Summary
זיהום במהלך רצף גנומית של אורגניזמים מיקרוסקופיים עדיין בעיה גדולה. כאן, אנו מראים שיטה רצף הגנום של דובוני מים מן להצטננות עם עמוד 50 קטנה כמו של ה-DNA גנומי ללא הגברה הגנום כולו כדי למזער את הסיכון של זיהום.
Abstract
Tardigrades הם בעלי חיים מיקרוסקופיים להיכנס למצב של ametabolic נקרא anhydrobiosis מול לייבוש והוא יכול להחזיר למצב המקורי שלהם כשהם מסופקים המים. רצף גנומית של בעלי חיים מיקרוסקופיים כמו tardigrades סיכוני זיהום חיידקי שמוביל לפעמים פירושים מוטעים, לדוגמה, בנוגע להיקף של העברה גנטית אופקית בבעלי חיים אלה. כאן, אנו מספקים שיטת קלט ultralow את רצף הגנום של דובוני מים, Hypsibius dujardini, מן להצטננות. על ידי שימוש קפדני הדרה כביסה ולא מזהם יחד עם ניסיון חילוץ יעיל שנות ה-50 ~ 200 pg DNA גנומי של אדם יחיד, ואנחנו נבנה ספריה רציף עם כלי עריכה ברצף ה-DNA. ספריות אלה היו מוטים הדירים מאוד, ניתוח אינפורמטיקה הקריאות ברצף עם הגנום dujardini ה אחרים הראו כמות מזערית של זיהום. בשיטה זו ניתן ליישם tardigrades unculturable זה יכול לא להיות רציף בשיטות קודמות.
Introduction
Tardigrades הם בעלי חיים מיקרוסקופיים יכולים להזין את מצב ametabolic הנקרא anhydrobiosis מול לייבוש. הם לשחזר על-ידי ספיגת מים1,2. במצב ametabolic, tardigrades מסוגלים לנקוט בסביבות קיצוניות שונות, הכוללות טמפרטורות קיצוניות3 ו לחצים4,5, מינון גבוה של אור אולטרה סגול6, צילומי רנטגן, קרני גמא 7 , 8, חלל היקום9. נתונים גנומית היא יסוד חיוני לצורך המחקר של המנגנונים המולקולריים של anhydrobiosis.
נסיונות קודמים רצף הגנום של tardigrades הראו סימנים של זיהום בקטריאלי10,11,12,13,14. רצף גנטי של אורגניזמים קטנים כזה דורש מספר רב של בעלי חיים, והוא נוטה זיהום בקטריאלי; לכן, קודם לכן הקמנו פרוטוקול רצף באמצעות שיטת קלט ultralow החל להצטננות דובוני מים, כדי למזער את הסיכון מציג15. באמצעות נתונים אלו, יש נוספת ערכנו למיין שוב באיכות גבוהה ועל ההרכבה מחדש של הגנום של16, dujardini ה17. כאן נתאר בפירוט שיטה זו עבור רצף גנטי של אדם יחיד tardigrade (איור 1). האימות של שיטה זו הוא מעבר המוקד של המאמר, כבר המורכב בהרחבה בדוח הקודם שלנו16.
שיטה זו מורכבת משני חלקים: בידודו של דובוני מים יחיד עם הכי נמוך שאפשר זיהום, החילוץ באיכות גבוהה של pictogram רמות ה-DNA. דובוני מים מורעבים, לשטוף ביסודיות עם מים, כמו גם אנטיביוטיקה, שנצפו תחת מיקרוסקופ עם 500 X הגדלה כדי להבטיח סילוק כל זיהום חיידקי. הערכות קודמות ומדידות מראים כי אדם יחיד של דובוני מים מכיל כ- 50-200 pg גנומית דנ א16, אשר מופק על ידי פיצוח שלד חיצוני כיטין מחזורים ההקפאה-הפשרה או על ידי המגון ידנית. את הדנ א הגנומי נאספו ספריית לבנייה, וסודרו על מכשיר רצף ה-DNA. ניתוח נוסף אינפורמטיקה מציג רצף באיכות גבוהה, כמו גם רמות נמוכות של זיהום לעומת פרוייקטים רצף tardigrade קודמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה
- להכין 2% agarose ג'ל באמצעות מים מזוקקים (DW) כמו הממס מאכל תרבות הפלסטיק 90 מ מ, ו 10 מ ל 1% פניצילין/סטרפטומיצין קוקטייל עם DW. ניתן לאחסן את הג'ל במשך 2-3 שבועות באינקובטור להגדיר ב- 18 מעלות צלזיוס.
הערה: להימנע מכל אחסון של הג'ל מתחת ל 10 ° C, כי הטמפרטורה הנמוכה יכווץ את הג'ל agarose, וכתוצאה מכך פער זעיר בין הג'ל לבין הקיר מאכל תרבות שבה יכול לבצע עליו את tardigrades.
2. לטעום הכנה להדרה מזהם
- אוספים של דובוני מים יחיד, להניחה על הצלחת אגר מוכן, לשטוף אותה 2 x - x 3 עם DW כדי להסיר את כל החלקיקים שנותרו.
- דגירה של דובוני מים ב 18-22 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה כדי להסיר את כל עודפי מזון מהמעיים.
- מקם את דובוני מים מורעבים האנטיביוטיקה פניצילין/סטרפטומיצין עבור 2-6 h להסיר את כל חיידקי זיהום ומניחים את החיה decontaminated על כוס נקי שקופיות באמצעות פיפטה של P10.
- לצפות את דובוני מים תחת מיקרוסקופ בהגדלה X 500 ואשר שקיימים אין חיידקים שנותרו.
הערה: ההגדלה גבוה עם stereomicroscope האופטימלית, אך במיקרוסקופ אופטי ניתן להשתמש לחלופין ללא החלת coverslip. - לאסוף את הפרט באמצעות פיפטה P10 עם מספר מרבי של 5 µL של נוזל, למקם אותו לתוך צינור תגובת שרשרת (PCR) נמוך מחייב פולימראז והסר כמו נוזל עודף הרבה ככל האפשר.
הערה: microtubes, המבחנות ועצות פיפטה צריכים להיות קשירה נמוכה כדי למזער האובדן של ה-DNA.
הערה: התנהגות המגון בהקדם האפשרי, עבור לייבוש מהיר או למות בעל החיים באופן משמעותי עלול לגרום נזק הדנ א הגנומי.
3. המגון והפקת דנ א
- Homogenize החיה כדי להשיג את הדנ א הגנומי (gDNA) באחת מהשיטות הבאות.
הערה: חיוני כדי להשתמש בערכה שצוין שמוצג בטבלה של חומרים בשלבים מיצוי DNA הבאים, קיטים אחרים (או עמודה, חרוז מבוסס) הם לא יעיל זה קלט נמוך ביותר. המאגר פירוק גנומית סופק עם 0.5% בטא-mercaptoethanol לפני השימוש.- Homogenize החיה עם מחזורים ההקפאה-הפשרה18.
- מיד לאחר שלב 2.5, להוסיף 100 µL מאגר פירוק הצינור PCR המכיל את דובוני מים.
- הכנס את הצינור PCR חנקן נוזלי למשך 10 דקות, 10 דקות, להזיז את גוש חום התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה, 2 x.
הערה: שלב זה יכול לחזור כאשר המגון אינה מספיקה או יכול להתבצע לאחר ריסוק ידני.
- באופן ידני לרסק את החיה.
- מיד לאחר שלב 2.5, תחת stereomicroscope, לרסק את הפרט עם קצה P10 פיפטה על ידי לחיצה על החיה הקיר צינור PCR, מיד להוסיף 100 µL פירוק המאגר.
הערה: חיוני לקיים הליך זה תחת stereomicroscope, כי דובוני מים יכול בקלות לחמוק, ריסוק לא יעיל יביא כשל כדי לחלץ gDNA. ודא כי הקוטיקולה tardigrade הוא שבור, כך המאגר פירוק יכול לחדור את האורגניזם.
- מיד לאחר שלב 2.5, תחת stereomicroscope, לרסק את הפרט עם קצה P10 פיפטה על ידי לחיצה על החיה הקיר צינור PCR, מיד להוסיף 100 µL פירוק המאגר.
- Homogenize החיה עם מחזורים ההקפאה-הפשרה18.
- דגירה הצינור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במשך פירוק להתרחש.
הערה: נדרש מינימום של 30 דקות פירוק יעיל, אך הדגירה יכולות להיות ארוכות יותר. - העבר את העוצמה המלאה (100 µL) של תערובת פירוק microtube נמוך מחייב נקי 1.5-mL.
- להוסיף 100 µL מאגר פירוק הצינור PCR נמוך מחייב כי שימשו את המגון עכשיו ריקה, לאחר pipetting את התערובת, להעביר אותו microtube 1.5-mL נמוך מחייב שימוש בשלב 3.3. חזור על שלב זה, 2 x.
- כמו צעד 3.4, להוסיף 300 µL מאגר פירוק הצינור PCR מחייב נמוך, לאחר pipetting, להעביר את הבלילה לתבנית microtube נמוך מחייב 1.5-mL. Microtube נמוך מחייב 1.5-mL צריך להכיל 600 µL של התערובת לאחר שלב זה.
הערה: השלבים הבאים הם כדי למזער האובדן של gDNA כבול לקיר צינור PCR, נטילת הדגימה מספר פעמים. - הוסף את סך של 600 µL של פירוק תערובת לעמודה ספין הניח צינור אוסף ' centrifuge זה ב 10,000 x g עבור 1 דקות.
- החל מחדש את הזרימה אל העמודה, centrifuge זה ב 10,000 x g עבור 1 דקות.
הערה: שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח כי רוב gDNA מאוגדת לעמודה. - להוסיף 500 µL מאגר שטיפת העמודה ספין, centrifuge זה ב 10,000 g x עבור 1 הגבלת העברת העמודה ספין כדי microtube נקי 1.5-mL.
- החל µL 20 10 מ מ טריס-HCl, pH 8.5, העמודה ספין, להמתין 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר centrifuge זה ב 10,000 g x עבור 1 דקות.
הערה: המאגר • תנאי אינו יכול להכיל EDTA, כי זה מפריע האנזימים הכנה הספרייה. - החל מחדש את הזרימה דרך העמודה ספין, ואחרי 5 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, centrifuge זה עבור 1 דקות ב- 10,000 x g.
הערה: שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח את • תנאי מקסימלי של gDNA מאוגד לעמודה.
4. ספריית בניית רצף
-
פיצול דנ א
- להעביר 15 µL של eluant gDNA microtube 15-µL עבור ה-DNA פיצול, centrifuge את צינור 1 דקות באמצעות microcentrifuge על השולחן.
הערה: microtube שצוין שמוצג בטבלה של חומרים הוא אופטימלי עבור קלט נמוכה. הפיצול עם sonication בנפח נמוך הוא קריטי, זה לא ניתן להחליף עם פיצול אנזימטי בשל הריכוז הנמוך ביותר של ה-DNA. - קטע של gDNA ל 550 bp.
הערה: ההגדרות bp 550 השתמשנו הן כדלקמן: שיא האירוע כוח = 30 W, פקטור חובה = 20%, מחזורים לכל פרץ = 50, זמן טיפול = 23 s. - לאחר pipetting יסודי, להעביר µL 10 של תערובת DNA מפוצלים צינור נקי נמוך-איגוד ה-PCR.
הערה: הניסוי ניתן לעצור כאן. לשמר את ה-DNA 4 ° C או-20 ° C.
- להעביר 15 µL של eluant gDNA microtube 15-µL עבור ה-DNA פיצול, centrifuge את צינור 1 דקות באמצעות microcentrifuge על השולחן.
-
רצף בניית הספרייה
הערה: זה הוא קריטי כדי להשתמש בערכה שצוינו בטבלה של חומרים בהליכים הבאים, בגלל הכמות הנמוכה של DNA קלט.- להוסיף 2 µL של המאגר הכנת תבנית ו µL 1 של האנזים הכנת תבנית ומערבבים אותם ביסודיות עם פיפטה.
- לבצע את התגובה הכנת תבנית הצנטרפוגה תרמי עם התנאים הבאים: 22 מעלות במשך 25 דקות, 55 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, החזק 4 ° C, מכסה מחוממת ב 101-105 ° C. עם סיום התגובה, המשך לשלב הבא.
- להוסיף 1 µL של המאגר סינתזה ספריית µL 1 של האנזים סינתזה ספריית המוצר התגובה הכנת תבנית, דגירה התערובת ב 22 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות (עם אחיזה 4 ° C). עם סיום התגובה, המשך לשלב הבא.
- להוסיף 30 µL של ספריית הגברה מאסטר המיקס (25 µL של המאגר הגברה ספריית µL 1 של האנזים הגברה ספריה, 4 µL של מים נטולי נוקלאז) ו µL 5 מהתרכובת יצירת אינדקס.
- לערבב הכל היטב עם פיפטה, centrifuge את התערובת בקצרה עם צנטריפוגה שולחן.
- ביצוע של PCR עם התנאים המוצגים בטבלה 1.
| טמפרטורה | זמן | מחזורים |
| 72 הלעפה תרוטרפמט | 3 דקות | |
| 85 הלעפה תרוטרפמט | 2 דקות | |
| 98 הלעפה תרוטרפמט | 2 דקות | |
| 98 הלעפה תרוטרפמט | 20 שניות | 4 מחזורים |
| 67 הלעפה תרוטרפמט | 20 שניות | |
| 72 הלעפה תרוטרפמט | 40 שניות | |
| 98 הלעפה תרוטרפמט | 20 שניות | מחזורים 16 |
| 72 הלעפה תרוטרפמט | 50 שניות | |
| 4 הלעפה תרוטרפמט | . תחזיק |
טבלה 1: תנאי ה-PCR.
-
טיהור של מוצרי ה-PCR
הערה: שלב זה ניתן יהיה להחליף עם שיטות טיהור אחרות. אם שיטה חלופית, הקפד לבדוק טוהר DNA שנוצר באמצעות ספקטרופוטומטרים. ספיגת יחס של 260/280, 260/230 שנינו חייבים להיות מעל 1.8.- להוסיף 50 µL של beads מגנטי, pipette הפתרון 10 x, ו- centrifuge זה בקצרה עם microcentrifuge השולחן.
- דגירה הפתרון למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- דגירה אותו על דוכן מגנטי במשך 5 דקות או עד הפתרון הופך לגמרי ברור, ולהסיר את תגובת שיקוע.
- להוסיף 200 µL הטרי 80% אתנול הצינור PCR נמוך מחייב על דוכן מגנט, לחכות 30 s, ולהסיר תגובת שיקוע. חזור על שלב זה, 2 x. נא לא להפריע את החרוזים.
- בקצרה centrifuge הצינור PCR נמוך מחייב עם צנטריפוגה שולחן ולהסיר כל אתנול עודף על הדוכן מגנטי. מילה נהדרת החרוזים אבל להימנע overdrying.
- Resuspend את החרוזים עם 15 µL 10 מ מ טריס-HCl, pH 8.5 ביסודיות pipette את הפתרון כך החרוזים מגנטי homogeneously מופצים, דגירה הצינור למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, ואחרי צנטריפוגה קצרה, דגירה אותו על דוכן מגנטי עבור 2 דקות עד הפתרון ברור.
הערה: המאגר • תנאי צריך מכילה EDTA, כי זה מפריע הכימיה רצף. - להעביר את תגובת שיקוע, מבלי להפריע בגדר, אל צינור נמוך-איגוד ה-PCR.
הערה: הניסוי ניתן לעצור כאן. לשמר את ה-DNA ב 4 º C או ב-20 ° C עבור אחסון ותיק.
5. איכות הסימון כמת, רצף ה-DNA
הערה: בדיקת איכות לא מתבצע לפני שלב זה בגלל הכמות הנמוכה של ה-DNA.
-
אימות של התפלגות גודל של ספריית דנ א
הערה: מערכות אלקטרופורזה רגיש גבוהה עם דיווח דיגיטלי של התפלגות גודל ניתן להשתמש.- להחזיר הכימית מאגר אלקטרופורזה, ג'ל מחסנית (25-1, 000 לחץ הדם בטווח) לטמפרטורת החדר.
- להוסיף 3 µL של ריאגנט מאגר אלקטרופורזה עם µL 1 של הספרייה רצף, ומערבבים היטב במשך 1 דקה עם מערבולת, בקצרה centrifuge אותם עם צנטריפוגה שולחן.
- התנהלות אלקטרופורזה ולאמת את התפלגות גודל הספרייה עם התוכנה המשויכים. הפסגה פרגמנט העיקרי צריך להיות באופן כללי ועד כ-300 1,000 bp.
-
כימות דנ א
הערה: שיטות מבוססות קרינה פלואורסצנטית או ה-PCR כמותי אחרים ניתן להשתמש גם, אבל ספקטרופוטומטר להימנע, כי זה לא מספיק מדויקת לכימות תנועת רצף ספריות.- הוסף µL 796 פתרון מאגר µL 4 של ריאגנט פלורסנט ומערבבים אותם ביסודיות. לוותר על 190 µL של הפתרון עובד שני צינורות assay, µL 197 ל שפופרת assay אחת.
- הוסף 10 µL של סטנדרטים עם ריכוזים ידועים של ה-DNA כדי כל שפופרת assay המכיל µL 190 של הפתרון עובד µL 3 של הספריה מוכן כך הצינור assay המכיל µL 197 של הפתרון עובד.
- מערבולת הצינורות בקצרה, centrifuge אותם על צנטריפוגה שולחן. לכמת את הדנ א באמצעות fluorometer עם הגדרות 3-µL.
-
רצף ספריית ה-DNA
הערה: פלטפורמת רצף חייב להיות תואם עם ערכת בנייה הספריה שצוינה.- הכינו את הספריה רצף בהתבסס על הפרוטוקול של היצרן.
- להגדיר את התא קלטות וזרימה של ריאגנט לתוך הכלי רצף והזן את הרצף לנהל מידע ע פ הפרוטוקול של היצרן.
- הפעל את הרצף.
הערה: ביצענו שתי ריצות רצף: דוגמה אחת/הפעלה, כמו גם הארבעה מרובב בהפעלה אחת.
6. ניתוח חישובית
- בסיס-שיחה, אם נדרש, demultiplex את הקריאות.
- לאמת את איכות הנתונים רצף עם FastQC19.
הערה: עבור אימות מעמיקה יותר של נתונים המתקבלים, ראה דו ח הקודם שלנו16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדרה מזהם:
פרוטוקול זה כרוך שטיפה של דובוני מים ועיקור בטיפול אנטיביוטיקה כדי למזער את הזיהום. זה כרוך גם תהליך בדיקה חזותית כדי להבטיח את שלמות התרגום של תהליכים אלה. תמונת מיקרוסקופ במהלך האימות (שלב 2.4 לפרוטוקול) מוצג באיור2. בעת שנצפה בהגדלה גדולה-X 500, ניתן לראות תאים חיידקיים חלקיקים קטנים מסביב את דובוני מים בודדים.
אימות של איכות ספריית DNA:
הסכום הכולל של ספריית ה-DNA-Seq נבנה הוא כ 109.5 ng (7.3 ng/µL x 15 µL)16. כדי לאמת את חלוקת אורך הפיצול, דוגמת אלקטרופורזה אמור להיות דומה איור 3- כפי לנו לקבוע את הגודל פיצול 550. לחץ דם עם ה-DNA הטיה מערכת הספרייה צריכה להיות bp 550-600, כולל מתאמים את רצף. זה יכול להיות שנצפו כי הרוב המכריע של הספרייה רצף נכלל בין 200-1000 bp והוא עקבי בין משכפל (N1 - N4).
ניתוח נתונים רצף:
רצף ה-DNA שנוצר בערך 20 - ל 25-מ ' קריאות לזווג לכל הפעלה. האימות של האיכות נערך באמצעות FastQC (איור 4). ההתפלגות של האיכות לאורך הקריאה ברצף זה אופייני של ריצה לזווג 300-bp.
איור 1: זרימת העבודה של פרוטוקול זה. איור זה מציג סיכום של פרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תמונה ייצוגית של דובוני מים ללא חיידקים. איור זה מציג תמונות של דובוני מים מזוהמים (שמאל) ודובוני מים (מימין) נקי (Hypsibius dujardini), יחד עם תמונות בהגדלה נוספת (למטה). מוט בצורת התאים מסביב דובוני מים מזהמים, מסומנים עם חץ. סרגל קנה מידה מציינת 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : אימות של ההתפלגות אורך קטע של ספריית ה-DNA בנוי. לוח זה מציג את ההתפלגות של גודל הספרייה רצף. הקווים סגול וירוק מציינים את סמני עליון ותחתון -bp 1,500 ו 25, בהתאמה. L = הסולם, S = 1 מדגם/הפעלה, N1 - N4 = 4 משכפל/הפעלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : דוגמה של האימות של ה-DNA-Seq איכות עם FastQC. דנ א-Seq נתונים הוגשו FastQC כדי לאמת את רצף הביצועים. תוצאה נציג עבור DRR055040 לכל רצף הבסיס איכות מוצג (DDBJ רצף קריאה ארכיון DRA00445516). (א) לוח זה מראה קריאות קדימה (R1). (B) לוח זה מראה את קריאות הפוכה (R2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זיהום חיידקי מהווה איום על רצף גנומית של אורגניזמים מיקרוסקופיים. בעוד מחקרים קודמים על רצף הגנום tardigrade סינון החוצה זיהום תוך שימוש נרחב אינפורמטיקה שיטות12,20, ריצפנו את הגנום של אדם יחיד כדי למזער את הסיכון של מציג. כיוון דובוני מים בודדים מכיל כ- 50-200 pg דנ א גנומי16 זה עטוף בשכבה עבה של שלד כיטין, הכללת מזהמים והפקת DNA באיכות גבוהה הן נקודות קריטיות של פרוטוקול זה. תרבויות tardigrades הקיימים אינם aseptic, ולא אלה נאספו מ להוציא לפועל פראי הרבה לכלוך על פני השטח, כמו גם שרידי מזון במעיים שלהם. פרוייקטים קודמים של רצף הגנום של tardigrades יש רציף 10,000-100,000 אנשים באופן קולקטיבי אחד מדגם12,14, מה שאומר שהתוצאות נוטים להיות מושפעים חיידקים מזהמים. בדו ח שלהם, Boothby. et al. שנאספים ה dujardini אנשים באמצעות ההתנהגות שלהם phototaxis שלילי14, הקבוצה לא מעסיקים בכל שיטות אנטי בקטריאלי.
לבצע בדיקה חזותית אם יש מזהמים, אנחנו הדגירה של דובוני מים באנטיביוטיקה (פניצילין/סטרפטומיצין) ובחן הפרט תחת מיקרוסקופ X 500. על-ידי בידוד בודדים בזהירות בדיקת זה עבור כל מזהמים, אנחנו למזער את הסיכון של מציג אפשרי. רמות נמוכות של זיהום היו אושר מתוך נתוני רצף טוב16. באשר החילוץ ה-DNA, אנחנו מועסקים המגון ידנית, כמו גם המגון תרמי18. על ידי הגשת הפרט tardigrade חנקן נוזלי, 37 מעלות צלזיוס, סדקים היו המושרה בשלד חיצוני כיטין, המאגר פירוק הצליח לחדור את הגוף ואת lyse התאים. כאשר התשואה DNA נותר נמוך מהצפוי, המגון תרמי וידני עשויים להתנהל כדי למקסם את התשואה.
השיטה כאמור במאמר זה יש מספר מגבלות. ראשית, המגון על ידי מחזורים ההקפאה-הפשרה הוחלה ממחקר על נמטודות; לכן, השיטה יכול רק להיות יעיל נגד ecdysozoa. שנית, עקב ההגברה של מקטעי DNA במהלך שלב ספריה של רצף דנ א, האפשרות לשגיאות PCR שאי אפשר להתעלם ממנו. לפיכך, הנתונים רצף לא מומלץ לניתוח הדורשת דיוק גבוהה קריאות (כלומר, הסנ פ ניתוח). יתר על כן, כאמור לנו יש הפרוטוקול, השימוש של ערכת SNA-Seq שצוין שמוצג בטבלה של חומרים היא חיונית, בגלל הכמות הנמוכה של DNA קלט. זו ערכת בנייה ספריית DNA ligates אילומינה רצפים מתאם לפני ההגברה; לכן, ספריה זו אין אפשרות להחיל על רצף ארוך-קריאה באמצעות טכנולוגיית PacBio או Nanopore. לבסוף, בדיקת איכות של ספריית ה-DNA נבנה במהלך פרוטוקול זה מתרחש רק פעם אחת, לאחר הקמת ספריה רצף. זהו עקב נמוך הקלט של ה-DNA מאז רוב כימות דנ א, שיטות אלקטרופורזה אינו יכול לזהות עמ' 50-200 של ה-DNA. לכן, ערכנו בדיקות איכות, כגון אלקטרופורזה (איור 1), מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית quantifications, רק לאחר הגברה PCR.
דיון מלא של ביואינפורמטיקה ניתוח של נתונים אלה היא מעבר להיקף של מאמר זה; עם זאת, אנחנו הצהירו בקצרה מספר ניתוחים ערכנו. בדיקת איכות של הנתונים רצף עם FastQC19 מחשבת האיכויות לכל בסיס, שכפול רצף, נתוני רצף וכו יש כבר לאימות ניתן להגיש את מכלול הגנום. אנו אספנו גנום 132 Mb עם MaSuRCA v3.1.321 , השוו את הסטטיסטיקה מיפוי מחושב BWA22 ו QualiMap23 מתוך הספרייה רצפי DNA עם אחרים הרכבות הגנום dujardini ה 16. יתר על כן, אנו גם השתמשו נתונים רצף ה-DNA חדירת מזהמים שלנו המחקר17, מקיימות הקריאות ברצף מפוזרים באופן אחיד ברחבי הגנום.
רוב הפרוייקטים על אורגניזמים שאינם-דגם להתחיל culturing מספיק חומר מדגם, כפי שהיה עם tardigrades24. ההתקדמות הטכנית של טכניקות תרבות אפשרו כמויות גבוהות של תרבות tardigrade, אבל שיטות התרבות הנוכחית עדיין אינם aseptic, מאחר שרוב tardigrades הם עדיין unculturable במעבדות, זה היה כמעט בלתי אפשרי לנהל את הגנום או רצף transcriptome. שיטה זו רצף ה-DNA של אדם יחיד מאפשרת לנתח מינים נדירים tardigrade, כולל מינים ימיים זה נחקרו פחות. על-ידי עריכת גנומיקה השוואתי רחב באזור phyletic, הבנה נוספת של מנגנונים anhydrobiosis tardigrades עשוי להיות מושגת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים Nozomi אייב, יוקי Takai ו- Nahoko אישיאי על שלהם תמיכה טכנית ב רצף גנטי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק הסיוע עבור החברה יפן עבור עמית מחקר של קידום המדע (JSPS), מענק הסיוע KAKENHI למדענים צעירים (No.22681029), KAKENHI מענק הסיוע עבור מדעי למחקר (B), מספר 17 H 03620 JSPS, על ידי גרנט עבור פרויקטים מחקריים מדע בסיסי מן הקרן Sumitomo (No.140340), באופן חלקי על ידי קרנות מחקר ממשלת המחזו איוו ג'ימה, העיר Tsuruoka, יפן. כלורלה דלקתית נהגה לתת את tardigrades סופק באדיבות כלורלה תעשיית ושות' בע מ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L'alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
- Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
- Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
- Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
- May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L'état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
- Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
- Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination? Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
- Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
- Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
- Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
- Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
- Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
- Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
- Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
- He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
- Andrews, S. FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
- Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
- Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).
