Summary
Besmetting tijdens de genomic sequencing van microscopische organismen blijft een groot probleem. Hier, laten we een methode om het genoom van een beerdiertjes uit een enkel exemplaar met zo weinig als 50 pg van genomic DNA zonder het hele genoom versterking om te minimaliseren van het risico van besmetting.
Abstract
Beerdiertjes zijn microscopisch kleine dieren die worden ingevoerd door de staat van een ametabolic genaamd anhydrobiosis wanneer geconfronteerd met uitdroging en kan hun oorspronkelijke staat te herstellen wanneer water wordt aangevoerd. Het genoom sequentiebepaling van microscopisch kleine dieren zoals beerdiertjes risico's bacteriële besmetting dat soms tot verkeerde interpretaties, bijvoorbeeld met betrekking tot de omvang van horizontale genoverdracht in deze dieren leidt. Hier bieden we een ultralow input-methode om het genoom van de beerdiertjes, Hypsibius dujardini, van een enkel exemplaar. Door gebruik te maken van strenge wassen en verontreinigingen uitsluiting samen met een efficiënte winning van de 50 ~ 200 pg genomic DNA van een enkel individu, we gebouwd een bibliotheek sequenced met een DNA-sequencing-instrument. Deze bibliotheken waren zeer reproduceerbaar en onbevooroordeelde, en een analyse van de informatica van de gesequenceerd luidt met andere H. dujardini -genoom toonden een minimale hoeveelheid verontreiniging. Deze methode kan worden toegepast op unculturable beerdiertjes die niet kon worden sequenced met behulp van de vorige methoden.
Introduction
Beerdiertjes zijn microscopisch kleine dieren die een ametabolic staat genoemd anhydrobiosis wanneer geconfronteerd met uitdroging kunnen worden ingevoerd. Zij herstellen door de absorptie van water1,2. In de ametabolic staat kunnen beerdiertjes gedogen van verschillende extreme omgevingen, waaronder extreme temperaturen3 en druk4,5, een hoge dosering van ultraviolet licht6, x-stralen en gammastralen 7 , 8en9van de kosmische ruimte. Genomic gegevens is een onmisbaar fundament voor de studie van moleculaire mechanismen van anhydrobiosis.
Eerdere pogingen om het genoom van beerdiertjes is gebleken tekenen van bacteriële besmetting10,11,12,13,14. Genoom sequentiebepaling van dergelijke kleine organismen vereist een groot aantal dieren en is gevoelig voor bacteriële besmetting; Daarom hebben we een protocol van de sequencing met behulp van een ultralow invoermethode vanaf een enkel exemplaar van beerdiertjes, tot een minimum beperken van het risico van verontreinigingen15eerder opgericht. Met behulp van deze gegevens, hebben we verder uitgevoerd een kwalitatief hoogwaardige manipulatie en de opbouw van het genoom van H. dujardini16,17. Hier beschrijven we in detail deze methode voor het genomic rangschikken van een individu tardigrade ()Figuur 1). De validatie van deze methode sequencing is voorbij de focus van dit papier en is reeds grondig besproken in ons vorige verslag16.
Deze methode bestaat uit twee delen: de isolatie van een enkele beerdiertjes met de laagst mogelijke verontreiniging en de kwalitatief hoogwaardige extractie van pictogram niveaus van DNA. De beerdiertjes is uitgehongerd en grondig gespoeld met water, evenals antibiotica en waargenomen onder een microscoop met vergroting van 500 X om het verwijderen van eventuele bacteriële besmetting. Eerdere schattingen en metingen tonen aan dat een enkel individu van beerdiertjes ongeveer 50-200 pg genomic DNA16, die is geëxtraheerd bevat door het kraken van chitine exoskeleton door cycli bevriezen-ontdooien of door handmatige homogenisering. Deze genomic DNA is voorgelegd aan de bouw van de bibliotheek en sequenced op een DNA-sequencing-instrument. Een extra informatica-analyse toont kwalitatief hoogwaardige sequencing, evenals lage niveaus van verontreiniging in vergelijking met eerdere tardigrade sequencing projecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding
- Bereiden van 2% agarose gel met gedestilleerd water (DW) als het oplosmiddel in een 90-mm kunststof cultuur schotel, en 10 mL van een 1% penicilline/streptomycine cocktail met DW. De gel kan worden opgeslagen voor 2-3 weken in een couveuse ingesteld bij 18 ° C.
Opmerking: Vermijd elke opslag van de gel onder 10 ° C, voor de lage temperatuur zal het krimpen van het agarose gel, resulterend in een minuscuul kloof tussen de gel en de cultuur schotel muur waarin de beerdiertjes opgesloten kunnen worden.
2. voorbereiding en uitsluiting van verontreinigingen van de proeven
- Een enkele beerdiertjes verzamelen, plaats het op de voorbereide agarplaat en wassen 2 x - 3 x met DW om eventuele resterende deeltjes te verwijderen.
- Incubeer de beerdiertjes bij 18-22 ° C gedurende 24 uur overtollig voedsel uit de darmen verwijderen.
- Plaats de uitgehongerd beerdiertjes in penicilline/streptomycine antibiotica voor 2-6 h tot Verwijder eventuele bacteriële besmetting en plaats van de gedecontamineerde dier op een glas van de schone dia met behulp van een precisiepipet P10.
- Observeer de beerdiertjes onder een microscoop op 500 X vergroting en bevestigen dat er geen resterende bacteriën.
Opmerking: De hoge vergroting met een stereomicroscoop is optimaal, maar een optische Microscoop kan worden gebruikt als alternatief zonder toepassing van een dekglaasje aan. - Verzamelen van het individu met behulp van een precisiepipet van de P10 met een maximum van 5 µL van vloeistof, plaatst u deze in een lage-bindende polymerase kettingreactie (PCR) buis en verwijderen als veel overtollige vloeistof mogelijk.
Opmerking: De slangen, buizen van PCR en Pipetteer tips moeten lage binding aan het minimaliseren van het verlies van DNA.
Opmerking: Gedragingen een homogenisering zo spoedig mogelijk, voor de snelle uitdroging of dood van het dier aanzienlijk schade kan toebrengen aan de genomic DNA.
3. de homogenisering en DNA-extractie
- Meng het dier om te verkrijgen zijn genomic DNA (gDNA) met een van de volgende methoden.
Opmerking: Het is cruciaal voor het gebruik van de opgegeven kit komt te staan in de Tabel van materialen in de volgende stappen in DNA-extractie voor andere kits (kolom en kraal gebaseerd) niet effectief op deze extreem lage input zijn. De genomische lysis-buffermengsel is geleverd met 0,5% bèta-mercaptoethanol vóór gebruik.- Meng het dier met freeze-en-dooi cycli18.
- Onmiddellijk na stap 2.5, voeg 100 µL van lysis buffer aan de PCR-buis met de beerdiertjes.
- Plaats van de PCR-buis in vloeibare stikstof voor 10 min en voor 10 min, verplaatsen naar een warmte blok opgewarmd tot 37 ° C. Herhaal deze stap 2 x.
Opmerking: Deze stap kan worden herhaald wanneer de homogenisering niet voldoende is of er wordt uitgevoerd na het handmatige neerslaan.
- Handmatig het verpletteren van het dier.
- Onmiddellijk na stap 2.5, onder een stereomicroscoop, crush van het individu met het P10-uiteinde van de pipet door te drukken op het dier tegen de buiswand PCR, en onmiddellijk Voeg 100 µL van lysis buffer.
Opmerking: Het is cruciaal voor het observeren van deze procedure onder een stereomicroscoop, omdat de beerdiertjes gemakkelijk weg glijden kan en inefficiënte pletten in een gebrek resulteren zal aan het uitpakken van de gDNA. Zorg ervoor dat de tardigrade cuticle gebroken, is zodat de lysis-buffermengsel in het organisme infiltreren kan.
- Onmiddellijk na stap 2.5, onder een stereomicroscoop, crush van het individu met het P10-uiteinde van de pipet door te drukken op het dier tegen de buiswand PCR, en onmiddellijk Voeg 100 µL van lysis buffer.
- Meng het dier met freeze-en-dooi cycli18.
- Incubeer de buis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voor lysis optreden.
Opmerking: Minimaal 30 min is vereist voor een efficiënte lysis, maar de incubatietijd kan langer. - Het volledige volume (100 µL) van de lysis mengsel naar een schone 1.5-mL laag-bindende microtube overbrengen.
- Voeg 100 µL van lysis buffer aan de lage-bindende PCR buis die werd gebruikt voor de homogenisering en is nu leeg, en na het mengsel pipetteren, over te brengen naar de 1.5-mL laag-bindende microtube gebruikt in stap 3.3. Herhaal deze stap 2 x.
- Zoals in stap 3.4, voeg 300 µL van lysis buffer aan de PCR-buis van lage-bindende en, na pipetteren, het mengsel te verplaatsen naar de 1.5-mL laag-bindende microtube. De 1.5-mL laag-bindende microtube moet bevatten 600 µL van het mengsel na deze stap.
Opmerking: Deze stappen zijn om te minimaliseren van het verlies van gDNA gebonden aan de buiswand PCR, door het monster meerdere keren wassen. - Het totaal van 600 µL van lysis mengsel toevoegen aan de spin-kolom in een collectie buis geplaatst en Centrifugeer het bij 10.000 x g voor 1 min.
- Opnieuw toepassen van de stroom door naar de kolom samen en Centrifugeer het bij 10.000 x g voor 1 min.
Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat het merendeel van de gDNA is gebonden aan de kolom. - Voeg 500 µL van was buffer naar de spin kolom samen en Centrifugeer het bij 10.000 x g voor 1 min. overdracht de spin kolom een schone 1.5-mL microtube.
- Breng 20 µL van 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, naar de spin kolom, wacht 5 minuten bij kamertemperatuur, en Centrifugeer het bij 10.000 x g voor 1 min.
Opmerking: De elutie buffer mag geen EDTA, bevatten voor het interfereert met de bibliotheek voorbereiding enzymen. - De stroom door de kolom spin, en na 5 min van incubatie bij kamertemperatuur opnieuw van toepassing, het gedurende 1 minuut bij 10.000 x g centrifugeren.
Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang om de maximale elutie van de gDNA die afhankelijk is van de kolom.
4. bibliotheek bouw volgorde
-
Fragmentatie van DNA
- 15 µL van de eluant van de gDNA overbrengen in een 15-µL microtube voor fragmentatie van DNA en centrifugeer de buis voor 1 min met behulp van een tafelblad microcentrifuge.
Opmerking: De opgegeven microtube weergegeven in de Tabel van materialen is optimaal voor een lage input. De fragmentatie met laag-volume ultrasoonapparaat is essentieel, en dit kan niet worden vervangen door enzymatische fragmentatie vanwege de extreem lage concentratie van DNA. - Fragment van de gDNA tot 550 bp.
Opmerking: De 550 bp instellingen wij gebruikt zijn als volgt: incident piekvermogen = 30 W, plicht factor = 20%, cycli per burst = 50, behandeltijd 23 = s. - Na een grondige pipetteren, door 10 µL van het gefragmenteerde DNA mengsel te overbrengen in een schone laag-bindende PCR buis.
Opmerking: Het experiment kan hier gestopt worden. Behouden van het DNA bij 4 ° C of -20 ° C.
- 15 µL van de eluant van de gDNA overbrengen in een 15-µL microtube voor fragmentatie van DNA en centrifugeer de buis voor 1 min met behulp van een tafelblad microcentrifuge.
-
Bibliotheek bouw volgorde
Opmerking: Het is absoluut cruciaal te gebruiken van de opgegeven kit in de Tabel van materialen in de volgende procedures, vanwege de lage hoeveelheid input DNA.- Voeg 2 µL van de sjabloon voorbereiding buffer en 1 µL van het sjabloon voorbereiding enzym en meng ze met een pipet.
- Uitvoeren van de sjabloon voorbereiding reactie op een thermische cycler met de volgende voorwaarden: 22 ° C gedurende 25 minuten, 55 ° C gedurende 20 min, 4 ° C houden en een verwarmde deksel bij 101-105 ° C. Zodra de reactie wordt voltooid, gaat u verder met de volgende stap.
- 1 µL van de bibliotheek synthese buffer en 1 µL van het enzym van de synthese bibliotheek toevoegen aan de sjabloon voorbereiding reactieproduct en Incubeer het mengsel bij 22 ° C gedurende 40 min (met een 4 ° C houden). Zodra de reactie wordt voltooid, gaat u verder met de volgende stap.
- Voeg 30 µL van de bibliotheek amplificatie master mix (25 µL van de bibliotheek amplificatie buffer 1 µL van het enzym bibliotheek versterking en 4 µL van nuclease-gratis water) en 5 µL van het indexeren reagens.
- Meng alles met een pipet en Centrifugeer het mengsel kort met een tafelblad centrifuge.
- Een PCR uitvoeren met de voorwaarden die zijn opgenomen in tabel 1.
| Temperatuur | Tijd | Cycli |
| 72 ˚C | 3 minuten | |
| 85 ˚C | 2 minuten | |
| 98 ˚C | 2 minuten | |
| 98 ˚C | 20 seconden | 4 cycli |
| 67 ˚C | 20 seconden | |
| 72 ˚C | 40 seconden | |
| 98 ˚C | 20 seconden | 16 cycli |
| 72 ˚C | 50 seconden | |
| 4 ˚C | Houd |
Tabel 1: PCR voorwaarden.
-
Zuivering van de PCR producten
Opmerking: Deze stap kan worden vervangen door andere methoden van zuivering. Als een alternatieve methode wordt gebruikt, zorg ervoor om te controleren of de resulterende DNA zuiverheid met behulp van een spectrofotometer. Absorptie ratio's van 260/280 en 260/230 moet zowel boven 1.8.- Voeg 50 µL van magnetische kralen, Pipetteer de oplossing 10 x, samen en Centrifugeer het kort met een tafelblad microcentrifuge.
- Laat de oplossing gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
- Incubeer het op een magnetische stand gedurende 5 minuten of totdat de oplossing volledig wordt leegmaken, en het supernatant wilt verwijderen.
- 200 µL van vers bereide 80% ethanol toevoegen aan de lage-bindende PCR buis op een magneet-stand, wacht 30 s, en verwijder de bovendrijvende substantie. Herhaal deze stap 2 x. De kralen niet storen.
- Kort centrifugeren van de lage-bindende PCR buis met een tafelblad centrifuge en verwijder alle overtollige ethanol op de magnetische stand. Drogen van de kralen, maar vermijd uitdrogen.
- Resuspendeer de kralen met 15 µL van 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 grondig Pipetteer de oplossing zodat de magnetische kralen zijn homogeen verdeeld, Incubeer de buis gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, en na een kort centrifugeren, Incubeer het op een magnetische stand voor 2 min totdat de oplossing helder is.
Opmerking: De elutie buffer mogen geen EDTA, voor het interfereert met de sequencing-chemie. - Breng het supernatant, zonder verstoring van de pellet, tot een nieuwe lage-bindende PCR koker.
Opmerking: Het experiment kan hier gestopt worden. Behoud van het DNA bij 4 ° C of bij-20 ° C gedurende lange tijd opslag.
5. de kwaliteitscontrole, kwantificering en opeenvolging van DNA
Opmerking: Een kwaliteitscontrole wordt niet uitgevoerd vóór deze stap als gevolg van de lage hoeveelheid DNA.
-
Validatie van de verdeling van de grootte van de bibliotheek van DNA
Opmerking: Andere hoog-gevoelige elektroforese systemen met een digitale rapportage van grootteverdeling kunnen worden gebruikt.- Retourneren van de elektroforese buffer reagens en gel cartridge (25-1000 bp in bereik) tot kamertemperatuur.
- Voeg 3 µL van elektroforese buffer reagens met 1 µL van de sequencing-bibliotheek en meng ze grondig voor 1 min met een vortex en kort centrifugeren hen met een tafelblad centrifuge.
- Voeren van elektroforese en valideren van de grootteverdeling van de bibliotheek met de bijbehorende software. De belangrijkste fragment piek moet worden over het algemeen variërend van ongeveer 300 tot 1000 bp.
-
Kwantificering van DNA
Opmerking: Andere fluorescentie gebaseerde methoden of kwantitatieve PCR kan ook worden gebruikt, maar spectrofotometrie moet worden vermeden, want het is niet nauwkeurig genoeg voor het kwantificeren van sequencing bibliotheken.- Voeg 796 µL van oplossing buffer en 4 µL van fluorescerende reagens en meng ze. Afzien van 190 µL van de werkoplossing twee assay buizen en 197 µL aan één assay buis.
- Voeg 10 µL van normen met een bekende concentratie van DNA aan elke test-buis met 190 µL van de werkoplossing, en 3 µL van de bereid bibliotheek aan de test-buis met 197 µL van de werkoplossing.
- Vortex de buizen kort samen en centrifugeer ze op een tafelblad centrifuge. Het DNA een Fluorimeter met 3-µL instellingen te kwantificeren.
-
Bibliotheek opeenvolging van DNA
Opmerking: De sequencing-platform moet verenigbaar zijn met het bouwpakket voor de opgegeven mediawisselaar.- Bereiden de sequencing-bibliotheek gebaseerd op protocol van de fabrikant.
- Stel de reagens cassette en stroom-cel in de sequencing-instrument en de volgorde uitgevoerd volgens protocol van de fabrikant informatie invoeren.
- De volgorde worden uitgevoerd.
Opmerking: We hebben twee sequencing runs uitgevoerd: een monster/uitvoeren, evenals vier monsters multiplexed in één punt.
6. computationele analyse
- Base-oproep en, indien nodig, demultiplex het luidt als volgt.
- De kwaliteit van de gegevens van de reeks met FastQC19te valideren.
Opmerking: Zie voor een meer diepgaande validatie van de verkregen data, onze vorige verslag16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verontreinigingen uitsluiting:
Dit protocol omvat een grondige wassen van de beerdiertjes en een sterilisatie met antibiotica behandeling tot een minimum beperken van verontreiniging. Het gaat ook om een visuele controle proces om ervoor te zorgen de volledigheid van deze processen. Een afbeelding van de Microscoop gemaakt tijdens de validatie (stap 2.4 van het protocol) is afgebeeld in Figuur 2. Wanneer waargenomen bij een 500 X vergroting, kunnen bacteriële cellen worden gezien als kleine deeltjes die de individuele beerdiertjes bewegen.
Validatie van de kwaliteit van de bibliotheek DNA:
Het totale bedrag van de geconstrueerde DNA-Seq-bibliotheek is ongeveer 109.5 ng (7.3 ng/µL x 15 µL)16. Voor het valideren van de verdeling van de lengte van de versnippering, moeten een elektroforese patroon vergelijkbaar Figuur 3. Als we de grootte van de versnippering aan 550 bp met een DNA schuintrekken systeem, moet de bibliotheek 550-600 bp, met inbegrip van de sequencing-adapters. Het kan worden waargenomen dat de meerderheid van de reeks-bibliotheek is opgenomen tussen 200-1000 bp en consistente tussen replicatieonderzoeken (N1 - N4).
De analyse van de gegevens van de reeks:
De DNA-sequencing gegenereerd ongeveer 20 - tot 25-M gepaarde leest per run. De validatie van de kwaliteit werd uitgevoerd met behulp van FastQC (Figuur 4). De verdeling van de kwaliteit langs de gesequenceerd lezen is typerend voor een 300-bp gepaarde run.
Figuur 1: Workflow van dit protocol. Deze figuur toont een samenvatting van dit protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatieve foto van een bacterie-vrije beerdiertjes. Deze figuur toont beelden van een verontreinigde (links) beerdiertjes en gereinigd (rechts) beerdiertjes (Hypsibius dujardini), samen met verder vergroot afbeeldingen (onder). Staafvormige cellen rond de beerdiertjes zijn van verontreinigingen en worden aangegeven met een pijl. Geeft de schaal balk 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Validatie van de verdeling van de lengte fragment van de geconstrueerde DNA bibliotheek. Dit paneel toont de verdeling van de grootte van de bibliotheek sequencing. De paarse en groene lijnen geven de bovenste en onderste markers op 1.500 en 25 bp, respectievelijk. L = Ladder, S = 1 monster/uitvoeren, N1 - N4 = 4 replicatieonderzoeken/uitvoeren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Voorbeeld van de validatie van de DNA-Seq-kwaliteit met FastQC. DNA-Seq gegevens werden ingediend bij FastQC voor het valideren van de reeks prestaties. Een representatief resultaat voor DRR055040 per basis volgorde kwaliteit blijkt (DDBJ volgorde lezen archief DRA00445516). (A) dit paneel toont de voorwaartse leest (R1). (B) dit paneel toont de omgekeerde leest (R2). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bacteriële besmetting vormt een bedreiging voor het genoom sequentiebepaling van microscopisch kleine organismen. Hoewel eerdere studies op tardigrade genoom sequencing hebt gefilterd uit besmetting met behulp van uitgebreide informatica methoden12,20, sequenced we het genoom van een individu om te minimaliseren van het risico van verontreinigingen. Aangezien een individuele beerdiertjes bevat ongeveer 50-200 pg genomic DNA16 en is ingekapseld in een dikke laag van chitine exoskelet, de uitsluiting van verontreinigingen en DNA-extractie van hoge kwaliteit zijn de kritieke punten in dit protocol. Bestaande beerdiertjes culturen zijn niet aseptische, en die verzameld uit het wild carry een heleboel verontreinigingen op het oppervlak, evenals de overblijfselen van voedsel in hun darmen. Vorige genoom sequencing projecten van beerdiertjes hebben sequenced 10.000-100.000 personen gezamenlijk als één monster12,14, wat betekent dat de resultaten zijn zeer waarschijnlijk worden beïnvloed door bacteriële contaminanten. In hun verslag Boothby et al. H. dujardini individuen verzameld met behulp van hun gedrag negatief phototaxis14, en de groep heeft anti-bacteriële methoden niet tewerkstellen.
Visueel onderzoek naar als er verontreinigingen, we geïncubeerd de beerdiertjes in antibiotica (penicilline/streptomycine) en het individu onder een 500 X microscoop onderzocht. Door het isoleren van een enkel individu en het zorgvuldig inspecteren op eventuele verontreinigingen, geminimaliseerd wij het risico van mogelijke besmettingen. Lage niveaus van besmetting werden bevestigd vanaf de gegevens rangschikken als goed16. Zoals voor DNA-extractie werkzaam wij handmatige homogenisering, evenals thermische homogenisering18. Door het indienen van de tardigrade individueel tot vloeibare stikstof en 37 ° C, scheuren in het exoskelet van chitine waren geïnduceerde en de lysis-buffermengsel kon doordringen in het lichaam en lyse de cellen. Wanneer de opbrengst van DNA lager blijft dan verwacht, kan zowel thermische als handmatige homogenisering worden uitgevoerd om te maximaliseren van het rendement.
De methode in dit artikel vermeld heeft verscheidene beperkingen. Eerst, homogenisering door bevriezing-en-dooi cycli werd toegepast van een studie over de nematoden; dus kan de methode alleen effectief zijn tegen ecdysozoa. Ten tweede, als gevolg van de versterking van DNA-fragmenten in de DNA-sequentie bibliotheek-fase, de mogelijkheid van PCR fouten kan niet worden genegeerd. Dus, de sequencedata wordt niet aanbevolen voor analyse die hoog-nauwkeurigheid leest vereist (dat wil zeggen, SNP analyse). Bovendien, zoals we hebben gezegd in het protocol, het gebruik van de opgegeven SNA-Seq kit komt te staan in de Tabel van materialen is absoluut cruciaal, vanwege de lage hoeveelheid input DNA. De bouwdoos van deze DNA-bibliotheek ligates Illumina adapter sequenties vóór de versterking; Daarom is deze bibliotheek kan niet worden toegepast voor het rangschikken van de lange-lezen met behulp van PacBio of Nanopore technologie. Tot slot, een kwaliteitscontrole van de gebouwde DNA bibliotheek tijdens dit protocol treedt slechts eenmalig, na de bouw van de bibliotheek sequencing. Dit is te wijten aan de lage input van DNA sinds de meeste DNA kwantificering en elektroforese methoden niet wordt gedetecteerd door 50-200 pg van DNA. We hebben daarom, kwaliteitscontroles, zoals de elektroforese (Figuur 1) en fluorescentie gebaseerde ondermeer, uitgevoerd nadat de PCR versterking.
Een volledige bespreking van bioinformatica analyses van deze gegevens valt buiten het bestek van dit artikel; Wij hebben echter kort gezegd diverse analyses die we hebben uitgevoerd. Een kwaliteitscontrole van de gegevens rangschikken met FastQC19 berekent de kwaliteiten van de per-base, reeks doublures, etc. sequencedata die zijn gevalideerd kunnen worden ingediend bij de vergadering van het genoom. We hebben geassembleerd een genoom 132 Mb met MaSuRCA v3.1.321 en vergeleken met de statistieken van de toewijzing berekend met BWA22 en QualiMap23 van deze DNA-sequencing bibliotheek met andere H. dujardini genoom assemblages16. Bovendien, we ook deze DNA-sequencing gegevens hebben gebruikt voor de uitsluiting van verontreinigingen in onze studie17en geconstateerd dat de gesequenceerd leest gelijkmatig zijn verdeeld in het genoom.
De meeste projecten op niet-modelorganismen vanaf culturing genoeg monstermateriaal, zoals het geval met beerdiertjes24 was. Technische vooruitgang in de cultuur technieken hebt ingeschakeld hoge hoeveelheden van tardigrade cultuur, maar huidige cultuur-methoden nog niet aseptische en sinds meeste beerdiertjes nog steeds unculturable in laboratoria zijn, is het bijna onmogelijk om te voeren genoom of transcriptoom sequentie. Deze DNA-sequencing-methode van een enkel individu maakt het mogelijk om het analyseren van de zeldzame tardigrade soorten, met inbegrip van mariene soorten die minder hebben bestudeerd. Door het uitvoeren van vergelijkende genomica op een groter phyletic gebied, kan een verder inzicht in anhydrobiosis mechanismen in beerdiertjes worden bereikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Nozomi Abe, Yuki Takai en Nahoko Ishii voor hun technische ondersteuning in genomic sequencing. Dit werk werd gesteund door de Grant-in-Aid voor de vereniging van Japan voor de promotie van wetenschap (JSPS) Research Fellow, KAKENHI Grant-in-Aid voor jonge wetenschappers (No.22681029) en KAKENHI Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek (B), No. 17 H 03620 van de JSPS, door een Subsidie voor elementaire wetenschap-onderzoeksprojecten uit The Sumitomo Foundation (No.140340), en deels door de middelen voor onderzoek van de departementale overheid Yamagata en Tsuruoka City, Japan. Chlorella vulgaris gebruikt om te voeden de beerdiertjes was voorzien hoffelijkheid van Chlorella Industry Co. LTD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L'alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
- Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
- Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
- Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
- May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L'état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
- Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
- Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination? Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
- Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
- Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
- Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
- Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
- Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
- Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
- Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
- He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
- Andrews, S. FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
- Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
- Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).
