Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Ultralow inngang genomet sekvensering biblioteket forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøven

doi: 10.3791/57615 Published: July 15, 2018

Summary

Forurensing under den genomisk sekvensering av mikroskopiske organismer er fortsatt et stort problem. Her viser vi en metode for å sekvens genomet av en Bjørnedyr fra en enkelt prøve med 50 pg genomisk DNA uten hele genomet forsterkning å minimere risikoen for forurensning.

Abstract

Tardigrades er mikroskopiske dyr som angir en ametabolic tilstand kalt anhydrobiosis når uttørking og kan gå tilbake til sin opprinnelige tilstand når vannet er angitt. Den genomisk sekvensering av mikroskopiske dyr som tardigrades risiko bakteriell forurensning som noen ganger fører til fremtiden, for eksempel om omfanget av horisontal genoverføring i disse dyrene. Her gir vi en ultralow inndatametode til å sekvens genomet av Bjørnedyr, Hypsibius dujardini, fra et enkelt eksemplar. Ved å bruke strenge vask og miljøgifter utelukkelse sammen med en effektiv utvinning av 50 ~ 200 pg genomisk DNA fra en enkeltperson, vi bygget et bibliotek sekvensielt med en DNA sekvensering instrument. Disse bibliotekene var svært reproduserbare og upartisk, og en informatikk analyse i sekvensert lyder med andre H. dujardini genomer viste en minimal mengde forurensning. Denne metoden kan brukes til unculturable tardigrades som ikke kan være sekvensielt ved hjelp av metodene.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tardigrades er mikroskopiske dyr som kan angi en ametabolic tilstand som kalles anhydrobiosis når mot uttørking. De gjenopprette absorpsjon av vann1,2. Ametabolic staten er tardigrades i stand til å tolerere ulike ekstreme miljøer, som inkluderer ekstreme temperaturer3 og press4,5, en høy dose av ultrafiolett lys6, røntgenstråler og gammastråling 7 , 8og kosmiske rom9. Genomic data er en uunnværlig for å studere molekylære mekanismer av anhydrobiosis.

Tidligere forsøk på å sekvens genomet av tardigrades har vist tegn på bakteriell forurensning10,11,12,13,14. Genomic sekvensering fra slike små organismer krever et stort antall dyr og er liggende å bakteriell forurensning; Derfor har vi tidligere etablert en sekvensering protokollen bruker en ultralow inndatametode fra en enkelt eksemplar av Bjørnedyr, for å minimere risikoen for forurensing15. Bruker disse dataene, har vi ytterligere gjennomført en høy kvalitet resequencing og gjenoppbygging av genomet av H. dujardini16,17. Her vi beskrive i detalj denne metoden for genomisk sekvensering fra en tardigrade enkeltperson ()figur 1). Validering av denne sekvensering metoden er utover fokuset i dette papiret og har allerede vært utredet grundig i vår forrige rapport16.

Denne metoden består av to deler: isolering av en enkelt Bjørnedyr med lavest mulig forurensing og høy kvalitet utvinning av piktogram DNA. Bjørnedyr er utsultet skylles grundig med vann, samt antibiotika og observerte under et mikroskop med 500 X forstørrelse å sikre fjerning av alle bakteriell forurensning. Tidligere estimater og målinger viser at en enkeltperson av Bjørnedyr inneholder ca 50-200 pg genomisk DNA16, som er utvunnet av cracking chitin ytre skjelett av fryse-Tin sykluser eller manuell homogenisering. Denne genomisk DNA er sendt til biblioteket konstruksjon og rekkefølge på en DNA sekvensering instrument. En ekstra informatikk analyse viser høy kvalitet sekvensering, i tillegg til lave nivåer av forurensning i forhold til tidligere tardigrade sekvensering prosjekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. forberedelse

  1. Forberede 2% agarose gel med destillert vann (DW) som løsemiddelet i en 90 mm plast kultur parabol, og 10 mL av en 1% penicillin/streptomycin cocktail med DW. Gelen kan lagres i 2-3 uker i en inkubator satt på 18 ° C.
    Merk: Unngå alle lagring av gel under 10 ° C, for lav temperatur krymper agarose gel, som resulterer i en minuscule gapet mellom gel og kultur parabol veggen der tardigrades kan bli fanget.

2. prøve forberedelse og miljøgifter eksklusjon

  1. Samle en enkelt Bjørnedyr, plassere den på forberedt agar platen og vaske det 2 x - 3 x med DW å fjerne eventuelle gjenværende partikler.
  2. Inkuber Bjørnedyr på 18-22 ° C i 24 h å fjerne alle overmål næringen fra tarmen.
  3. Plass den starved Bjørnedyr i penicillin/streptomycin antibiotika for 2-6 h å fjerne alle bakteriell forurensning og plassere decontaminated dyr på en ren skyve glass med en P10 pipette.
  4. Observere Bjørnedyr under et mikroskop på 500 X forstørrelse og bekrefter at det ikke er noen gjenværende bakterier.
    Merk: Høy forstørrelsen med en stereomicroscope er optimal, men en optisk mikroskop kan brukes også uten å bruke en dekkglassvæske.
  5. Samle enkelt bruker en P10 pipette maksimalt 5 µL av væske, Legg den i en lav-bindende polymerase kjedereaksjon (PCR) rør og fjerne så mye overflødig væske som mulig.
    Merk: Den microtubes, PCR rør og pipette-spisser skal være lav binding til minimere tap av DNA.
    Merk: Gjennomføre en homogenisering så snart som mulig, for rask uttørking eller drap av dyret kan betydelig skade genomisk DNA.

3. homogenisering og DNA utvinning

  1. Homogenize dyr for å få sin genomisk DNA (gDNA) med en av metodene nedenfor.
    Merk: Det er viktig å bruke angitte utstyret vist i Tabellen for materiale i følgende DNA utvinning trinnene for andre kits (enten kolonne og perle basert) ikke er effektiv på denne ekstremt lav input. Genomic lyseringsbuffer er angitt med 0,5% beta-mercaptoethanol før bruk.
    1. Homogenize dyr med fryse og tine sykluser18.
      1. Rett etter trinn 2.5, legge til 100 µL av lyseringsbuffer PCR røret som inneholder Bjørnedyr.
      2. Sett PCR røret i flytende nitrogen for 10 min og for 10 min, flytte den til en varme blokk varmet til 37 ° C. Gjenta dette trinnet 2 x.
        Merk: Dette trinnet kan gjentas når homogenisering er ikke tilstrekkelig eller kan utføres etter manuell knusing.
    2. Manuelt knuse dyret.
      1. Rett etter trinn 2.5, under en stereomicroscope, knuse enkelt med P10 spissen av pipette ved å trykke dyret mot PCR tube veggen, og umiddelbart legge 100 µL av lyseringsbuffer.
        Merk: Det er viktig å observere denne fremgangsmåten under en stereomicroscope, fordi Bjørnedyr kanne lett skli bort, og ineffektiv knusing vil resultere i en feil å trekke gDNA. Kontroller at tardigrade cuticle er ødelagt slik at lyseringsbuffer kan infiltrere organismen.
  2. Inkuber røret i 30 min ved romtemperatur for lysis oppstår.
    Merk: Minst 30 min kreves for en effektiv lyse, men inkubering kan være lengre.
  3. Overføre hele volumet (100 µL) av lyse blandingen til en ren 1.5-mL lav-bindende microtube.
  4. Legg 100 µL av lyseringsbuffer til lav-bindende PCR røret som ble brukt for homogenisering og er nå tom, og etter pipettering blandingen, overføre det til 1.5-mL lav-bindende microtube brukt i trinn 3.3. Gjenta dette trinnet 2 x.
  5. Som i trinn 3.4, legger 300 µL av lyseringsbuffer til lav-bindende PCR røret, og etter pipettering, flytte blandingen til 1.5-mL lav-bindende microtube. 1.5-mL lav-bindende microtube bør inneholde 600 µL av blandingen etter dette trinnet.
    Merk: Disse trinnene er å redusere tap av gDNA bundet til PCR tube veggen, ved å vaske eksemplet flere ganger.
  6. Legg hele 600 µL av lysis blanding kolonnen spinn plassert i en samling rør og sentrifuge det 10.000 x g for 1 min.
  7. Bruk nytt flyten gjennom kolonnen og sentrifuge det 10.000 x g for 1 min.
    Merk: Dette trinnet er avgjørende for å sikre at de fleste av gDNA er bundet til kolonnen.
  8. Legg til 500 µL av vaskebuffer kolonnen spinn og sentrifuge det 10.000 x g i 1 overføring spinn kolonnen til en ren 1.5-mL microtube.
  9. Bruk 20 µL av 10 mM Tris-HCl, pH 8.5, kolonnen spinn, vent 5 min i romtemperatur, og sentrifuge det 10.000 x g for 1 min.
    Merk: Elueringsbufferen må ikke inneholde EDTA, for det forstyrrer biblioteket forberedelse enzymer.
  10. Bruk nytt flyten gjennom kolonnen spinn, og etter 5 min med inkubering ved romtemperatur, sentrifuge det for 1 min 10 000 x g.
    Merk: Dette trinnet er avgjørende for å sikre maksimal tilsettes av gDNA bundet til kolonnen.

4. biblioteket bygging sekvens

  1. DNA fragmentering
    1. Overføre 15 µL av gDNA-eluant til en 15-µL microtube for DNA fragmentering og sentrifuge røret for 1 min ved hjelp av en tabletop microcentrifuge.
      Merk: Den angitte microtube vist i Tabellen for materiale er optimal for en lav input. Fragmentering med lavt volum sonication er avgjørende, og dette kan ikke erstattes med enzymatisk fragmentering på grunn av den ekstremt lav konsentrasjonen av DNA.
    2. Fragment gDNA til 550 bp.
      Merk: 550 bp innstillingene vi er som følger: peak hendelsen strøm = 30 W, plikt faktor = 20%, sykluser per briste = 50, behandling tid = 23 s.
    3. Etter en grundig pipettering, overføre 10 µL av fragmentert DNA blandingen til en ren lav-bindende PCR rør.
      Merk: Eksperimentet kan stoppes her. Bevare DNA 4 ° C eller 20 ° C.
  2. Biblioteket bygging sekvens
    Merk: Det er helt avgjørende å bruke angitte utstyret i Tabellen av materialer i følgende, på grunn av den lave mengden inn DNA.
    1. Legg 2 µL av malen forberedelse bufferen og 1 µL av malen forberedelse enzym og bland dem godt med en pipette.
    2. Utføre mal forberedelse reaksjonen på en termisk cycler med følgende vilkår: 22 ° C for 25 min, 55 ° C for 20 min, 4 ° C tak og oppvarmet lokk på 101-105 ° C. Når reaksjonen er fullført, fortsetter du til neste trinn.
    3. Legge til 1 µL av biblioteket syntese bufferen og 1 µL av biblioteket syntese enzym mal forberedelse reaksjon produktet og ruge blandingen på 22 ° C i 40 min (med 4 ° C tak). Når reaksjonen er fullført, fortsetter du til neste trinn.
    4. Legge til 30 µL av biblioteket forsterkning master mix (25 µL av biblioteket forsterkning bufferen, 1 µL av biblioteket forsterkning enzym og 4 µL nuclease uten vann) og 5 µL av indeksering reagensen.
    5. Bland alt godt med en pipette og sentrifuge blandingen kort med en tabletop sentrifuge.
    6. Utføre en PCR med betingelsene som er presentert i tabell 1.
Temperatur Tid Sykluser
72 GRADER 3 minutter
85 GRADER 2 minutter
98 GRADER 2 minutter
98 GRADER 20 sekunder 4 sykluser
67 GRADER 20 sekunder
72 GRADER 40 sekunder
98 GRADER 20 sekunder 16 sykluser
72 GRADER 50 sekunder
4 GRADER Hold

Tabell 1: PCR forhold.

  1. Rensing av PCR-produkter
    Merk: Dette trinnet kan erstattes med andre metoder for rensing. Hvis en alternativ metode brukes, sørg for å sjekke for den resulterende DNA renheten bruker et spektrofotometer. Absorbansen forholdstall på 260/280 og 260/230 må både over 1.8.
    1. Legge til 50 µL av magnetiske perler, Pipetter løsning 10 x, og sentrifuge det kort med en tabletop microcentrifuge.
    2. Inkuber løsningen i 2 minutter ved romtemperatur.
    3. Inkuber det på en magnetisk stå i 5 minutter eller til løsningen blir helt klart, og fjerne nedbryting.
    4. Legg 200 µL av nylagde 80% etanol til lav-bindende PCR røret på en magnet stand, vente 30 s, og fjern nedbryting. Gjenta dette trinnet 2 x. Ikke forstyrr perler.
    5. Kort sentrifuge lav-bindende PCR røret med en tabletop sentrifuge og fjerne alle overflødig etanol på magnetiske stand. Air-Dry perler, men unngå uttørring.
    6. Resuspend perler med 15 µL av 10 mM Tris-HCl, pH 8.5, grundig Pipetter løsningen slik at de magnetiske perlene fordeles homogent, ruge røret i 2 minutter ved romtemperatur, og etter en kort sentrifugering, ruge det på magnetiske standpunkt for 2 min før løsningen er klart.
      Merk: Elueringsbufferen kan ikke inneholde EDTA, for det forstyrrer sekvensering kjemi.
    7. Overføre nedbryting, uten å forstyrre pellet, å en ny lav-bindende PCR tube.
      Merk: Eksperimentet kan stoppes her. Bevare DNA på 4 ° C eller på 20 ° C for lang tid lagring.

5. kvalitetskontroll, kvantifisering og sekvens av DNA

Merk: Kvalitetskontroll er ikke utført før dette trinnet på grunn av lav beløpet av DNA.

  1. Validering av DNA biblioteket størrelsesDistribusjon
    Merk: Andre høy-sensitive geleelektroforese systemer med en digital rapportering av størrelsesDistribusjon kan brukes.
    1. Hjem geleelektroforese buffer reagensen gel patron (25-1000 bp i området) til romtemperatur.
    2. Legge 3 µL av geleelektroforese buffer reagensen med 1 µL av sekvensering biblioteket og bland dem grundig for 1 min med en vortex og kort sentrifuge dem med en tabletop sentrifuge.
    3. Utføre geleelektroforese og validere biblioteket størrelsesDistribusjon med den tilknyttede programvaren. Viktigste fragment toppen skal være bredt spenner fra ca 300 til 1000 bp.
  2. DNA kvantifisering
    Merk: Andre fluorescens-baserte metoder eller kvantitativ PCR kan også brukes, men spectrophotometry bør unngås, er det ikke nøyaktig nok for kvantifisere sekvensering biblioteker.
    1. Legg 796 µL løsning bufferen og 4 µL av fluorescerende reagensen og bland dem godt. Dispensere 190 µL av arbeider løsningen to analysen rør og 197 µL til en analysen tube.
    2. Legg 10 µL av standarder med kjente konsentrasjoner av DNA til hver analysen rør som inneholder 190 µL av arbeider løsningen og 3 µL av forberedt biblioteket til analysen røret som inneholder 197 µL av arbeider løsningen.
    3. Vortex rør kort og sentrifuge dem på en tabletop sentrifuge. Kvantifisere DNA bruker en fluorometer med 3-µL innstillinger.
  3. DNA biblioteket sekvens
    Merk: Sekvensering plattformen må være kompatibel med den angitte bibliotek construction kit.
    1. Forberede sekvensering biblioteket basert på produsentens protokollen.
    2. Angi reagens kassett og flyt cellen inn i sekvensering apparatet og angi sekvensering kjøre informasjon etter produsentens protokoll.
    3. Kjøre sekvensering.
      Merk: Vi har gjennomført to sekvensering kjører: en prøve/løpe, samt fire prøver multiplekset i ett Kjør.

6. beregningsorientert analyse

  1. Base ringe og eventuelt demultiplex lest.
  2. Validere kvaliteten sekvens data med FastQC19.
    Merk: For en mer dyptgående validering innhentet data, se vår forrige rapport16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Miljøgifter ekskludering:

Denne protokollen innebærer en grundig vask av Bjørnedyr og en sterilisering med antibiotika behandling for å redusere forurensning. Det omfatter også en visuell kontrollprosessen for å sikre fullstendigheten av disse prosessene. Et mikroskop-bilde laget under valideringsprosessen (trinn 2.4 protokollen) er vist i figur 2. Når observert på en 500 X forstørrelse, sees bakterieceller små partikler som flytter rundt Bjørnedyr personlige.

Validering av DNA biblioteket kvalitet:

Den totale mengden konstruert DNA-Seq biblioteket er ca 109.5 ng (7.3 ng/µL x 15 µL)16. For å validere lengden fordelingen av fragmentering, en geleelektroforese mønster bør være lik Figur 3. Vi satt fragmentering størrelsen til 550 bp med en DNA klipping systemet, biblioteket skal være 550-600 bp, inkludert sekvensering adaptere. Det kan være observert at flertallet av sekvens biblioteket finnes mellom 200-1000 bp og er konsekvent mellom replikat (N1 - N4).

Sekvens dataanalyse:
DNA-sekvenser generert omtrent 20 - til 25-M sammenkoblede leser per kjøre. Validering av kvaliteten ble utført med FastQC (Figur 4). Fordelingen av kvaliteten langs sekvensert lese er typisk 300-bp sammenkoblede rensing.

Figure 1
Figur 1: arbeidsflyten for denne protokollen. Denne illustrasjonen viser et sammendrag av denne protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representativt bilde av en bakterier-free Bjørnedyr. Denne illustrasjonen viser bilder av en forurenset (venstre) Bjørnedyr og renset (høyre) Bjørnedyr (Hypsibius dujardini), sammen med ytterligere forstørret bilder (nederst). Stav-formet cellene rundt Bjørnedyr er forurensning, og er merket med en pil. Baren skala angir 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Validering av fragment lengde fordelingen av konstruert DNET bibliotek. Dette panelet viser fordelingen av sekvensering biblioteket størrelse. Lilla og grønne linjene angir den øvre og nedre markører på 1500 og 25 bp, henholdsvis. L = stigen, S = 1 prøve/kjøre, N1 - N4 = 4 gjentak/kjøre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Eksempel på validering av DNA-Seq kvaliteten med FastQC. DNA-Seq dataene ble sendt til FastQC å validere sekvens ytelsen. En representant resultat for DRR055040 per base sekvensen kvaliteten vises (DDBJ sekvens lese arkivet DRA00445516). (A) dette panelet viser den fremre lest (R1). (B) dette panelet viser den omvendte lest (R2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bakteriell forurensning utgjør en trussel mot den genomisk sekvensering av mikroskopiske organismer. Mens tidligere studier på tardigrade genomet sekvensering har filtrert ut forurensning med omfattende informatikk metoder12,20, sekvensielt vi genomet fra en enkeltperson å minimere risikoen for forurensing. Siden en personlige Bjørnedyr inneholder ca 50-200 pg genomisk DNA16 og innkapslet i et tykt lag av chitin exoskeleton, utelukkelse av forurensninger og høy kvalitet DNA utvinning er de kritiske punktene i denne protokollen. Eksisterende tardigrades kulturer er ikke steril, og de samlet fra ville bære mye av forurensninger på overflaten, samt restene av mat i deres tarmen. Tidligere genomet sekvensering prosjekter av tardigrades har sekvensert 10 000-100.000 personer samlet som ett eksempel12,14, som betyr at resultatene er svært sannsynlig påvirke av bakteriell forurensning. I sin rapport, Boothby et al. samlet H. dujardini personer ved hjelp av deres negative phototaxis atferd14, og gruppen ansette ikke noen anti-bakterielle metoder.

Å visuelt undersøke om det er miljøgifter, vi ruges Bjørnedyr i antibiotika (penicillin/streptomycin) og undersøkt enkelt under 500 X mikroskop. Isolere en enkeltperson og nøye inspisert for eventuelle forurensninger, minimert vi risikoen for mulig forurensing. Lave nivåer av forurensning ble bekreftet fra sekvensering dataene godt16. Som for DNA utvinning ansatt vi manuell homogenisering, samt termisk homogenisering18. Ved å sende den tardigrade enkelt flytende nitrogen og 37 ° C, sprekker ble indusert i chitin ytre skjelett, og lyseringsbuffer kunne trenge kroppen og lyse cellene. Når DNA avkastningen er lavere enn forventet, kan både termisk og manuell homogenisering utføres for å maksimere avkastningen.

Metoden nevnt i denne artikkelen har flere begrensninger. Først ble homogenisering av fryse og tine sykluser brukt fra en studie på nematoder; Dermed kan metoden bare være effektiv mot ecdysozoa. Dernest på grunn av forsterkning av DNA i DNA sekvens biblioteket fasen, ikke kan muligheten for PCR feil ignoreres. Dermed sekvens data er ikke anbefalt for analyse som krever høy nøyaktighet leser (dvs. SNP analyse). Videre, som vi har nevnt i protokollen, bruken av den angitte SNA-Seq kit vist i Tabellen for materiale er helt avgjørende, på grunn av den lave mengden inn DNA. Denne DNA biblioteket construction kit ligates Illumina adapter sekvenser før forsterkning; Derfor kan ikke dette biblioteket brukes for lang lese sekvensering med PacBio eller Nanopore. Til slutt, kvalitetskontroll av konstruert DNET bibliotek under denne protokollen oppstår bare én gang, etter sekvensering bibliotek. Dette skyldes lav input av DNA siden de fleste DNA kvantifisering og geleelektroforese metoder finner 50-200 pg DNA. Vi har derfor gjennomført kvalitetskontroller, som geleelektroforese (figur 1) og fluorescens-baserte quantifications, etter PCR forsterkning.

En full diskusjon av bioinformatikk analyser av disse dataene er utenfor omfanget av denne gjenstand; Vi har imidlertid kort nevnt flere analyser vi har gjennomført. Kvalitetskontroll sekvensering data med FastQC19 beregnes per-base kvaliteter, sekvens duplisering, etc. sekvens databehandling som er validert kan sendes til samlingen genom. Vi har samlet et 132 Mb genom med MaSuRCA v3.1.321 og sammenlignet kartlegging statistikken beregnes med BWA22 og QualiMap23 av DNA sekvensering biblioteket med andre H. dujardini genomet samlinger16. Videre, vi har brukt denne DNA sekvensering data for utelukkelse av forurensninger i vår studie17, og har observert at den sekvensert lest er jevnt fordelt i hele genomet.

De fleste prosjekter på ikke-modellen organismer starte fra dyrking nok utvalg materiale, som tilfellet var med tardigrades24. Tekniske fremskritt innen kultur teknikker har aktivert høye mengder tardigrade kultur, men dagens kultur metoder er ennå ikke steril, og siden de fleste tardigrades er fortsatt unculturable i laboratorier, har det vært nesten umulig å gjennomføre genomet eller transcriptome sekvenser. Denne DNA sekvensering metoden fra en enkeltperson gjør det mulig å analysere sjeldne tardigrade arter, inkludert marine arter som har blitt studert mindre. Ved å gjennomføre komparativ genomikk på en bredere phyletic område, kan en videre forståelse av anhydrobiosis mekanismer i tardigrades oppnås.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Nozomi Abe, Yuki Takai og Nahoko Ishii deres teknisk støtte i genomisk sekvensering. Dette arbeidet ble støttet av Grant-in-Aid for Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) stipendiat, KAKENHI Grant-in-Aid for unge forskere (No.22681029) og KAKENHI Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning (B), No. 17 H 03620 fra JSP, ved en Stipend for grunnleggende vitenskap prosjekter fra The Sumitomo Foundation (No.140340), og dels av forskningsmidler fra Yamagata prefekturs regjeringen og Tsuruoka City, Japan. Chlorella vulgaris brukt til å mate tardigrades ble levert fra Chlorella Industry Co Ltd

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SZ61 microscope OLYMPUS
BactoAgar Difco Laboratories 214010
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco by life technologies 15140-148
VHX-5000 System Keyence
0.2mL Silicone coating tube Bio Medical Science BC-bmb20200
Quick-DNA Microprep Kit ZYMO Research D3021 Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1
1.5 mL microtube greiner bio-one 616-201 See 4.1.1
HIgh speed refrigerated micro centrifuge TOMY MX-307
Covaris M220 Covaris Inc. 4482277
ThruPLEX DNA-Seq kit Rubicon Genomics CAT. NO. R400406 Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2
Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC
AMPure XP reagent BECKMAN COULTER Life Science A63881
Ethanol Wako 054-027335
EB buffer QIAGEN 19086
2200 TapeStation Agilent G2965AA 
D1000 Reagents Agilent 5067-5583
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582
Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent ThermoFisher Scientific Q32850
Cubee Mini-Centrifuge RecenttecGenereach R5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 cycle v3 Illumina Inc. MS-102-3003
MiSeq Sequencer Illumina Inc. SY-410-1003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54, (1), 579-599 (1992).
  2. Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202, (3), 409-420 (2011).
  3. Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L'alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
  4. Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3, (1), 1167575 (2016).
  5. Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12, (4), 283-289 (2012).
  6. Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8, (6), e64793 (2013).
  7. Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82, (12), 843-848 (2006).
  8. May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L'état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
  9. Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81, (9), 649-656 (2005).
  10. Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination? Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (22), E3054-E3056 (2016).
  11. Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
  12. Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (18), 5053-5058 (2016).
  13. Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (22), E3058-E3061 (2016).
  14. Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (52), 15976-15981 (2015).
  15. Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (22), E3057 (2016).
  16. Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
  17. Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15, (7), e2002266 (2017).
  18. He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
  19. Andrews, S. FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  20. Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
  21. Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29, (21), 2669-2677 (2013).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, (14), 1754-1760 (2009).
  23. Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32, (2), 292-294 (2016).
  24. Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8, (3), 549-556 (2008).
Ultralow inngang genomet sekvensering biblioteket forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøven
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoshida, Y., Konno, S., Nishino, R., Murai, Y., Tomita, M., Arakawa, K. Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen. J. Vis. Exp. (137), e57615, doi:10.3791/57615 (2018).More

Yoshida, Y., Konno, S., Nishino, R., Murai, Y., Tomita, M., Arakawa, K. Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen. J. Vis. Exp. (137), e57615, doi:10.3791/57615 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter