Summary
Vi præsenterer her, en protokol for graduering af de intracardiac autonome nervesystem og vurdering af dens indflydelse på grundlæggende Elektrofysiologi, arrhythmogenesis og cAMP dynamics ved hjælp af en ex vivo Langendorff opsætning.
Abstract
Siden sin opfindelse i den sent 19th century fortsætter Langendorff ex vivo hjerte perfusion systemet med at være et relevant værktøj til at studere et bredt spektrum af fysiologiske, biokemiske, morfologiske og farmakologiske parametre i centralt denerveres hjerter. Her, beskriver vi en opsætning for graduering af de intracardiac autonome nervesystem og vurdering af dens indflydelse på grundlæggende Elektrofysiologi, arrhythmogenesis og cyklisk adenosin fra (cAMP) dynamics. De intracardiac autonome nervesystem er moduleret af mekaniske dissektion af atrieflimren fedt puder-i hvilken murine ganglier er placeret primært — eller ved brug af globale samt målrettede farmakologiske interventioner. En octapolar elektrofysiologiske kateter føres ind i højre atrium og højre hjertekammer, og epikardielle placeret multi elektrode arrays (MEA) til høj opløsning tilknytning bruges til at bestemme hjertets Elektrofysiologi og arrhythmogenesis. Förster resonans energioverførsel (FRET) imaging udføres for realtidsovervågning af cAMP niveauer i forskellige kardiale regioner. Neuromorphology er undersøgt ved hjælp af antistof-baserede farvning af hele hjerter ved hjælp af neuronal markører til at guide identifikationen og graduering af specifikke mål for de intracardiac autonome nervesystem i de udførte undersøgelser. Ex vivo Langendorff opsætning giver mulighed for et stort antal reproducerbare eksperimenter i en kort tid. Ikke desto mindre, den delvis åben karakter af opsætningen (fx., under MEA målinger) vanskeliggør konstant temperaturkontrol og bør holdes på et minimum. Denne beskrevne metode gør det muligt at analysere og modulere intracardiac autonome nervesystem i decentrale hjerter.
Introduction
Langendorff ex vivo hjerte perfusion systemet fortsætter med at være et relevant værktøj til at udføre et bredt spektrum af fysiologiske, biokemiske, morfologiske, og farmakologiske undersøgelser i centralt denerveres hjerter1,2 ,3,4,5 siden sin opfindelse i den sent 19th century6. Til dato, dette system er stadig meget udbredt til forskellige emner (fx., iskæmi reperfusion) eller til at undersøge hjertets farmakologiske effekter7,8, og er et grundlæggende redskab i hjerte-kar-forskning. Levetiden for denne metode resultater fra flere fordele (fx., målingerne udføres uden påvirkning af centralnervesystemet eller andre organer, systemisk cirkulation eller cirkulerende hormoner). Hvis det er nødvendigt, kan lægemidler tilføjes på en kontrolleret måde perfusion buffer eller anvendes til specifikke strukturer direkte. Eksperimenter er reproducerbare, og et relativt stort antal eksperimenter kan udføres i en kort periode. Den (delvis) åbne karakter af opsætningen kan gøre temperaturregulering vanskelig og skal tages i betragtning. Selv om ordningen Langendorff bruges også i større arter9, mindre dyr anvendes primært som eksperimentelle opsætningen er mindre kompleks, og en større biologisk variation (fx., Transgene mus modeller) kan bruges.
De intracardiac autonome nervesystem indflydelse på elektrofysiologiske grundparametre, ventrikulær arrhythmogenesis, epikardielle varmeledning og cyklisk adenosin fra (cAMP) dynamics er i eksperimentel opsætning af denne protokol, evalueret. Et stort antal intracardiac ganglier, som fortrinsvis findes i de atriale fedtpuder, og er nu kendt at kontrollere hjerte Elektrofysiologi uafhængigt af central neural kontrol er enten efterladt intakt eller manuelt fjernet med omhyggelig mekanisk dissektion. En farmakologisk graduering af det autonome nervesystem er udført enten globalt ved at tilføje pharmaceuticals perfusion buffer, eller lokalt af målrettede graduering af de atriale ganglier. Efter forsøgene er hjerterne velegnet til en immunohistological vurdering som alle blodlegemer er blevet fjernet på grund af den kontinuerlige perfusion, som kan øge kvaliteten af farvning.
Det overordnede mål med de beskrevne teknikker er at tilbyde nye perspektiver for detaljerede undersøgelser vedrørende virkningen af det autonome nervesystem på hjerte Elektrofysiologi og arrhythmogenesis i mus hjerte. En grund til at bruge denne teknik er, at det er muligt at undersøge og ændre det autonome nervesystem uden virkningen af det centrale nervesystem. En væsentlig fordel er let beskæftigelse af farmakologiske forsøg, i hvilke potentielle pro- eller antiarytmiske egenskaber af gamle og nye agenser kan testes. Derudover er transgene og knockout musemodeller af forskellige hjerte sygdomme til rådighed til at efterforske de mekanismer, der ligger under arytmier, hjertesvigt eller metaboliske sygdomme. Denne tilgang har forbedret vores forståelse af, hvordan det autonome nervesystem på niveauet atrieflimren kan påvirke ventrikulær hjerte Elektrofysiologi og induktion af arytmier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr blev godkendt af de lokale myndigheder i staten Hamburg, University of Hamburg dyrs pleje og brug udvalg.
1. forberedelse af apparatet Langendorff
Bemærk: Et kommercielt tilgængelige Langendorff perfusion systemet bruges.
- Forberede en modificeret Krebs-Henseleit løsning (119 mM natriumchlorid, 25 mM af natriumbikarbonat, 4,6 mM kaliumchloridopløsning, 1,2 mM af kalium fosfat monobasic, 1,1 mM af magnesium sulfat, 2,5 mM calciumchlorid, 8,3 mM af glukose og 2 mM af natrium pyruvat). Tilføje en blanding af 95% oxygen/5% kuldioxid til perfusion løsning til at undgå calcium nedbør. Filtrer buffer med en porestørrelse på 0,22 µm.
- Tilføje en farmakologisk agent til buffer til at undersøge dens virkning på hjertets Elektrofysiologi og arrhythmogenesis efter behov.
- Start et vandbad og placere perfusion løsning herunder en blanding af 95% oxygen/5% kuldioxid i det. Justere temperaturen i vandbad, så perfusion løsning temperatur umiddelbart før kanylen er ~ 37 ˚C.
- Begynde at rulle pumpe og fylde apparatet med perfusion løsning, så snart den korrekte temperatur er nået.
- Justere pumpe før du sætter hjertet, så at ingen luftbobler er tilbage i kanylen, når du monterer det på apparatet.
2. hard - og Software forberedelse
- Tilslut et digitalt dataoptegningssystem og dens tilsvarende software til Langendorff apparater til en kontinuerlig registrering af perfusion trykket, flow og puls.
- Sæt målrettede perfusion pres i de generelle indstillinger til 80 mmHg.
- Starte optagelsen.
- Bruge en Elektrofysiologi kateter (Tabel af materialer) med platin elektroder, en elektrode overfladen af 0,5 x 0,5 mm og en elektrode afstanden på 0,5 mm til dataregistrering og stimulation med en udpeget digitale stimulus generator.
- Placere kateteret tæt på det område hvor hjertet vil være placeret efter den vedhæftede fil til apparatet.
- Forberede stimulering ved at vælge 2 elektroder fra kateteret og bruge en cyklus længde 100 ms.
3. forberedelse af hjertet
- Tilføj koldt (~ 2-4 ˚C) perfusion buffer (10-20 mL og 40-50 mL, således at hele fadet er dækket) til de 2 petriskåle (diameter 6 cm og 10 cm) og skål med kanyle og sted dem på is direkte næste og under mikroskop. Forberede en dobbelt knude omkring kanylen.
- Hurtigt punktafgifter hjertet efter cervikal dislokation af åbne brystkassen ved hjælp af Mayo saks og smalle mønster pincet. Derefter greb aorta og vena cava over mellemgulvet ved hjælp af London pincet og punktafgifter hjerte-lunge-blok ved at skære alle fartøjer og bindevæv tæt på rygsøjlen med skelen saks.
- Overføre hjerte-lunge blok i den første skål (6 cm diameter) fyldt med iskolde bufferen og forsigtigt fjerne lungerne uden at beskadige hjertet ved hjælp af Strabismus saks og London pincet. Derefter placere hjertet under mikroskop og fjern forsigtigt thymus, spiserør og luftrør ved hjælp af foråret saks og Dumont SS pincet.
- Brug foråret saks til at skære et hul 1,5-2 mm i den øverste del af højre atrium til indsættelse af kateteret. Skær et hul i lungepulsåren. Derefter skæres aorta direkte under supraaortic grene og fjern væv fra aorta, således at knuden kan fastgøres nemt.
- Holde de atriale fedtpuder, herunder store atrially beliggende ganglionated plexi, omkring venstre atrium intakt eller helt fjerne dem. ved omhyggelig dissektion.
- Overføre hjertet til fadet med kanylen og placere den under mikroskop. Træk aorta over kanylen med Dumont SS pincet og binde rede knuden stramt omkring aorta. Sørg for, at kanylen ikke placeres for dybt i aorta så aortaklappen og koronar fartøjer er frit.
- Vedhæfte kanylen hurtigt til Langendorff apparater. Kontroller, at der ingen bobler venstre i kanylen.
- Skifte perfusion pres til 80 mmHg, giver et konstant pres perfusion.
- Indsæt kateteret omhyggeligt ind i højre atrium og højre hjertekammer uden at røre eller skader hjertet og tillægger kanyle med tape kateteret.
- Start stimulering med rede cyklus længde af 100 ms for en indledende 20 min ækvilibrering periode.
- Luk kammer for at tillade en stabil temperatur.
4. elektrofysiologiske parametre og Arrhythmogenesis
- Anvende en programmeret stimulation via de distale eller proksimale elektroder af kateter på to gange den atriale eller ventrikulære pacing tærsklen til at evaluere de elektrofysiologiske parametre som beskrevet i følgende fremgangsmåde.
- Bestemme den sinusknuden inddrivelse tid som maksimal tilbagevenden cyklus længde efter 10 s af fastforrentede pacing ved en S1S1 cyklus længde på 120 ms, 100 ms, og 80 ms.
- Afgøre Wenckebach som den længste S1S1 cyklus længde (8 stimuli; S1S1: 100 ms; 2 ms trinvis reduktion) med et tab af 11 AV nodal overledning. Bestemme de atrioventrikulær nodal ildfaste perioder som den længste S1S2 (12 stimuli; S1S1: 120 ms, 110 ms, og 100ms; en kort kombineret extrastimulus med en 2 ms trinvis S1S2 reduktion) med et tab af AV nodal overledning.
- Bestemme de atrielle og ventrikulære ildfaste perioder som den længste S1S2 (12 stimuli; S1S1: 120 ms, 110 ms, og 100ms; en kort kombineret extrastimulus med en 2 ms trinvis S1S2 reduktion) med en fraværende atriale eller ventrikulære svar10,11.
- Udføre en programmeret extrastimulation (S1S1: 120 ms, 100 ms, og 80 ms, efterfulgt af op til 3 ekstra beats; 60-20 ms med en gradvis reduktion af 2 ms) eller burst pacing protokoller (5 s på S1S1: 50-10 ms med en gradvis reduktion af 10 ms) i overensstemmelse med den Lambeth konventioner til eva luate ventrikulær arrhythmogenesis10,11,12.
5. epikardielle overledning målinger
Bemærk: Post unipolære epikardielle electrograms ved hjælp af en 128-kanal, computer-assisteret optagelse system med en samplingfrekvens på 25 kHz for høj opløsning kortlægning. Bruge en 32 multi elektrode-array (MEA; Inter elektrode afstand: 300 µm; 1,8 x 1,8 mm). Bemærk, at dataene blev bandpass filtreret (50 Hz) og digitaliseret med 12 bit og en signalområde 20 mV.
- Placer MEA i det udpegede område af hjertet og tilføje jordforbindelse til en anden del af hjertet13,14,15.
- Læg en epikardielle stimulation kateter tæt på MEA og starte en konstant stimulation.
- Starte optagelsen efter bekræftelse af god kontakt til elektroderne ved at kontrollere signalets kvalitet og amplitude.
- Bruge en offline analyse til bestemmelse af bølge formering hastighed og spredning i retningen overledning.
6. Förster resonans energi overføre FRET-baserede cyklisk adenosin fra (cAMP) Imaging
Bemærk: FRET-baserede målinger, høste hjerter fra CAG-Epac1-lejre Transgene mus16.
- Bruge en selvbyggede imaging system omkring et stereomikroskop15,17.
- Placer stereomikroskopet foran hjertet og justere det for skarphed.
- Ophidse den lejr sensor med en lyskilde [fxbruge en single-bølgelængde light emitting diode (440 nm)]. Split udledning lyse i donor og acceptor kanaler ved hjælp af en stråledeler (for en cyan fluorescerende protein/gul fluorescerende proteiner par, brug en 565dcxr dichroic spejl D480/30 og D535/40 emission filtre).
- Sikre en stabil temperatur ved at sætte en plastfolie rundt i salen.
- Tage billeder ved hjælp af en videnskabelig komplementær metal-oxid-semiconductor (sCMOS) kamera. Koordinere lyskilde og kamera billedcapture med en open source imaging software såsom Micro-Manager.
- For at starte billede erhvervelse, skubbe Multi-D Acq. knappen og konfigurere en time-lapse, som erhverver et billede hver 10 s, med den passende eksponeringstid, som afhænger af styrken af fluorescerende signal (omkring 100 ms).
- Bruge tidligere beskrevet og tilgængelige ÆRGRE online og ærgre sig online 2 plugins17 at opdele billedet i to kanaler, Vælg regionerne af interesse og overvåge forholdet sporing.
- Under købet, perfuse hjertet med den modificerede Krebs-Henseleit løsning indeholdende forskellige stoffer, afhængig af karakteren af forsøget.
- I slutningen af forsøget, sluk erhvervelse ved at trykke på knappen Stop , og gemme stakken af billeder.
- Analysere FRET data offline ved hjælp af en dedikeret analyse software, der kan opdele i to identiske sektioner for donor og acceptor kanaler, billeder og kan udføre FRET analyse i flere regioner af interesse.
Bemærk: En dedikeret plug-in (ÆRGRE offline) er nødvendig, der er fastsat i Sprenger et al. 17.- Starte softwaren. Åbn analysen ved at gå til menuen Plugins , så klik på MicroManager, og derefter på Åbn mikro-Manager-fil.
- Køre ÆRGRE offline plugin for at opdele den time-lapse i to identiske billeder for fælles fiskeripolitik og YFP kanaler.
- Brug værktøjet Frihånd valg til at markere det pågældende område i YFP billedet. Tryk på knappen Tilføj for at tilføje udvælgelse Multi produktionskladdeenheden i vinduet.
- Vælg region af interesse i vinduet Multi og tryk på Multi til få en tabel med grå gennemsnitsværdier for hver frame og regionen. Kopiere og indsætte alle data i et Excel-ark.
- Klik på den fælles fiskeripolitik billedstak. Udføre de samme handlinger som i trin 6.10.4 for fælles fiskeripolitik stak og indsætte de gennemsnitlige grå værdier i den samme Excel-ark.
- Korrigere de rå data offline for gennemblødning faktor af donoren i acceptoren kanal17.
- Brug følgende formel, hvor B er gennemblødning faktor:
Ratio = (YFP - B x CFP) / FFP - Faktoren gennemblødning B af imaging et udtryk for den fælles fiskeripolitik kun hjerte og måle procentdelen af donor fluorescens i YFP kanalen (B = YFP / fælles fiskeripolitik).
- Brug følgende formel, hvor B er gennemblødning faktor:
7. Neuromorphology
Bemærk: Analysere de intracardiac autonome nervesystem ved hjælp af hele-mount immunostainings af intakt murine hjerter. Bemærk at fleste af intracardiac ganglier er lokaliseret i den epikardielle fedtvæv tæt på pulmonal venerne.
- Bruge forskellige stainings til skildringen af neurofilament (generel neuronal strukturer, kylling anti-NF-H, 1:3, 000), tyrosin hydroxylase (TH, sympatiske neuronal strukturer, kanin α TH, 1:1, 000), og cholin acetyltransferase (ChAT, parasympatiske neuronal strukturer; ged α ChAT, 1:50).
- Efter perfusion i apparatet Langendorff fix mus hjerter i 10 mL af formalin i 24 timer og gemme dem i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) på 4 ˚C.
- Bleach hjerter i Dents blegemiddel (4:1:1 methanol: brintoverilte løsning 30% (w/w) i H2O: dimethylsulfoxid (DMSO)) for 1 uge på 4 ˚C og rehydrere dem efterfølgende til PBS i en serie af faldende methanol i PBS (100%, 75%, 50%, 25%; 1 h) 18.
- Udfør de følgende inkubationer i et 24-godt-plade format med en blid agitation på 4 ˚C:
- Permeabilize hjerter i 1% Triton-X-100/PBS (PBS-T) i 3 x 1 timer ved stuetemperatur før blokerer dem natten over i en blokerende buffer [5% bovint serumalbumin (BSA) / PBS-T + 0,2% natriumazid].
- Fortynd antistoffer som følger: ged α ChAT (1:50), kanin α TH (1:1, 000), kylling α neurofilament (1:3, 000); sekundære antistoffer for fluorescerende mærkning (1: 500; eller ifølge fabrikantens anvisninger); biotinylated sekundære antistoffer for kromogent mærkning (1:200; eller ifølge fabrikantens anvisninger).
- Inkuber modellerne i primære antistoffer fortyndet i en blokerende buffer for 1 uge på 4 ˚C.
- Vask hjerter for 3 x 15 min i PBS-T før sekundær antistof inkubation i en blokerende buffer i 4 dage.
- Vask hjerter for 3 x 15 min i PBS-T og gemme dem i en montering medium for fluorescerende farvning i 3 timer ved stuetemperatur eller bruge en begærlighed-biotin komplekse detection kit ifølge producentens anvisninger.
- Pre Inkuber hjerter for 1 h i en kommerciel buffer for 3, 3'-diaminobenzidine (DAB), før du udvikler dem under en visuel kontrol i en DAB-indeholder buffer ifølge producentens anvisninger.
- Gemme enhederne i dobbeltdestilleret vand.
- For paraffinsnit, dehydrere og integrere hjerter i paraffin.
- Skær 4-µm tykt sektioner og deparaffinize dem efter den rutinemæssige laboratorieprocedurer. Om og hvordan antigen hentning skal udføres skal der udarbejdes for hver individuel opsætning, da det afhænger af kombinationen antistof.
- Permeabilize afdelinger for 10 min i 0,2% Triton-X-100/Tris-bufferet saltvand (TBS), efterfulgt af 3 x 5 min. vasker i TBS.
- Blokere dem med 3% BSA/TBS i 1 time ved stuetemperatur.
- Der inkuberes dem natten over ved 4 ˚C [primære antistoffer: ged α ChAT (1:50), kanin α TH (1: 500), kylling α neurofilament (1:1, 000)] eller 2 timer ved stuetemperatur (Fluorescens-mærket sekundære antistoffer, 1: 500) i 1% BSA/TBS med 3 x 5 min. vasker TBS i mellem.
- Tilføje 1 µg/mL af bisbenzimide H33342 trihydrochloride til sekundær antistof løsning eller bruge en anden nukleare farvning metode.
- Montere dias i en montering medium for fluorescerende farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et billede af Langendorff opsætning herunder 2 multi elektrode arrays (MMA). Før forsøget, er intracardiac kateteret placeret tæt på kanyle til at lette en hurtig og nem indsættelse i højre atrium/højre ventrikel og sikre en kort periode, indtil ækvilibrering kan begynde. Den nederste del af salen kan være forhøjet (Se pile i figur 1) således at mødesalen er helt lukket, og sikrer en stabil temperatur.
Figur 2 viser forskellige repræsentative hjerte stainings. I figur 2A en hæmatoxylin og eosin præsenteres (H & E) farvning af en paraffin afsnit. I eksemplarisk udvidelsen (figur 2B) viser en immunhistokemisk farvning af én atrieflimren ganglion de overvejende parasympatiske celler (rød, ChAT-positive) i forhold til mindre talrige sympatisk celler (grønne, TH positiv). I figur 2 c-E skildrer en immunhistokemisk farvning af neurale (figur 2 c, grøn, neurofilament) og sympatiske fibre (figur 2D, rød, TH) samt overlejring af de to billeder (figur 2E) hvordan neurale fibre krydse fra hjertets forkamre via koronar sinus retning posterior hjertekamrene.
Figur 3 viser murin hjertet forbundet at kanylen af Langendorff apparatet med en indsat octapolar kateter i højre atrium og højre hjertekammer og en epikardielle multi elektrode-array (MEA) placeret på den forreste venstre ventrikel ( Figur 3A). Ventrikulær arytmi modtagelighed test via elektroder i RV er præsenteret i figur 3B. Induktion af en ventrikulær takykardi i hjerter fandt sted oftere efter delvis atrieflimren denervering. I den udvidede MEA (figur 3 c) præsenteres den skematisk layout til elektroderne. Det er vigtigt at sikre en stabil epikardielle kontakt af alle elektroder. I figur 3D er offline-analyseret epikardielle overledning indspillet af en MEA afbildet.
Figur 4 viser FRET målinger i et hele hjerte bliver retrogradely perfunderet i Langendorff apparater. Forskellige områder af hjertet kan analyseres som nødvendige (figur 4A). En global samt lokale topisk anvendelse af lægemidler er let muligt i denne konfiguration (figur 4B).
Figur 1: Langendorff opsætning herunder multi elektrode arrays (MMA). Octapolar stimulation og optagelse kateteret er placeret tæt på det område hvor hjertet vil være knyttet. Den nederste del af salen vil blive flyttet opad (hvid pil) efter hjertet har været knyttet til apparatet, så en stabil temperatur er sikret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: hjertets hele mount stainings skildrer dele af det autonome nervesystem. A) skildring af et hjerte H & E-farvede paraffin afsnittet (skala bar 1 mm). B) en eksemplarisk udvidelse af en immunohistochemically farves atrieflimren ganglion viser de overvejende parasympatiske celler (rød, ChAT-positive) i forhold til mindre talrige sympatisk celler (grønne, TH-positive; skala bar 75 µm). C-E) Repræsentant immunhistokemiske stainings af neurale (figur 2 c, grøn, neurofilament, NF) og sympatiske fibre (figur 2D, rød, TH, og deres overlay i figur 2E) krydse fra hjertets forkamre via koronar sinus (CS) mod den posterior hjertekamrene. Eksemplarisk fibre er præget af pilespidser. Stjerner betegne atrieflimren ganglier. Skalere bar 1 mm. LA, venstre atrium; LV, venstre ventrikel; NF, neurofilament; PV, pulmonal venerne; RA, højre atrium; RAA, højre atrium vedhæng; RV, højre hjertekammer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Intra- og epikardielle målinger ved hjælp af installationsprogrammet Langendorff. A. Dette panel viser et eksempel på en murine hjertet i Langendorff system. Intracardiac octapolar kateter, som er indsat i højre forkammer og hjertekammer og en epikardielle multi elektrode array (MEA) er afbildet. B. arytmi resistensbestemmelse ved hjælp af burst stimulation uden (kontrol) eller med induktion af en selvstændig afslutning af ventrikulær takykardi [efter delvis atrieflimren denervering (PAD)] er afbildet. C. epikardielle MEA er afbildet med en udvidelse af den skematiske elektrode layout. D. Wave formering hastighed blev analyseret ved hjælp af en skræddersyet software. Afstanden mellem isochrones er 2 m/s. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: FRET målinger i en Langendorff opsætning. A. to differentcAMP biosensor fluorescens kanaler [gul fluorescerende proteiner (YFP) og cyan fluorescerende proteiner (FFP)] under FRET målinger i en retrograd perfused hjerte er afbildet. Hvis det er nødvendigt, forskellige dele af hjertet (fx, forkamre og ventrikel) kan analyseres (skalalinjen: 1 mm). B. Dette panel viser en repræsentativ FRET eksperiment, som måler lejr niveauer under en farmakologisk stimulation i atrium og venstre hjertekammer. Hjertet var første, systemisk perfunderet med adenylyl cyclase activator NKH477, en forskolin analogon, at øge cAMP niveauer. Derefter var nikotin topisk anvendt og rettet atrielle ganglier, som fuldstændig lempelserne lejr. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskript, er den velkendte Langendorff ex vivo hjerte perfusion system præsenteret som et redskab til at undersøge virkningen af intracardiac neuroner på hjerte Elektrofysiologi og arrhythmogenesis ved hjælp af forskellige kortlægning og stimulation teknikker herunder endokardial og epikardielle tilgange.
Flere dele af protokollen er afgørende for opsætningen. For det første er det vigtigt at bruge en forberedelse teknik hvor de atriale fedtpuder forblive intakt eller fjernes hurtigt uden sårede myokardiet. Andet, har en korrekt størrelse åbning skal skæres i højre atrium til en nem indsættelse af octapolar kateteret ind i højre atrium og højre hjertekammer. Kateteret skal glide let ind i højre hjertekammer uden at skabe nogen form for pres. Under tilknytning af kateteret til kanylen, bør kateteret ikke dyppe dybere ind i ventriklen, at undgå hjerte skade. For det tredje er temperaturkontrol en vigtig del af alle Langendorff opsætninger1,2,5. Det termiske kammeret er lukket under arytmi test, at sikre en stabil temperatur. Men for MEA eller FRET optagelser, kammeret skal være i det mindste delvis åben, så målinger. Optagetid bør holdes på et minimum, eller andre teknikker til at reducere temperaturen tab, som at sætte en plastfolie rundt i salen under længere målinger skal udføres. For det fjerde skal MEAs placeres på de samme anatomiske steder i alle eksperimenter. God overflade kontakt, hvilket bekræftes af store amplituder i real-time analysen, kan opnås ved hjælp af to multilaterale miljøaftaler på modsatte sider, så en modvægt er produceret. For det femte påvirkes FRET målinger af bevægelse. For at reducere spontan bevægelse, er hjertet tempo på en stabil frekvens af intracardiac kateter. For yderligere stabilisering, kan en slange med et lille vakuum stabilisere apex.
En fordel ved Langendorff system er, at hjerter kan bruges efterfølgende til immunohistological vurderinger af nervesystemet, hjerte. Den løbende perfusion fjerner de fleste røde blodlegemer, som har et højt niveau af autofluorescence19, forbedre kvaliteten af farvning. Efter formalin fiksering, kan hjerter gemmes i en temperatur kontrolleret (4 ˚C) miljø i fosfatbufferet saltopløsning for op til et år uden mærkbare ændringer i farvning kvalitet.
Den vigtigste funktion af denne opsætning er at alle målingerne udføres i et centralt denerveres hjerte. De overvejende parasympatiske atrieflimren intracardiac ganglier er den sidste relæstation inden for hjertet20 som sympatiske ganglion stellatum er placeret intrathoracically og er derfor fjernet under forberedelse. Selv om de intracardiac neuroner får ingen centrale input, har det vist sig at de er stadig aktiv i en fysiologisk måde som photoactivation af hjertets sympatiske nerver øger puls og hjerte kontraktile kraft21. I overensstemmelse med disse resultater støtter den funktionelle betydning af intracardiac neuroner i den centralt denerveres hjerte, viste vi for nylig deres indvirkning på ventrikel funktion og arrhythmogenesis15.
En fordel ved denne centralt denerveres setup er, at det giver forsker at studere kommunikation mellem forskellige intracardiac regionale neurale netværk (fx, samspil mellem atrium og ventrikel)15. Disse forskelle kan være relevant for patienter efter hjertet transplantation i hvem behandling med selektiv sinusknuden modulator ivabradin forbedrer overlevelse, i forhold til behandling med beta-blokker metoprolol succinat22. I et senere trin, vil direkte elektrisk stimulation af parasympatiske (vagus nerve) eller sympatisk strukturer (stellatum Ggl.23) bidrage til at forbedre vores viden om samspillet mellem ekstra- og intracardiac autonome nervesystem.
Det er vigtigt at huske at parasympatiske og sympatiske fibre er for det meste Co lokaliseret, således at aktuelle behandlingsformer som kateter ablation af atriale eller ventrikulære arytmier vil uundgåeligt ændre begge strukturer. I den her beskrevne setup, kan lokale farmaceutiske ændring af målrettede strukturer (fx, specifik stimulation af parasympatiske ganglier) studeres. Udover målrettede ændringer er globale perfusion med forskellige lægemidler (fx, Beta-blokkere) let muligt, således at potentielle proarrhythmic eller antiarytmiske egenskaber af forskellige agenter kan studeres. Du bruger denne opsætning, kan interventioner og forskellige teknikker testes under stimulation eller hæmning af forskellige dele af det intracardiac autonome nervesystem, afslørende oplysninger af bestemte dele af det autonome nervesystem indvirkning på hjertefunktion og arrhythmogenesis. Yderligere, den murine konfiguration giver mulighed for at studere den kardiale autonome nervesystem i stater af sygdom som myokardieinfarkt, hjerteinsufficiens eller diabetes.
Afslutningsvis, enkel og velkendt Langendorff ex vivo hjerte perfusion systemet giver et fleksibelt grundlag for at ændre og studere virkningen af intracardiac neuroner på hjerte Elektrofysiologi og arrhythmogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Hartwig Wieboldt for hans fremragende teknisk bistand og UKE mikroskopi Imaging anlægget (Umif) af University Medical Center Hamburg-Eppendorf mikroskoper og støtte. Denne forskning blev finansieret som Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamborg e.V. og af DZHK (tyske Center for hjerte-kar-forskning) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41 (6), 597-603 (2000).
- Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (3), 171-181 (2004).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
- Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114 (14), 1497-1503 (2006).
- Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114 (10), 1601-1610 (2014).
- Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88 (88), 51671 (2014).
- Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7 (11), e49203 (2012).
- Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13 (3), 207-216 (2003).
- Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139 (2), 213-248 (2013).
- Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76 (2), 257-268 (2007).
- Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16 (4), 470-474 (2010).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7 (8), e1000172 (2009).
- Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
- Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
- Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).
- Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. , (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3 (3), e12328 (2015).
