच का आयोजन किया है ।
इस आंकडे के bioinformatics िरा की पूर्ण चर्चा इस लेख के दायरे से बाहर है; हालांकि, हम संक्षेप में कई विश्लेषण हम आयोजित किया है कहा है । FastQC19 के साथ sequencing डेटा की गुणवत्ता की जाँच प्रति-आधार गुण, अनुक्रम डुप्लिकेशन, आदि अनुक्रम डेटा को मान्य किया गया है जो जीनोम असेंबली करने के लिए प्रस्तुत किया जा सकता की गणना करता है । हम MaSuRCA v 3.1.321 के साथ एक १३२ Mb जीनोम इकट्ठे हुए है और मानचित्रण आंकड़ों की तुलना में22 BWA और अंय एच dujardini जीनोम16विधानसभाओं के साथ इस डीएनए अनुक्रमण पुस्तकालय के23 QualiMap के साथ गणना की । इसके अलावा, हम भी हमारे अध्ययन17में संदूषणों के बहिष्कार के लिए इस डीएनए अनुक्रमण डेटा का इस्तेमाल किया है, और देखा है कि अनुक्रम पढ़ता समान रूप से जीनोम भर में वितरित कर रहे हैं ।
गैर मॉडल जीवों पर अधिकांश परियोजनाओं संवर्धन पर्याप्त नमूना सामग्री से शुरू, के रूप में24tardigrades के साथ मामला था । संस्कृति तकनीक में तकनीकी प्रगति tardigrade संस्कृति के उच्च मात्रा में सक्षम है, लेकिन वर्तमान संस्कृति के तरीके अभी तक अपूतित नहीं हैं, और के बाद से सबसे tardigrades अभी भी प्रयोगशालाओं में unculturable हैं, यह लगभग असंभव है जीनोम का संचालन करने के लिए या transcriptome अनुक्रमण । एक एकल व्यक्ति से यह डीएनए अनुक्रमण विधि कम अध्ययन किया गया है कि समुद्री प्रजातियों सहित दुर्लभ tardigrade प्रजातियों, का विश्लेषण करने के लिए यह संभव बनाता है. एक व्यापक phyletic क्षेत्र में तुलनात्मक जीनोमिक्स का आयोजन करके, tardigrades में anhydrobiosis तंत्र की एक और समझ हासिल की जा सकती है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक नोजोमी अबे, युकी टकै, और Nahoko Ishii जीनोमिक अनुक्रमण में उनके तकनीकी समर्थन के लिए धंयवाद । यह काम अनुदान द्वारा समर्थित था जापान सोसायटी के लिए विज्ञान के संवर्धन के लिए सहायता (JSPS) रिसर्च फेलो, KAKENHI अनुदान में युवा वैज्ञानिकों के लिए सहायता (no. 22681029), और KAKENHI अनुदान में सहायता के वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए (ख), नहीं, 17H03620 से JSPS, एक सुमितोमो फाउंडेशन (सं. 140340) से बुनियादी विज्ञान अनुसंधान परियोजनाओं के लिए अनुदान, और आंशिक रूप से यामागाता प्रीफेक्चुरल सरकार और Tsuruoka शहर, जापान से अनुसंधान निधियों द्वारा । Chlorella tardigrades को खिलाने के लिए प्रयुक्त Chlorella उद्योग कं लिमिटेड के सौजंय से प्रदान किया गया था
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
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