Summary
Hier presenteren we een protocol voor de modulatie van het intracardiac autonome zenuwstelsel en de beoordeling van de invloed daarvan op fundamentele electrofysiologie, arrhythmogenesis en kamp dynamiek met behulp van een ex vivo Langendorff setup.
Abstract
Sinds de uitvinding in de late 19e eeuw, de Langendorff ex vivo hart perfusie systeem is nog steeds een relevant instrument voor de studie van een breed spectrum van fysiologische, biochemische, morfologische en farmacologische parameters in Centraal denervated harten. Hier beschrijven we een setup voor de modulatie van het intracardiac autonome zenuwstelsel en de beoordeling van de invloed daarvan op fundamentele electrofysiologie, arrhythmogenesis en cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) dynamiek. Het intracardiac autonome zenuwstelsel wordt gemoduleerd door de mechanische dissectie van atriale vet pads-in welke lymfkliertest ganglia zich voornamelijk bevinden — of door het gebruik van globale evenals gerichte farmacologische interventies. Een octapolar elektrofysiologische katheter wordt binnengebracht in de juiste atrium en het ventrikel rechts en epicardial geplaatste multi elektrode arrays (MEA) voor hoge resolutie toewijzing worden gebruikt om te bepalen van de cardiale electrofysiologie en arrhythmogenesis. Förster resonance energy transfer (FRET) imaging wordt uitgevoerd voor de real-time controle van cAMP in verschillende cardiale gebieden. Neuromorphology wordt bestudeerd door middel van antilichaam gebaseerde kleuring van hele hart met behulp van neuronale markeringen om de identificatie en de modulatie van de specifieke doelstellingen van het intracardiac autonome zenuwstelsel in de uitgevoerde studies te leiden. De ex vivo Langendorff setup zorgt voor een groot aantal reproduceerbare experimenten in een korte tijd. Echter het deels open karakter van de instellingen (bv., tijdens de MEA metingen) constante temperatuurcontrole bemoeilijkt en moet tot een minimum worden beperkt. Deze beschreven methode maakt het mogelijk om te analyseren en het moduleren van het intracardiac autonome zenuwstelsel in gedecentraliseerde harten.
Introduction
Het Langendorff ex vivo hart perfusie systeem is nog steeds een relevant instrument voor het uitvoeren van een breed spectrum van morfologische, fysiologische, biochemische en farmacologische studies in Centraal denervated harten1,2 ,3,4,5 sinds de uitvinding in de late 19th eeuw6. Dit systeem wordt tot op heden nog steeds veel gebruikt voor verschillende onderwerpen (bijv., ischemie-reperfusie) of om te studeren cardiale farmacologische effecten7,8, en is een basisinstrument in cardiovasculair onderzoek. De levensduur van deze methode resultaten van verschillende voordelen (bv., metingen zijn uitgevoerd zonder de invloed van het centrale zenuwstelsel of andere organen, systemische circulatie of circulerende hormonen). Indien nodig, kunnen geneesmiddelen worden toegevoegd op een gecontroleerde manier aan de perfusie-buffer of rechtstreeks toegepast op specifieke structuren. Experimenten zijn reproduceerbaar, en een relatief hoog aantal experimenten kan worden uitgevoerd in een korte periode van tijd. Het (gedeeltelijk) open karakter van de instelling kan temperatuurregeling moeilijk en moet rekening worden gehouden. Hoewel de Langendorff systeem ook in de grotere soorten9 gebruikt wordt, kleinere dieren worden voornamelijk gebruikt als de experimentele opzet minder complex en een grotere biologische variabiliteit is (bv., transgene muis modellen) kan worden gebruikt.
In de experimentele opzet van dit protocol is de invloed van het intracardiac autonome zenuwstelsel op elektrofysiologische basisparameters, ventriculaire arrhythmogenesis epicardial geleiding en cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) dynamiek geëvalueerd. Een groot aantal intracardiac ganglia, die zijn voornamelijk gevestigd in de atriale vet pads en zijn nu goed bekend bij de controle van de cardiale electrofysiologie onafhankelijk van centrale neuraal controle, zijn dat ofwel links intact of handmatig verwijderd met zorgvuldige mechanische dissectie. Een farmacologische modulatie van het autonome zenuwstelsel wordt wereldwijd door farmaceutische producten toe te voegen aan de perfusie buffer of lokaal door gerichte modulatie van de atriale ganglia uitgevoerd. Na de experimenten zijn de harten geschikt voor eenbeoordeling van de immunohistological als alle cellen van het bloed zijn verwijderd als gevolg van de continue perfusie, die de kwaliteit van de kleuring verhogen kan.
Het algemene doel van de beschreven technieken wil bieden nieuwe perspectieven voor gedetailleerde studies over het effect van het autonome zenuwstelsel op cardiale electrofysiologie en arrhythmogenesis in het hart van de muis. Een reden om deze techniek te gebruiken is dat het mogelijk is te bestuderen en te veranderen van het autonome zenuwstelsel zonder de invloed van het centrale zenuwstelsel. Een groot voordeel is de gemakkelijke tewerkstelling van farmacologische experimenten, in welke potentiële pro- of antiarrhythmic eigenschappen van oude en nieuwe agenten kunnen worden getest. Daarnaast zijn transgene en knockoutstadia Muismodellen van verschillende hartziekten beschikbaar voor het onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan hartritmestoornissen, hartfalen of metabole ziekten. Deze aanpak heeft ons begrip van hoe het autonome zenuwstelsel op atriale niveau invloed op ventriculaire cardiale electrofysiologie als het doen ontstaan van hartritmestoornissen hebben kan verbeterd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren werden goedgekeurd door de lokale autoriteiten van de staat van Hamburg, de commissies van het gebruik en de verzorging van de dieren van de Universiteit van Hamburg.
1. bereiding van het apparaat Langendorff
Opmerking: Een commercieel beschikbare Langendorff perfusie systeem wordt gebruikt.
- Bereid een gemodificeerde Krebs-Henseleit-oplossing (119 mM natriumchloride, 25 mM van natriumbicarbonaat, 4.6 mM van kaliumchloride, 1.2 mM van kalium fosfaat monobasisch, 1.1 mM van magnesium-sulfaat, 2.5 mM van calciumchloride, 8.3 van glucose, en 2 mM van het natrium pyruvaat). Een mengsel van 95% oxygen/5% kooldioxide aan de perfusie-oplossing om te voorkomen dat calcium neerslag toevoegen. Het filteren van de buffer met een poriegrootte van 0,22 µm.
- Een farmacologische agent toevoegen aan de buffer te onderzoeken van het effect op cardiale electrofysiologie en arrhythmogenesis zo nodig.
- Start van het waterbad en plaatsen van de oplossing van de perfusie met inbegrip van een mengsel van 95% oxygen/5% kooldioxide in het. De temperatuur van het waterbad, zodanig aanpassen dat de temperatuur van de oplossing perfusie direct vóór de canule ~ 37 ˚C is.
- Start de roller pomp en vul het apparaat met de perfusie oplossing zodra de juiste temperatuur is bereikt.
- De pomp-snelheid aanpassen voordat u het hart, zodat er geen luchtbellen zitten in de canule bij het mounten op het apparaat.
2. hard - en Software-voorbereiding
- Sluit een digitale data-acquisitiesysteem en de bijbehorende software aan het Langendorff toestel voor een ononderbroken registratie van de perfusie druk, debiet en hartslag.
- Stel de gerichte perfusie druk in de algemene instellingen tot 80 mmHg.
- Start de opname.
- Gebruik een katheter elektrofysiologie (Tabel of Materials) met platina-elektroden, een elektrode oppervlakte van 0,5 x 0,5 mm en een elektrode afstand van 0,5 mm voor de gegevensregistratie en stimulatie met een aangewezen digitale stimulans generator.
- Plaats de katheter dicht bij het gebied waar het hart na de gehechtheid aan het apparaat zal worden geplaatst.
- Voorbereiden van de stimulatie door 2 elektroden in de katheter te selecteren en gebruik de lengte van een cyclus van 100 ms.
3. bereiding van het hart
- Toevoegen van de kou (~ 2-4 ˚C) perfusie buffer (10-20 mL en 40-50 mL, zodat de hele schotel wordt gedekt) de 2 petrischalen (diameter van 6 cm en 10 cm) en de schotel met de canule en plaats hen op ijs direct volgende en onder de Microscoop. Een dubbele knoop rond de canule voor te bereiden.
- Snel accijnzen het hart na cervicale dislocatie door het openen van de thorax met behulp van Mayo schaar en pincet smalle patroon. Dan greep de aorta en de vena cava boven het diafragma met behulp van de verlostang Londen en accijnzen van de hart-longen-blok door het snijden van alle vaartuigen en bindweefsel dicht bij de wervelkolom met de schaar scheelzien.
- Breng het blok van de hart-Long in de eerste schotel (6 cm diameter) gevuld met de ijskoude buffer en verwijder voorzichtig de longen zonder beschadiging van het hart met behulp van scheelzien schaar en pincet van Londen. Plaats dan het hart onder de Microscoop en verwijder voorzichtig de zwezerik, de slokdarm en luchtpijp met behulp van voorjaar schaar en pincet Dumont SS.
- Gebruik de lente schaar om een gat van 1,5-2 mm in het bovenste gedeelte van het juiste atrium voor het inbrengen van de katheter. Een gat in de longslagader. Vervolgens snijd de aorta direct onder de supraaortic takken en verwijderen van het weefsel van de aorta, zodat de knoop kan gemakkelijk worden aangesloten.
- Houd de atriale vet pads, met inbegrip van de grote atrially gelegen ganglionated plexi, rond de linkerboezem intact of ze volledig verwijderen door zorgvuldige dissectie.
- Overbrengen van het hart naar de schotel met de canule en plaats deze onder de Microscoop. Trek de aorta over de canule met de verlostang Dumont SS en binden de bereid knoop strak rond de aorta. Zorg ervoor dat de canule niet te diep in de aorta is geplaatst, zodat de aortaklep en de coronaire bloedvaten zijn vrij gelaten.
- Snel de canule aan het Langendorff apparaat koppelen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen links in de canule.
- Schakel de perfusie-druk tot 80 mmHg, waardoor een constante druk perfusie.
- De katheter zorgvuldig in de juiste atrium en rechterventrikel invoegen zonder aan te raken of beschadiging van het hart en bevestig de katheter aan de canule met tape.
- Begin de stimulatie met de lengte van de bereid cyclus van 100 ms voor een periode van de evenwichtsinstelling eerste 20 min.
- Sluit de kamer zodat een stabiele temperatuur.
4. elektrofysiologische Parameters en Arrhythmogenesis
- Een geprogrammeerde stimulatie via de elektroden van de distale of proximale van de katheter op tweemaal de atriale of ventriculaire pacing drempel om te evalueren van de elektrofysiologische parameters zoals beschreven in de volgende stappen zijn van toepassing.
- Bepalen van de sinusknoop hersteltijd als de lengte van het maximale rendement cyclus na 10 s van forfaitaire ijsberen op een lengte van de cyclus S1S1 van 120 ms, 100 ms en 80 ms.
- Het Wenckebach punt bepalen als de langste lengte van de S1S1 cyclus (8 prikkels; S1S1: 100 ms; 2 ms stapsgewijze vermindering) met een verlies van 11 knooppunten AV-geleiding. Bepalen van de atrioventriculaire knooppunten vuurvaste perioden als de langste S1S2 (12 prikkels; S1S1: 120 ms, 110 ms en 100ms; een korte extrastimulus in combinatie met een vermindering van de S1S2 van 2 ms stapsgewijze) met een verlies van knooppunten AV-geleiding.
- Bepalen van de atriale en ventriculaire vuurvaste perioden als de langste S1S2 (12 prikkels; S1S1: 120 ms, 110 ms en 100ms; een korte extrastimulus in combinatie met een vermindering van de S1S2 van 2 ms stapsgewijze) met een afwezig atriale of ventriculaire antwoord10,11.
- Uitvoeren van een geprogrammeerde extrastimulation (S1S1: 120 ms, 100 ms en 80 ms, gevolgd door maximaal 3 extra beats; 60-20 ms met een stapsgewijze vermindering van 2 ms) of burst pacing protocollen (5 s bij S1S1: 50-10 ms met een stapsgewijze verlaging van 10 ms) in overeenstemming met de Verdragen Lambeth eva luate de ventriculaire arrhythmogenesis10,11,12.
5. epicardial geleiding metingen
Opmerking: Opnemen unipolaire epicardial electrograms door middel van een 128-kanaals, computerondersteunde opnamesysteem met een sampling rate van 25 kHz voor hoge resolutie toewijzing. Gebruik een 32 multi elektrodenserie (MEA; tussen elektrode afstand: 300 µm; 1,8 x 1,8 mm). Nota van dat de gegevens bandpass gefilterd (50 Hz werden) en gedigitaliseerd met 12 bits en een signaalbereik van 20 mV.
- Plaats de MEA op het aangewezen gebied van het hart en voeg de aarding naar een ander deel van het hart13,14,15.
- Plaats een epicardial stimulatie katheter dichtbij de MEA en start een constante stimulatie.
- Start de opname na de bevestiging van goed contact van de elektroden door het controleren van de signaalkwaliteit en amplitude.
- Gebruik een off line analyse voor de bepaling van de Golf propagatie snelheid en dispersie in de richting van de geleiding.
6. Förster Resonance Energy Transfer FRET-gebaseerd cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) Imaging
Opmerking: Voor FRET gebaseerde metingen, oogst harten van CAG-Epac1-kampen transgene muizen16.
- Gebruik een zelfgebouwde imaging systeem rond een stereomicroscoop15,17.
- Plaats de stereomicroscoop voor het hart en het aanpassen aan de gezichtsscherpte.
- Prikkelen van de cAMP sensor met een lichtbron [bijvoorbeeld, gebruik een single-golflengte licht emitterende diode (440 nm)]. Het splitsen van de uitstoot licht in donor en acceptor kanalen met behulp van een straal-splitter (voor een paar cyaan fluorescent proteïne/geel fluorescerende eiwit, gebruik een 565dcxr dichroïde spiegel en D480/30 en D535/40 emissie filters).
- Het waarborgen van een stabiele temperatuur door een plastic wrap rond de kamer.
- Het nemen van beelden met behulp van een camera complementary metal-oxide-semiconductor van de wetenschappelijke (sCMOS). Het coördineren van de lichtbron en de camera vastleggen van het beeld met een open source beeldbewerkingssoftware zoals Micro-Manager.
- Om te beginnen de Beeldacquisitie, duw de Multi-D Acq. knop en het opzetten van een time-lapse, die een afbeelding verwerft elke 10 s, met de juiste belichtingstijd, die afhankelijk van de sterkte het fluorescent signaal (ongeveer 100 ms).
- De eerder beschreven en beschikbaar online FRET en FRET online 2 -plugins-17 voor de afbeelding splitsen in twee kanalen, selecteer de regio's van belang en de verhouding tracering gebruiken
- Perfuse tijdens de verwerving, het hart met de gewijzigde Krebs-Henseleit oplossing die verschillende stoffen bevatten, afhankelijk van de aard van het experiment.
- Aan het einde van het experiment, schakel de overname door het indrukken van de knop stoppen en opslaan van de stack van beelden.
- Het analyseren van de gegevens van de FRET off line met behulp van een speciale analysesoftware die beelden kan worden gesplitst in twee identieke secties voor de donor en acceptor kanalen en FRET analyse kunt uitvoeren in meerdere regio's-of-interest.
Opmerking: Een speciale plug-in (off line FRET) nodig is, die wordt verstrekt in Sprenger et al. 17.- Start de software. De analyse door te gaan naar het Plugins menu openen en klik vervolgens op MicroManager, en vervolgens op Open bestand van de Micro-Manager.
- De FRET off line plugin om de time-lapse opgesplitst in twee identieke images voor het GVB en YFP kanalen kunnen voeren.
- Gebruik het hulpprogramma Freehand selecties ter gelegenheid van de regio van belang in de YFP afbeelding. Druk op de knop toevoegen aan de selectie toevoegen aan de Maatregel van de Multi -venster.
- Kies de regio van belang in de Maatregel van de Multi -venster en druk op Multi te verkrijgen van een tabel met gemiddelde grijs waarden voor elk frame en de regio. Kopieer en plak alle gegevens in een Excel-werkblad.
- Klik op het GVB afbeeldingsstapel. De dezelfde acties zoals in stap 6.10.4 uitvoeren voor de GVB-stack en de gemiddelde grijze waarden in hetzelfde Excel blad plakken.
- Juist de onbewerkte gegevens off line voor de factor bloeden-door middel van de donor in de acceptor kanaal17.
- Gebruik de volgende formule, waar B is de afloop-through-factor:
Ratio = (YFP - B-x CFP) / GVB - Bepalen van de afloop-via factor B door imaging een hart alleen uiting van GVB en meten van het percentage van de fluorescentie van de donor in het YFP-kanaal (B = YFP / GVB).
- Gebruik de volgende formule, waar B is de afloop-through-factor:
7. Neuromorphology
Opmerking: Analyseren het intracardiac autonome zenuwstelsel met behulp van geheel-mount immunostainings intact lymfkliertest harten. Merk op dat de meerderheid van de intracardiac ganglia zijn gelokaliseerd in de epicardial adipeus weefsel dicht bij de pulmonary aderen.
- Gebruik van verschillende technieken voor het afbeelden van neurofilament (algemene neuronale structuren; kip anti-NF-H, 1:3, 000), tyrosine hydroxylase (TH, sympathieke neuronale structuren; konijn α TH, 1:1, 000), en choline acetyltransferase (ChAT, parasympathische neuronale structuren; geit α ChAT, 1:50).
- Na de perfusie in het Langendorff apparaat, de harten van de muis oplossen in 10 mL van formaline gedurende 24 uur en bewaar ze in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ˚C.
- De harten in de deuk bleekmiddel bleekmiddel (4:1:1 methanol: waterstof peroxide oplossing 30% (m/m) in H2O: dimethylsulfoxide (DMSO)) voor 1 week bij 4 ˚C en hydrateren hen vervolgens naar PBS in een reeks van aflopende methanol in PBS (100%, 75%, 50%, 25%; elke 1 h) 18.
- Voer de volgende incubations in een 24-well-plate-formaat met een zachte agitatie bij 4 ˚C:
- Permeabilize van het hart in 1% Triton-X-100/PBS (PBS-T) voor 3 x 1 h bij kamertemperatuur voordat blokkeren ze 's nachts in een buffer met blokkerend [5% bovien serumalbumine (BSA) / PBS-T + 0,2% natriumazide].
- Verdun de antilichamen als volgt: geit α konijn α TH (1:1, 000), ChAT (1:50), kip α neurofilament (1:3, 000); secundaire antilichamen voor fluorescerende etikettering (1:500; of volgens de instructies van de fabrikant); biotinyleerd secundaire antilichamen voor de etikettering van chromogenic (1:200; of volgens de instructies van de fabrikant).
- Incubeer de specimens in primaire antilichamen verdund in een buffer met blokkerend voor 1 week op 4 ˚C.
- Het wassen van de harten voor 3 x 15 min in PBS-T voordat de incubatie van secundair antilichaam in een buffer met blokkerend voor 4 dagen.
- De harten voor 3 x 15 min in PBS-T wassen en ze opslaan in een medium van de montage voor fluorescerende vlekken gedurende 3 uur bij kamertemperatuur of gebruiken van een avidin-Biotine complexe detectie kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Incubeer vooraf de harten gedurende 1 uur in een commerciële buffer voor 3, 3'-diaminobenzidine (DAB), alvorens hen te ontwikkelen onder een visueel besturingselement in een DAB-bevattende buffer volgens de instructies van de fabrikant.
- Bewaar de specimens in dubbel gedestilleerd water.
- Paraffine secties, uitdrogen en de harten inbedden in paraffine.
- Knip 4-µm dik secties en deparaffinize hen volgens het laboratory's routine procedures. Of en hoe herwinning van het antigeen moet worden uitgevoerd dient te worden geschapen voor elke afzonderlijke installatie, aangezien het afhangt van de combinatie van antilichaam.
- De secties gedurende 10 minuten in een 0,2% Triton-X-100/Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), gevolgd door 3 x 5 min wast in eetlepels permeabilize
- Blokkeren van hen met 3% BSA/TBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer ze 's nachts bij 4 ˚C [primaire antilichamen: geit α ChAT (1:50), konijn α TH (1:500), kip α neurofilament (1:1, 000)] of 2 h bij kamertemperatuur (secundaire antilichamen fluorescentie-geëtiketteerd, 1:500) in 1% BSA/TBS met 3 x 5 min TBS daartussenin wast.
- 1 µg/mL bisbenzimide H33342 trihydrochloride toevoegen aan de oplossing van secundair antilichaam of gebruik een verschillende nucleaire kleuringstechniek.
- Monteer de dia's in een medium van de montage voor fluorescerende vlekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een afbeelding van de setup van de Langendorff inclusief 2 multi elektrode-arrays (MEA's). Voordat het experiment, bevindt de intracardiac catheter zich dicht bij de canule te vergemakkelijken van een snelle en gemakkelijke invoeging in het ventrikel rechts atrium/rechts en te zorgen voor een korte periode totdat de evenwichtsinstelling kunt starten. Het onderste gedeelte van de kamer kan worden verhoogd (Zie de pijlen in Figuur 1) zodat de kamer volledig gesloten is en een stabiele temperatuur garandeert.
Figuur 2 toont verschillende representatieve cardiale technieken. Figuur 2A een haematoxyline en eosine wordt (H & E) kleuring van een paraffine-sectie gepresenteerd. In de voorbeeldige uitbreiding (figuur 2B) toont een immunohistochemische kleuring van een atriale ganglion de overwegend parasympathische cellen (rood, ChAT-positieve) in vergelijking met minder talrijke sympathiek cellen (groen, TH positieve). In figuur 2C-E beschrijft een immunohistochemische kleuring van neurale (figuur 2C, groen, neurofilament) en sympathieke vezels (figuur 2D, rood, TH) evenals de overlay van de twee beelden (figuur 2E) hoe neurale vezels traverse van de atria via de coronaire sinus naar de achterste ventrikels.
Figuur 3 toont de RattenUitrustingen hart verbonden met de canule van het Langendorff apparaat met een ingevoegde octapolar katheter in de juiste atrium en rechterventrikel en een epicardial multi elektrodenserie (MEA) geplaatst op de voorste linker ventrikel ( Figuur 3A). Ventriculaire aritmie gevoeligheid testen via de elektroden in de RV wordt gepresenteerd in figuur 3B. De inductie van een ventrikeltachycardie in hart zich vaker na gedeeltelijke atriale denervation. In de uitgebreide MEA (Figuur 3 c) wordt de schematische lay-out van de elektroden gepresenteerd. Het is belangrijk om een stabiele epicardial contact van alle elektroden. In figuur 3D is de off line-geanalyseerd epicardial geleiding opgenomen door een MEA afgebeeld.
Figuur 4 toont FRET metingen in een hele hart wordt retrogradely geperfundeerd in het apparaat Langendorff. Verschillende gebieden van het hart kunnen worden geanalyseerd als nodig (figuur 4A). Een zowel globale als lokale actuele toepassing van farmaceutische producten is gemakkelijk mogelijk in deze opstelling (figuur 4B).
Figuur 1: Langendorff installatie met inbegrip van multi elektrode matrices (MEA's). De octapolar stimulatie en opname-katheter wordt geplaatst dichtbij het gebied waarin het hart zal worden bevestigd. Het onderste deel van de vergaderzaal zal worden verplaatst naar boven (witte pijlen) nadat het hart heeft zijn gekoppeld aan het apparaat, zodat een stabiele temperatuur wordt gewaarborgd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: de hele mount cardiale technieken beeltenis van delen van het autonome zenuwstelsel. A) voorstelling van een cardiale H & E gebeitste paraffine sectie (schaal bar 1 mm). B) een voorbeeldige uitbreiding van één immunohistochemisch gekleurd atriale ganglion toont de overwegend parasympathische cellen (rood, ChAT-positieve) in vergelijking met minder talrijke sympathiek cellen (groen, TH-positieve; schaal bar 75 µm). C-E) Vertegenwoordiger immunohistochemical technieken van neurale (figuur 2C, groen, neurofilament, NF) en sympathieke vezels (figuur 2D, red, TH, en hun overlay in figuur 2E) doorkruisen van de atria via de coronaire sinus (CS) naar de posterieure ventrikels. Voorbeeldige vezels zijn aangeduid met pijlpunten. Sterretjes duiden atriale ganglia. Schaal bar 1 mm. de LA, linkerboezem; LV, linker ventrikel; NF, neurofilament; PV, pulmonary aderen; RA, juiste atrium; RAA, rechts atriale aanhangsel; RV, rechterventrikel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Intra- en epicardial metingen met behulp van de setup Langendorff. A. dit deelvenster ziet u een voorbeeld van een lymfkliertest hart binnen het Langendorff systeem. De katheter intracardiac octapolar, die wordt ingevoegd in één epicardial meerdere elektrodenserie (MEA), de juiste atrium en ventrikel zijn afgebeeld. B. aritmie gevoeligheid tests met barsten stimulatie zonder (control) of met de inductie van een zelf beëindigen ventriculaire tachycardie [na gedeeltelijke atriale denervation (PAD)] worden afgebeeld. C. de epicardial MEA wordt afgebeeld met een uitbreiding van de schematische elektrode lay-out. D. Golf propagatie snelheid werd geanalyseerd met behulp van een op maat gemaakte software. De afstand tussen de isochrones is 2 m/s. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: FRET metingen in een Langendorff setup. A. de twee differentcAMP biosensor fluorescentie kanalen [gele fluorescerende proteïne (YFP) en cyaan TL proteïne (GVB)] gedurende de FRET metingen in een retrograde perfused hart worden afgebeeld. Indien nodig, de verschillende delen van het hart (b.v., atria en ventrikel) kunnen worden geanalyseerd (schaal bar: 1 mm). B. dit paneel toont een representatieve FRET experiment, dat cAMP niveaus tijdens een farmacologische stimulatie in het atrium en het linkerventrikel maatregelen. Eerst was het hart systeemkritisch geperfundeerd met de adenylyl cyclase activator NKH477, een forskolin analogon, te verhogen van het kamp. Vervolgens werd nicotine topisch toegepast en gericht op de atriale ganglia, die acuut cAMP verlagingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript, wordt de bekende Langendorff ex vivo hart perfusie systeem gepresenteerd als een hulpmiddel om te bestuderen van de impact van intracardiac neuronen op cardiale electrofysiologie en arrhythmogenesis met behulp van verschillende mapping en stimulatie technieken met inbegrip van endocardial en epicardial benaderingen.
Verschillende onderdelen van het protocol zijn cruciaal voor de installatie. Ten eerste is het belangrijk om een voorbereiding techniek waarin de atriale vet pads blijven intact of snel worden verwijderd zonder het myocardium verwonden te gebruiken. Ten tweede, een juiste afmeting opening heeft te snijden in het juiste atrium voor een gemakkelijk inbrengen van de katheter octapolar in de juiste atrium en het rechterventrikel. De katheter moet gemakkelijk ontaarden in het rechterventrikel zonder enige druk te genereren. Tijdens de gehechtheid van de katheter aan de canule, moet de katheter niet duik dieper in de ventrikel, om te voorkomen dat cardiale letsel. Ten derde, temperatuurregeling is een cruciaal onderdeel van alle Langendorff opstellingen1,2,5. De thermische zaal is gesloten tijdens de aritmie testen, zorgen voor een stabiele temperatuur. Maar voor MEA of FRET opnamen, de zaal moet tenminste gedeeltelijk open om metingen. Opnametijd tot een minimum moet worden beperkt, of andere technieken om temperatuur verlies, als zetten een plastic wrap rond de zaal tijdens langere metingen, moeten worden uitgevoerd. Ten vierde, multilaterale milieu-akkoorden moeten worden geplaatst op de dezelfde anatomische locaties in alle experimenten. Goed oppervlak contact, die door grote amplitudes in de real-time analyse is bevestigd, kan worden bereikt met behulp van twee multilaterale milieuovereenkomsten op andere sites, zodat een tegenwicht wordt geproduceerd. Ten vijfde: FRET metingen worden beïnvloed door beweging. Verklein de spontane beweging en is het hart met een stabiele frequentie tempo door de intracardiac catheter. Voor extra stabilisatie, een buis met een lichte vacuüm kan het stabiliseren van de apex.
Een voordeel van het Langendorff systeem is dat het hart kan vervolgens worden gebruikt voor immunohistological evaluaties van de cardiale zenuwstelsel. De continue perfusie verwijdert de meeste rode bloedcellen hebben een hoog niveau van autofluorescence19, verbetering van de kwaliteit van de kleuring. Na formaline fixatie, kan het hart worden opgeslagen in een temperatuur gecontroleerde (4 ˚C) omgeving in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing voor maximaal een jaar zonder merkbare veranderingen in de kleuring van kwaliteit.
De belangrijkste functie van deze opstelling is dat alle metingen worden verricht in een centraal denervated hart. De overwegend parasympathische atriale intracardiac ganglia zijn de laatste relais station binnen het hart20 zoals de sympathieke ganglion stellatum intrathoracically ligt en is daarom verwijderd tijdens de voorbereiding. Hoewel de intracardiac neuronen geen centrale input krijgen, is het gebleken dat zij nog steeds actief in een fysiologische manier zijn, aangezien de photoactivation van cardiale sympathische zenuwen de hartslag en cardiale contractiele kracht21 stijgt. In overeenstemming met deze bevindingen steunen het functionele belang van intracardiac neuronen in het centraal denervated hart, toonden we onlangs hun impact op de ventriculaire functie en arrhythmogenesis15.
Een voordeel van deze centraal denervated setup is dat het mogelijk de onderzoeker maakt te bestuderen de communicatie tussen verschillende intracardiac regionale neurale netwerken (bijvoorbeeld, de wisselwerking tussen atrium en ventrikel)15. Deze verschillen kunnen na de hart transplantatie in wie behandeling met de selectieve sinusknoop modulator ivabradine overleving verbetert, in vergelijking met de behandeling met de medicijnen metoprolol succinaat22voor patiënten van belang zijn. In een toekomstige stap, zal directe elektrische stimulatie van parasympathische (nervus vagus) of sympathiek structuren (Ggl. stellatum23) bijdragen tot het verbeteren van onze kennis van de interactie tussen de extra- en intracardiac autonome zenuwstelsel.
Het is belangrijk in gedachten te houden dat parasympatisch en sympathieke vezels zijn meestal mede gelokaliseerde zodat de huidige therapieën zoals katheterablatie van atriale of Ventriculaire ritmestoornissen zal onvermijdelijk wijzigen beide structuren. In de hier beschreven installatie kan de lokale farmaceutische wijziging van gerichte structuren (bijvoorbeeld, specifieke stimulatie van parasympathische ganglia) worden bestudeerd. Naast gerichte aanpassingen kan global perfusie met verschillende pharmaceuticals (bijvoorbeeld Beta-blokkers) gemakkelijk, zodat potentiële proarrhythmic of de antiarrhythmic eigenschappen van verschillende agentia kunnen worden bestudeerd. Met behulp van dit setup, kunnen interventies en verschillende technieken worden getest tijdens de stimulatie of remming van verschillende delen van het intracardiac autonome zenuwstelsel, onthullen van informatie van de impact van bepaalde delen van het autonome zenuwstelsel op hartfunctie en arrhythmogenesis. Verder, de lymfkliertest setup kunt bestuderen van de cardiale autonome zenuwstelsel in Staten van ziekte zoals hartinfarct, hartfalen of diabetes.
Kortom, biedt het eenvoudige en bekende Langendorff ex vivo hart perfusie systeem een flexibele basis om te wijzigen en het bestuderen van de impact van intracardiac neuronen op cardiale electrofysiologie en arrhythmogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Hartwig Wieboldt voor zijn uitstekende technische bijstand, en de UKE microscopie Imaging faciliteit (Umif) van de Universiteit medisch centrum Hamburg-Eppendorf voor het verstrekken van microscopen en ondersteuning. Dit onderzoek werd gefinancierd door Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. en door de DZHK (Duitse centrum voor cardiovasculair onderzoek) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41 (6), 597-603 (2000).
- Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (3), 171-181 (2004).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
- Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114 (14), 1497-1503 (2006).
- Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114 (10), 1601-1610 (2014).
- Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88 (88), 51671 (2014).
- Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7 (11), e49203 (2012).
- Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13 (3), 207-216 (2003).
- Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139 (2), 213-248 (2013).
- Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76 (2), 257-268 (2007).
- Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16 (4), 470-474 (2010).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7 (8), e1000172 (2009).
- Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
- Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
- Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).
- Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. , (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3 (3), e12328 (2015).
