Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Сверхнизкое ввода геном последовательность подготовки библиотеки от Tardigrade единичная

doi: 10.3791/57615 Published: July 15, 2018

Summary

Большой проблемой остается загрязнение в ходе секвенирования геномных микроскопических организмов. Здесь мы покажем способ последовательности генома тихоходки от одного образца с всего лишь 50 pg геномной ДНК без усиления весь геном свести к минимуму риск загрязнения.

Abstract

Тихоходки являются микроскопических животных, которые переходят в состояние ametabolic, называется anhydrobiosis, когда сталкиваются усыхание и может вернуться к их первоначальное состояние, когда вода поставляется. Геномные последовательности микроскопических животных, таких как тихоходок риски бактериального загрязнения, что иногда приводит к ошибочной интерпретации, например, о масштабах горизонтальный перенос генов в этих животных. Здесь мы предоставляем сверхнизких метод ввода последовательности генома тихоходки, Hypsibius dujardini, от одного образца. Применяя строгие мытья и загрязнения изоляции наряду с эффективной добычи 50 ~ 200 pg геномной ДНК от одного лица, мы построили библиотеку виртуализации с помощью инструмента секвенирования ДНК. Эти библиотеки были весьма воспроизводимые и объективной, и информатики анализ последовательного читает с других геномов H. dujardini показал минимальное количество загрязнения. Этот метод может быть применен к unculturable тихоходок, которые не могут быть виртуализации с помощью предыдущих методов.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Тихоходки являются микроскопических животных, которые могут вводить состояние ametabolic, называется anhydrobiosis, когда сталкиваются усыхания. Они восстановить путем поглощения воды1,2. В ametabolic состоянии тихоходки способны терпеть различных экстремальных средах, которые включают экстремальных температур3 и давления4,5, высокие дозы ультрафиолетового света6, рентгеновские и гамма-лучи 7 , 8и9космического пространства. Геномных данных является необходимой основой для изучения молекулярных механизмов anhydrobiosis.

Предыдущие попытки последовательности генома тихоходок показали признаки бактериального загрязнения10,11,12,,1314. Геномные последовательности от таких малых организмов требуется большое количество животных и подвержен бактериального загрязнения; Таким образом мы создали ранее последовательности протокол, с помощью сверхнизких метода ввода, начиная от единичная тихоходки, чтобы свести к минимуму риск загрязнений15. Используя эти данные, мы также провели ампликонов высокого качества и сборка генома H. dujardini16,17. Здесь мы подробно описать этот метод геномной последовательности от отдельного tardigrade ()рис. 1). Проверка этого метода секвенирования находится за пределами фокус этой бумаги и уже тщательно обсуждались в наших предыдущих доклада16.

Этот метод состоит из двух частей: изоляции одного тихоходки с самые низкие возможные загрязнения и извлечение высокое качество пиктограммы уровней ДНК. Тихоходки голодали и тщательно промыть водой, а также антибиотики и наблюдается под микроскопом с 500 кратном обеспечить устранение любых бактериального загрязнения. Предыдущие оценки и измерения показывают, что одного человека тихоходки содержит приблизительно 50-200 pg геномной ДНК16, который добывается путем крекинга хитин экзоскелет циклов замораживания оттаивания или ручной гомогенизации. Этот геномной ДНК представлен библиотеки строительных и виртуализации на инструменте секвенирования ДНК. Дополнительные информатики анализ показывает последовательность высокого качества, а также низкий уровень загрязнения по сравнению с предыдущими проектами tardigrade последовательности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Подготовка

  1. Готовить 2% агарозном геле с помощью дистиллированной воды (DW) как растворитель в 90-мм пластиковая культуры блюдо и 10 мл 1% пенициллина/стрептомицина коктейль с DW. Гель может храниться на 2-3 недели в инкубаторе на 18 ° C.
    Примечание: Избегайте любой хранения геля ниже 10 ° C, для низкой температуры будет сжат геля агарозы, что приводит к незначительным разрыв между гель и стены культуры блюдо, в котором можно перехватить тихоходок.

2. Образец подготовки и загрязнения изоляции

  1. Собрать один тихоходки, поместите его на плите подготовленный агар и мыть его 2 x - 3 x с DW для удаления оставшихся частиц.
  2. Инкубируйте тихоходки 18-22 ° с в течение 24 h удалить любой избыток пищи из кишечника.
  3. Место голод тихоходки в антибиотики пенициллин/стрептомицина для 2-6 ч удалить любые бактериальное загрязнение и поместить дезактивированы животных на стакан чистой слайд с помощью пипетки P10.
  4. Соблюдать тихоходки под микроскопом на 500 кратном и подтверждают, что существует не оставшиеся бактерии.
    Примечание: Высокое увеличение с стереомикроскопом является оптимальной, но оптический микроскоп может быть использован в качестве альтернативы без применения coverslip.
  5. Собирать личности с помощью пипетки P10 с максимум 5 мкл жидкости, поместить его в трубку низким привязки полимеразной цепной реакции (ПЦР) и удалить, как много лишней жидкости как можно скорее.
    Примечание: Пробирок, ПЦР трубы и наконечники должны быть низкой привязки к минимуму потери ДНК.
    Примечание: Проводить гомогенизацию как можно скорее, для быстрой сушки или смерть животного может значительно повредить геномной ДНК.

3. гомогенизации и экстракции ДНК

  1. Однородный животное, чтобы получить его геномной ДНК (геномная ДНК) с одним из следующих методов.
    Примечание: Очень важно использовать указанный комплект, показано в Таблице материалы в следующих шагах экстракции ДНК, другие наборы (столбец и шарик на основе) не являются эффективными в этот чрезвычайно низкий входной. Геномный литического буфера представлялась с 0,5% бета меркаптоэтанол до использования.
    1. Однородный животное с18циклов замораживания и оттаивания.
      1. Сразу же после шаг 2.5, добавить 100 мкл буфера lysis ПЦР-пробирки, содержащие тихоходки.
      2. Поместите ПЦР-пробирку в жидком азоте за 10 мин и за 10 мин, переместите его в блок тепла нагревается до 37 ° C. Повторите этот шаг 2 x.
        Примечание: Этот шаг может быть повторен при гомогенизации недостаточно или могут быть выполнены после ручной дробления.
    2. Вручную раздавить животного.
      1. Сразу же после шаг 2.5, под стереомикроскопом, раздавить человека P10 кончиком пипетки, нажав животного к стенке трубки PCR и сразу же добавить 100 мкл буфера lysis.
        Примечание: Очень важно соблюдать эту процедуру под стереомикроскопом, потому что тихоходки можно легко ускользнуть, и неэффективные дробления приведет к невозможности извлечь геномная ДНК. Убедитесь, что tardigrade кутикулы нарушается, так что литического буфера может проникнуть в организм.
  2. Инкубируйте трубки для 30 мин при комнатной температуре для лизиса происходят.
    Примечание: Для эффективного лизис требуется минимум 30 мин, но инкубации может быть дольше.
  3. Передать полный объем (100 мкл) смеси лизис Микропробирка низким привязки чистой 1,5 мл.
  4. Добавить 100 мкл буфера lysis ПЦР-пробирку низкой привязки, которая была использована для гомогенизации и в настоящее время пуст и после дозирование смеси, передать его на низкий привязки Микропробирка 1.5 мл, на шаге 3.3. Повторите этот шаг 2 x.
  5. Как и шаг 3.4 300 мкл буфера lysis для ПЦР-пробирку низкой привязки, и после закупорить, переместить смесь 1,5 мл микропробирок низким привязки. Микропробирка 1.5 мл low привязки должен содержать 600 мкл смеси после этого шага.
    Примечание: Эти шаги, чтобы свести к минимуму потери геномная ДНК, привязан к стенке трубки PCR, путем промывания образец несколько раз.
  6. Добавить в общей сложности 600 мкл лизис смеси в столбец спин, помещены в коллекцию трубку и центрифуги на 10000 x г за 1 мин.
  7. Повторно применить через поток к столбцу и центрифуги на 10000 x г за 1 мин.
    Примечание: Этот шаг очень важен для обеспечения что большинство геномная ДНК привязан к столбцу.
  8. Добавить 500 мкл буфера мытья в столбце спин и центрифуги его на 10000 x g за 1 мин передачи столбце спина к чистой 1,5 мл микропробирок.
  9. Применить 20 мкл 10 мм трис-HCl, рН 8,5, в столбце спин, подождите 5 минут при комнатной температуре и центрифуги на 10000 x г за 1 мин.
    Примечание: Элюирующий буфер не должны содержать ЭДТА, ибо она мешает ферменты подготовка библиотеки.
  10. Повторно применить потока через колонку спина и после 5 минут инкубации при комнатной температуре, центрифуги за 1 мин на 10000 x g.
    Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения максимальной элюции геномная ДНК, привязанное к столбцу.

4. Библиотека строительство последовательности

  1. Фрагментация ДНК
    1. Передача 15 мкл геномная ДНК элюанта 15-мкл Микропробирка для фрагментацию ДНК и центрифуги трубки для 1 мин, используя tabletop microcentrifuge.
      Примечание: Указанный Микропробирка, показано в Таблице материалов является оптимальным для низких входных данных. Фрагментация с низким sonication имеет решающее значение, и это не может быть заменен ферментативные фрагментацию из-за крайне низкой концентрации ДНК.
    2. Фрагмент геномная ДНК до 550 bp.
      Примечание: 550 bp настройки, мы использовали заключаются в следующем: пик инцидента мощность = 30 Вт, коэффициент = 20%, циклов в пакетном = 50, время лечения = 23 s.
    3. После тщательно закупорить, передавать чистой низкой привязки ПЦР-пробирку 10 мкл фрагментированных смеси ДНК.
      Примечание: Эксперимент можно остановить здесь. Сохранения ДНК на 4 ° C или от-20 ° C.
  2. Библиотека строительство последовательности
    Примечание: Абсолютно важно использовать указанный набор в Таблицу материалы в следующих процедурах, из-за низкого количества ввода ДНК.
    1. Добавить 2 мкл буфера подготовки шаблона и 1 мкл фермента подготовки шаблона и тщательно перемешать их с пипеткой.
    2. Выполните шаблон подготовки реакции на тепловая велосипедист с соблюдением следующих условий: 22 ° C за 25 мин, 55 ° C за 20 мин, 4 ° C удержание и подогревом крышки на 101-105 ° C. После завершения реакции, переходите к следующему шагу.
    3. Добавьте 1 мкл буфера синтез библиотеки и 1 мкл библиотека синтез фермента продукт реакции подготовки шаблона и проинкубируйте смесь при 22 ° C 40 мин (с провести 4 ° C). После завершения реакции, переходите к следующему шагу.
    4. Добавьте 30 мкл библиотека усиления основной смеси (25 мкл буфера амплификации Библиотека, 1 мкл фермента амплификации библиотека и 4 мкл нуклеиназы свободной воды) и 5 мкл Реагента индексирования.
    5. Все тщательно перемешать с пипетки и центрифуги смесь кратко с настольной центрифуги.
    6. Выполните ПЦР с условиями, представлены в таблице 1.
Температура Время Циклы
72 ° C 3 минуты
85 ° C 2 минуты
98 ГРАДУСОВ 2 минуты
98 ГРАДУСОВ 20 секунд 4 циклов
67 ГРАДУСОВ 20 секунд
72 ° C 40 секунд
98 ГРАДУСОВ 20 секунд 16 циклов
72 ° C 50 секунд
4 ° C Удерживайте

Таблица 1: Условия PCR.

  1. Очистка продуктов ПЦР
    Примечание: Этот шаг может быть заменен с другими методами очистки. Если используется альтернативный метод, не забудьте проверить полученный чистоту ДНК с помощью спектрофотометра. Коэффициенты поглощения 260/280 и 260/230 оба должны быть выше 1.8.
    1. Добавьте 50 мкл магнитной бусины, Пипетка решение 10 x и центрифуги он кратко с настольная microcentrifuge.
    2. Инкубируйте решение для 2 мин при комнатной температуре.
    3. Инкубировать на магнитной подставкой для 5 минут или до тех пор, пока решение становится совершенно ясно и удалить супернатант.
    4. Добавить 200 мкл свежеприготовленные 80% этанола в ПЦР-пробирку низкой привязки на стенде магнит, подождите 30 s и удалить супернатант. Повторите этот шаг 2 x. Не беспокоить бисер.
    5. Кратко центрифуга низким привязки ПЦР-пробирку с настольной центрифуги и удалите любые излишки этанола на магнитную подставку. Просушите бисер, но избежать пересушивание.
    6. Ресуспензируйте бусины с 15 мкл 10 мм трис-HCl, рН 8,5, тщательно Пипетка решение так что однородно распределяются магнитные бусы, инкубировать трубки для 2 мин при комнатной температуре и после краткого центрифугирования, инкубировать на магнитную подставку для 2 мин до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
      Примечание: Элюирующий буфер не должен содержать ЭДТА, ибо она вмешивается в последовательности химии.
    7. Передача супернатанта, не нарушая Пелле, в новой низким привязки ПЦР-пробирку.
      Примечание: Эксперимент можно остановить здесь. Сохранения ДНК при температуре 4 ° C или при-20 ° C для длительного хранения.

5. качество проверить, количественной оценки и последовательность ДНК

Примечание: Перед этот шаг из-за низкого количества ДНК не проводится проверка качества.

  1. Проверка распределения по размерам библиотеки ДНК
    Примечание: Могут также использоваться другие системы высокочувствительные электрофорез с цифровой отчетности размер распределения.
    1. Возвращение реагент буфер электрофореза и гель картриджа (25-1000 bp в диапазоне) до комнатной температуры.
    2. 3 мкл Реагента буфер электрофореза с 1 мкл последовательности библиотеки и смешивать их тщательно за 1 мин с вихрь и кратко центрифуга их с настольной центрифуги.
    3. Провести электрофорез и проверить распределение по размерам библиотеки с сопутствующим. Пик основной фрагмент должен широко от около 300 до 1000 bp.
  2. Количественное определение ДНК
    Примечание: Другие методы, основанные на флуоресценции или количественного PCR может также использоваться, но спектрофотометрии следует избегать, так как он не является достаточно точным для количественного определения последовательности библиотек.
    1. Добавьте 796 мкл раствора буфера и 4 мкл реагента, флуоресцентные и тщательно перемешать. Обойтись 190 мкл рабочего раствора в две пробирки пробирного и 197 мкл до одной трубы пробирного.
    2. Добавьте 10 мкл стандартов с известной концентрации ДНК для каждого пробирного трубка, содержащая 190 мкл рабочего раствора и 3 мкл подготовленный библиотеки пробирного трубка, содержащая 197 мкл рабочего раствора.
    3. Вихревой трубы кратко и центрифуги их на настольные центрифуги. Количественного определения ДНК с помощью флюорометр с параметрами 3-мкл.
  3. Последовательности ДНК Библиотека
    Примечание: Виртуализации платформы должны быть совместимы с указанной библиотеки строительство kit.
    1. Подготовьте библиотеку последовательности на основе протокола производителя.
    2. Установите реагент кассету и потока ячейки в инструмент виртуализации и введите последовательность запуска информации производителя протокол.
    3. Запустите последовательность.
      Примечание: Мы провели два запуска последовательности: один образец/запуск, а также четыре образца, мультиплексируются в один проход.

6. Расчётные анализ

  1. База вызов и, при необходимости, использовать мультиплексирование читает.
  2. Проверка качества данных последовательности с FastQC19.
    Примечание: Для более углубленной проверки полученных данных, смотрите наш предыдущий доклад16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Изоляция загрязняющих веществ:

Этот протокол включает в себя тщательное мытье тихоходки и стерилизации с лечения антибиотиками для сведения к минимуму загрязнения. Она также включает в себя визуальный процесс проверки для обеспечения полноты этих процессов. Микроскоп изображения, сделанные в ходе проверки (шаг 2.4 протокол) показано на рисунке 2. Когда на 500 кратном, бактериальные клетки можно рассматривать как мелких частиц, которые движутся вокруг отдельных тихоходки.

Проверка качества библиотеки ДНК:

Общее количество построенных библиотеки ДНК-Seq является примерно 109.5 (7.3 нг/мкл x 15 мкл) нг16. Чтобы проверить распределение длины фрагментации, электрофорез шаблон должен быть аналогичен рис. 3. Как мы задаем размер фрагментации 550 bp с ДНК, стрижка системы, библиотеке должно быть 550-600 ВР, включая секвенирование адаптеров. Можно отметить, что большинство последовательности библиотеки содержится между 200-1000 bp и согласуется между реплицирует (N1 - N4).

Анализ данных последовательности:
Секвенирования ДНК генерируется парных читает примерно 20 - на 25-М в перспективе. Проверка качества был проведен с использованием FastQC (рис. 4). Распределение качества вдоль последовательности чтения является типичным 300-ВР парных run.

Figure 1
Рисунок 1: процесс настоящего Протокола. Этот рисунок показывает, резюме настоящего Протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Представитель фото бактерии, свободной тихоходки. Эта цифра показывает изображения загрязненных тихоходки (слева) и уборка (справа) тихоходки (Hypsibius dujardini), наряду с дальнейшей увеличенного изображения (внизу). Клетки палочковидные вокруг тихоходки загрязнителей и указаны со стрелкой. Линейки шкалы указывает 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Проверка распределения длина фрагмента сконструированный библиотеки ДНК. Эта панель показывает распределение размера библиотеки виртуализации. Фиолетовый и зеленый линии показывают верхние и нижние маркеры на 1500 и 25 bp, соответственно. L = лестницы, S = 1 образец/запуск, N1 - N4 = реплицирует/запуск 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Пример проверки качества ДНК-Seq с FastQC. ДНК-Seq данные были представлены в FastQC для проверки выполнения последовательности. Представитель отображен результат для DRR055040 за качество базовой последовательности (16DDBJ последовательности чтения Архив DRA004455). (A) Эта панель показывает вперед читает (R1). (B) Эта группа показывает обратный читает (R2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Бактериальное загрязнение представляет собой угрозу для геномные последовательности микроскопических организмов. В то время как предыдущие исследования на tardigrade генома отфильтрованы загрязнения, используя обширные информатики методы12,20, мы последовательности генома от одного лица к минимуму риск загрязнения. Поскольку отдельные тихоходки содержит приблизительно 50-200 pg геномной ДНК16 и помещены в толстый слой хитин экзоскелет, исключение примесей и экстракции ДНК высокого качества являются критическими точками в этом протоколе. Существующие тихоходок культур не асептических и те собраны из диких нести много загрязнений на поверхности, а также остатки пищи в их кишечнике. Предыдущие проекты секвенирования генома тихоходок виртуализированных 10 000-100 000 лиц коллективно как один образец12,14, что означает, что результаты являются весьма вероятно, будут оказывать влияние на бактериальных загрязнений. В их докладе, Бутби и др. собранные H. dujardini людей с помощью их поведение отрицательный Фототаксис14, и группа не использовать любые методы, антибактериальное.

Визуально изучить, если есть загрязнители, мы инкубировали тихоходки в антибиотики (пенициллин/стрептомицина) и изучил личности под микроскопом 500 X. Изолируя один человек и тщательно проверять для любых загрязнений мы свести к минимуму риск возможных загрязнений. Низкий уровень загрязнения было подтверждено также16из последовательности данных. Что касается экстракции ДНК мы использовали ручной гомогенизации, а также тепловой гомогенизации18. Отправляя tardigrade человека жидким азотом и 37 ° C, трещины были наведены в экзоскелет хитин, и буфера lysis смог проникнуть в тело и лизировать клетки. Когда ДНК урожайность по-прежнему ниже, чем ожидалось, тепловой и ручной гомогенизации может проводиться для максимизации доходности.

Метод, заявил в этой статье, имеет несколько ограничений. Во-первых гомогенизации, циклов замораживания оттаивания был применен из исследования на нематод; Таким образом метод может только быть эффективным против линяющие. Во-вторых из-за усиления фрагментов ДНК в ходе этапа библиотека последовательности ДНК, нельзя игнорировать возможность ошибки ПЦР. Таким образом, последовательность данных не рекомендуется для анализа, который требует высокой точности читает (т.е., SNP анализ). Кроме того как мы уже заявляли в протоколе, использование указанного набора СНС-Seq, показано в Таблица материалов является абсолютно критическим, из-за низкого количества ввода ДНК. Этот комплект строительство библиотеки ДНК ligates Illumina адаптер последовательности до усиления; Таким образом эта библиотека не может применяться для длительного чтения последовательности с использованием PacBio или Нанопор технологии. Наконец проверку качества сконструированного библиотеки ДНК в ходе настоящего Протокола происходит только один раз, после завершения строительства библиотеки виртуализации. Это из-за низкой ввода ДНК, так как большинство ДНК количественной оценки и методы электрофореза не может обнаружить 50-200 pg ДНК. Таким образом мы провели проверки качества, такие как электрофорез (рис. 1) и на основе флуоресценции количественной, только после ПЦР-амплификации.

Полное обсуждение биоинформатики анализ этих данных выходит за рамки этой статьи; Однако мы кратко указано несколько анализов, которые мы провели. Проверка качества данных последовательности с FastQC19 вычисляет-база качества, последовательности дублирования данных последовательности и т.д. , которые были проверены может представляться Ассамблее генома. Мы собрали 132 Mb генома с MaSuRCA v3.1.321 и сравнили сопоставления статистики, рассчитанными ВСБ22 и23 QualiMap этой библиотеки секвенирования ДНК с другим геном H. dujardini сборки16. Кроме того мы также использовали эти данные секвенирования ДНК для исключения загрязнителей в нашем исследовании17и заметил, что последовательного читает распределяются равномерно по всему геному.

Большинство проектов на организмы-модели начинаются от культивирования достаточно образца материала, как было в случае с тихоходок24. Технические достижения в культуре методов позволили высокое количество tardigrade культуры, но текущее культуру методы еще не асептических, и поскольку большинство тихоходок еще unculturable в лабораториях, это было почти невозможно проводить геном или транскриптом последовательности. Этот метод секвенирования ДНК от одного лица позволяет анализировать редких tardigrade видов, включая морские виды, которые были изучены меньше. Путем проведения сравнительной геномики в более широкий район, phyletic, может быть достигнуто дальнейшее понимание механизмов anhydrobiosis в тихоходок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы благодарят за их техническую поддержку в области секвенирования геномных Nozomi Абэ, Юки Такаи и Уэхаси Исии. Эта работа была поддержана субсидий для японского общества для поощрения науки (JSP) научный сотрудник, KAKENHI субсидий для молодых ученых (No.22681029) и KAKENHI субсидий для научных исследований (B), № 17 H 03620 от JSP-страницы, по Грант для основных научно исследовательских проектов от Sumitomo фонда (No.140340) и частично путем исследования средств от правительства префектуры Ямагата и город Цуруока, Япония. Chlorella vulgaris используется для корма тихоходок была предоставлена любезно хлореллы Industry Co. LTD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SZ61 microscope OLYMPUS
BactoAgar Difco Laboratories 214010
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco by life technologies 15140-148
VHX-5000 System Keyence
0.2mL Silicone coating tube Bio Medical Science BC-bmb20200
Quick-DNA Microprep Kit ZYMO Research D3021 Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1
1.5 mL microtube greiner bio-one 616-201 See 4.1.1
HIgh speed refrigerated micro centrifuge TOMY MX-307
Covaris M220 Covaris Inc. 4482277
ThruPLEX DNA-Seq kit Rubicon Genomics CAT. NO. R400406 Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2
Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC
AMPure XP reagent BECKMAN COULTER Life Science A63881
Ethanol Wako 054-027335
EB buffer QIAGEN 19086
2200 TapeStation Agilent G2965AA 
D1000 Reagents Agilent 5067-5583
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582
Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent ThermoFisher Scientific Q32850
Cubee Mini-Centrifuge RecenttecGenereach R5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 cycle v3 Illumina Inc. MS-102-3003
MiSeq Sequencer Illumina Inc. SY-410-1003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54, (1), 579-599 (1992).
  2. Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202, (3), 409-420 (2011).
  3. Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L'alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
  4. Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3, (1), 1167575 (2016).
  5. Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12, (4), 283-289 (2012).
  6. Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8, (6), e64793 (2013).
  7. Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82, (12), 843-848 (2006).
  8. May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L'état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
  9. Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81, (9), 649-656 (2005).
  10. Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination? Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (22), E3054-E3056 (2016).
  11. Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
  12. Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (18), 5053-5058 (2016).
  13. Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (22), E3058-E3061 (2016).
  14. Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (52), 15976-15981 (2015).
  15. Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (22), E3057 (2016).
  16. Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
  17. Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15, (7), e2002266 (2017).
  18. He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
  19. Andrews, S. FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  20. Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
  21. Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29, (21), 2669-2677 (2013).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, (14), 1754-1760 (2009).
  23. Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32, (2), 292-294 (2016).
  24. Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8, (3), 549-556 (2008).
Сверхнизкое ввода геном последовательность подготовки библиотеки от Tardigrade единичная
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoshida, Y., Konno, S., Nishino, R., Murai, Y., Tomita, M., Arakawa, K. Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen. J. Vis. Exp. (137), e57615, doi:10.3791/57615 (2018).More

Yoshida, Y., Konno, S., Nishino, R., Murai, Y., Tomita, M., Arakawa, K. Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen. J. Vis. Exp. (137), e57615, doi:10.3791/57615 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter