Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ההשפעה של נוירונים Intracardiac על הלב אלקטרופיזיולוגיה, Arrhythmogenesis במערכת Langendorff Vivo לשעבר

Published: May 22, 2018 doi: 10.3791/57617
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 1, 1, 1, 1,2, 1,2, 2,3, 1,2
1Department of Cardiology-Electrophysiology, cNEP (cardiac Neuro- and Electrophysiology research group), University Heart Center, University Hospital Hamburg-Eppendorf, 2DZHK (German Center for Cardiovascular Research), 3Institute of Experimental Cardiovascular Research, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של האפנון של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac, את ההערכה של השפעתה על בסיסי אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis מחנה dynamics באמצעות התקנה Langendorff ex-vivo .

Abstract

מאז ההמצאה שלו במאהה 19 מאוחר, Langendorff ex-vivo הלב זלוף המערכת ממשיכה להיות לכלי רלוונטי לומד קשת רחבה של פרמטרים פיזיולוגיים, ביוכימי, מורפולוגיים תרופתי ב לבבות denervated מרכזי. כאן, אנו מתארים הכנה של האפנון של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac והערכת השפעתה על בסיסי אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis dynamics אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה). מערכת העצבים האוטונומית intracardiac הוא מווסת על ידי ניתוח מכני פרפור השומן רפידות-גרעיני מאתר שבו ממוקמים בעיקר — או ע י השימוש הכללית, כמו גם יישוב התערבויות תרופתי. קטטר אלקטרופיזיולוגיות octapolar מוחדרים אטריום ימין של החדר הימני, ומשמשים epicardial הציב אלקטרודה מרובה מערכים (מאה) למיפוי ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע אלקטרופיזיולוגיה הלב ואת arrhythmogenesis. פורסטר תהודה העברת אנרגיה (סריג) הדמיה מתבצע ניטור בזמן אמת של רמות מחנה באזורים הלב השונים. Neuromorphology הוא למד באמצעות נוגדן מבוססי מכתים כל לבבות באמצעות סמנים עצביים כדי להדריך את זיהוי אפנון של מטרות ספציפיות של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac במחקרים שבוצעו. ההגדרה Langendorff שמחוץ מאפשר מספר רב של ניסויים לשחזור בתוך זמן קצר. למרות זאת, הטבע פתוחה חלקית של ההתקנה (למשל., במהלך המדידות MEA) מקשה על בקרת טמפרטורה קבועה, יש לשמור עד למינימום. בשיטה המתוארת זו מאפשרת לנתח, לווסת את מערכת העצבים האוטונומית intracardiac בלבבות מבוזרת.

Introduction

Langendorff ex-vivo הלב זלוף המערכת ממשיכה להיות כלי רלוונטי לביצוע קשת רחבה של פיזיולוגיים, ביוכימי, מורפולוגיים, מחקרים ב מרכזי denervated לבבות1,2 ,3,4,5 מאז ההמצאה שלו ב מאוחר 19th המאה6. נכון להיום, מערכת זו נמצאת בשימוש עדיין נרחב על נושאים שונים (למשל., פגיעה reperfusion איסכמיה) או ללמוד דום לב תרופתי אפקטים7,8, הוא כלי בסיסי מחקר הלב וכלי הדם. תוחלת החיים של שיטה זו היא תוצאה של מספר יתרונות (למשל., מדידות מבוצעות ללא השפעת מערכת העצבים המרכזית או אחרים איברים, מחזור מערכתי, או במחזור הורמונים). אם יש צורך, תרופות ושניתן להוסיף בצורה מבוקרת את המאגר זלוף או חלה על מבנים ספציפיים ישירות. ניסויים לשחזור, מספר גבוה יחסית של ניסויים יכול להתבצע תוך תקופה קצרה של זמן. אופי פתוח (באופן חלקי) ההתקנה יכול להפוך לוויסות טמפרטורת קשה ואני צריכה להילקח בחשבון. למרות שהמערכת Langendorff משמש גם מינים גדולים יותר9, חיות קטנות יותר משמשות בעיקר הגדרת הניסוי הוא פחות מורכב, השתנות ביולוגי גדול יותר (למשל., הטרנסגניים העכבר מודלים) יכול לשמש.

בכיוונון ניסיוני של פרוטוקול זה, היא ההשפעה של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac על פרמטרים בסיסיים אלקטרופיזיולוגיות, arrhythmogenesis חדרית, הולכה epicardial dynamics אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה) הערכה. מספר גדול של הגרעינים intracardiac, אשר ממוקמים בעיקר רפידות השמן פרפור, ידועים כעת לשליטה עצמאית של בקרה עצבית מרכזי הלב אלקטרופיזיולוגיה, הם שגם נשאר שלם או הוסר באופן ידני עם מכונות זהיר הקרע אפנון תרופתי של מערכת העצבים האוטונומית מתבצע באופן גלובלי על-ידי הוספת תרופות למאגר זלוף או באופן מקומי על-ידי אפנון יישוב של הגרעינים פרפור. לאחר הניסויים, הלבבות מתאימים היטב הערכה immunohistological כמו כל תאי הדם הוסר עקב זלוף מתמשך, אשר יכול להגביר את איכות מכתים.

המטרה הכוללת של טכניקות המתואר הוא להציע פרספקטיבות הרומן ללימודי מפורט לגבי ההשפעה של מערכת העצבים האוטונומית על הלב אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis בלב העכבר. סיבה להשתמש בטכניקה זו היא שניתן ללמוד ולשנות את מערכת העצבים האוטונומית ללא ההשפעה של מערכת העצבים המרכזית. אחד היתרונות העיקריים להעסקת קל ניסויים תרופתי, במאפייני איזה פוטנציאל pro - או תרופות ישנות, סוכנים חדשים יכול להיבדק. בנוסף, העכבר הטרנסגניים נוקאאוט מודלים של מחלות לב שונות זמינים לחקור את המנגנונים שבבסיס הפרעות קצב, אי ספיקת לב או מחלות מטבוליות. גישה זו יש משופרת הבנתנו כיצד מערכת העצבים האוטונומית על רמת פרוזדורים יכולים להשפיע אלקטרופיזיולוגיה לב חדרית ומעגל של הפרעות בקצב הלב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על-ידי הרשויות המקומיות של המדינה של המבורג, טיפול בבעלי חיים אוניברסיטת המבורג שימוש ועדות.

1. הכנת המנגנון Langendorff

הערה: מערכת זמינים מסחרית זלוף Langendorff משמש.

  1. להכין פתרון קרבס-Henseleit שונה (119 מ מ של נתרן כלורי, 25 מ מ של סודיום ביקרבונט, 4.6 מ מ 1.2 מ מ של אשלגן פוספט monobasic, 1.1 מ מ מגנזיום גופרתי, 2.5 מ מ של סידן כלורי, 8.3 מ"מ של גלוקוז, ו 2 מ מ של נתרן, אשלגן כלורי פירובט). להוסיף תערובת של 95% oxygen/5% פחמן דו חמצני הפתרון זלוף למניעת משקעים סידן. לסנן את המאגר עם גודל הנקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
  2. הוסף סוכן תרופתי המאגר כדי לחקור את השפעתו על הלב אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis לפי הצורך.
  3. להתחיל את המים הרותחים ומניחים הפתרון זלוף כולל תערובת של 95% oxygen/5% פחמן דו חמצני בתוכו. להתאים את הטמפרטורה של האמבט במים, כך הטמפרטורה הפתרון זלוף ישירות לפני הצינורית הלעפה תרוטרפמט ~ 37.
  4. . הפעל את המשאבה רולר ולמלא את המנגנון עם הפתרון זלוף ברגע מתמלאת בטמפרטורה הנכונה.
  5. להתאים את קצב משאבת לפני שתצרף את הלב, כך אין בועות אוויר נותרו ב הצינורית כאשר זה גובר על המנגנון.

2. קשה - והכנות תוכנה

  1. חבר מערכת רכישת נתונים דיגיטליים והתוכנה המתאימה שלה Langendorff מכשירי הקלטה רציפה של הלחץ זלוף, קצב הזרימה, קצב הלב.
    1. הגדר את הלחץ זלוף יישוב ב'הגדרות כלליות עד 80 מ מ כספית.
    2. . תתחיל להקליט
  2. השתמש של קטטר electrophysiology (טבלה של חומרים) עם אלקטרודות הפלטינה, על פני האלקטרודה 0.5 x 0.5 מ מ מרווח אלקטרודה של 0.5 מ מ כדי להפוך את נתוני ההקלטה גירוי עם גנרטור גירוי דיגיטלי ייעודי.
    1. מניחים את הצנתר קרוב לאזור שבו ימוקמו הלב לאחר הקובץ המצורף המנגנון.
    2. להכין את הגירוי על-ידי בחירה 2 אלקטרודות הקטטר ולהשתמש באורך המחזור של-100 מילישניות.

3. הכנה של הלב

  1. הוסף את הקור (הלעפה תרוטרפמט ~ 2-4) מאגר זלוף (10-20 mL ו- 40-50 מל ', כך המנה כולה מכוסה) 2 פטרי (קוטר 6 ס"מ, 10 ס"מ), המנה עם בצינורית ואת המקום אותם על קרח ישירות הבאה, תחת המיקרוסקופ. להכין קשר כפול סביב הצינורית.
  2. במהירות לסלק את הלב לאחר נקע בצוואר הרחם באמצעות פתיחת בית החזה בעזרת מספריים מאיו ומלקחיים דפוס צרים. לאחר מכן לאחוז את העורקים ואת הווריד הנבוב מעל הסרעפת עם המלקחיים לונדון, לסלק את הבלוק לב-ריאה על ידי חיתוך כל כלי של רקמת חיבור עמוד השדרה עם המספריים פזילה.
  3. להעביר את גוש לב-ריאה לתוך המנה הראשונה (קוטר 6 ס"מ) מלא עם המאגר הקר, הסר בזהירות את הריאות ללא פגיעה בלב באמצעות מספריים פזילה ומלקחיים לונדון. אז במקום הלב מתחת למיקרוסקופ, הסר בזהירות בלוטת התימוס, ושט קנה הנשימה באמצעות מספריים האביב ומלקחיים דומונט האס. אס.
  4. השתמש את המספריים האביב כדי לחתוך חור של 1.5-2 מ מ בחלק העליון של אטריום ימין על החדרת הקטטר. לחתוך חור בעורק הריאה. לאחר מכן חותכים את העורקים ישירות תחת הענפים supraaortic, להסיר את הרקמה של אבי העורקים, כך הקשר יכול להיות מצורף בקלות.
  5. לשמור את רפידות השמן פרפור, כולל סרן atrially ממוקם plexi ganglionated, סביב אטריום שמאל תקין או להסיר אותם לחלוטין על ידי ניתוח זהיר.
  6. להעביר המנה עם הצינורית בלב ולמקם אותו מתחת למיקרוסקופ. תעצור העורקים הצינורית עם המלקחיים דומונט האס. אס, יהדקו מוכן בחוזקה אבי העורקים. ודא כי הצינורית אינם ממוקמים עמוק מדי באבי העורקים כך את שסתום אבי העורקים ואת כלי הדם הכליליים נותרו ללא תשלום.
  7. לצרף את הצינורית במהירות המנגנון Langendorff. ודא כי ישנם אין בועות עזב את הצינורית.
  8. לעבור את הלחץ זלוף 80 מ מ כספית, ומאפשר זלוף לחץ קבוע.
  9. להוסיף את הצנתר בזהירות לתוך העלייה הימנית ואת החדר הימני בלי לגעת או לפגוע בלב ולצרף את הצנתר הצינורית עם קלטת.
  10. להתחיל הגירוי עם אורך מחזור מוכן 100 ms לתקופה equilibration הראשונית 20 דקות.
  11. סגור את התא כדי לאפשר על טמפרטורה יציבה.

4. אלקטרופיזיולוגיות פרמטרים ו- Arrhythmogenesis

  1. להחיל על גירוי מתוכנת באמצעות האלקטרודות דיסטלי או מקורב של הקטטר פעמיים על מפתן פרפור או חדרית pacing כדי להעריך את הפרמטרים אלקטרופיזיולוגיות כפי שתואר בשלבים הבאים.
    1. לקבוע את זמן ההחלמה של סינוס צומת כמו אורך מרבי מחזור החזרה אחרי 10 s של בריבית קבועה צועד על S1S1 מחזור אורך 120 ms, 100 ms ו- 80 ms.
    2. לקבוע את הנקודה Wenckebach כמו אורך מחזור S1S1 הארוך ביותר (8 גירויים; S1S1: 100 ms; 2 ms הפחתת stepwise) עם הפסד של 11 הולכה קטרי AV. לקבוע את תקופות עקשן קטרי atrioventricular כמו S1S2 הארוך ביותר (12 גירויים; S1S1: 120 ms, 110 ms, בהפרשי; אחד קצר בשילוב extrastimulus עם הפחתה של 2 מילי-שניות stepwise S1S2) עם הפסד של הולכה קטרי AV.
    3. לקבוע התקופות פרפור, חדרית עקשן כמו S1S2 הארוך ביותר (12 גירויים; S1S1: 120 ms, 110 ms, בהפרשי; אחד קצר בשילוב extrastimulus עם הפחתה של 2 מילי-שניות stepwise S1S2) עם מענה נעדר פרפור או חדרית10,11.
  2. לבצע extrastimulation מתוכנתים (S1S1: 120 ms, 100 ms ו- ms 80, ואחריו עד 3 פעימות נוספות; 60-20 ms עם הפחתה של 2 מילי-שניות stepwise) או פרץ צועד פרוטוקולים (5 s ב S1S1: 50-10 ms עם ירידה stepwise 10 ms) בקו אחד עם האמנות ארל'ס קורט כדי אווה luate11,10,12arrhythmogenesis חדרית.

5. מדידות הולכה epicardial

הערה: שיא unipolar epicardial electrograms באמצעות מערכת הקלטה 128 ערוצים, המחשב בסיוע עם קצב הדגימה של 25 קילו-הרץ עבור מיפוי ברזולוציה גבוהה. השתמש מערך מרובה אלקטרודה 32 (MEA; המרחק בין אלקטרודה: מיקרומטר 300; 1.8 x 1.8 מ"מ). שים לב כי הנתונים היו bandpass מסוננים (50 הרץ), דיגיטציה עם 12 סיביות ומגוון אות של 20 mV.

  1. מקום כר הדשא באזור המיועד של הלב ולהוסיף את ההארקה לחלק אחר של הלב13,14,15.
  2. המקום של קטטר גירוי epicardial קרוב כר הדשא ולהתחיל עם גירוי מתמיד.
  3. . תתחיל להקליט לאחר האישור של קשר טוב של האלקטרודות על-ידי בדיקת איכות אות ו משרעת
  4. השתמש ניתוח במצב לא מקוון עבור קביעת מהירות התפשטות הגל, פיזור בכיוון הולכה.

6. פורסטר תהודה להעביר אנרגיה סריג מחזורית אדנוזין Monophosphate (מחנה) דימות מבוסס

הערה: למדידות מבוסס סריג, לקצור לבבות מ חטיבתי-Epac1-מחנות העכברים הטרנסגניים16.

  1. השתמש מערכת הדמיה העצמי נבנה סביב15,stereomicroscope17.
  2. מניחים את stereomicroscope כנגד הלב ולהתאים אותו עבור חדות.
  3. לרגש את החיישן המחנה עם מקור אור [למשל, להשתמש יחיד-גל אור דיודה (440 ננומטר)]. לפצל את פליטת אור לתוך ערוצי התורם ואת מקבל משתמש במפצל קרן (עבור זוג חלבון פלואורסצנטי החלבון הניאון ציאן/צהוב, שימוש 565dcxr מראה ודיקרואיק זוהר, מסננים פליטה D480/30 ו- D535/40).
  4. ודא טמפרטורה יציבה על ידי לשים ניילון נצמד סביב החדר.
  5. קח תמונות באמצעות מצלמה מדעי משלימים מתכת--מוליך למחצה (sCMOS). לתאם את מקור האור ואת לכידת תמונה מצלמה עם מקור פתוח הדמיה תוכנה כמו מיקרו-מנהל.
  6. כדי להתחיל את רכישת התמונה, לדחוף את Multi-D Acq. כפתור ולהגדיר זמן לשגות, אשר רוכש תמונה כל 10 s, עם הזמן החשיפה המתאים, אשר תלוי על כוחו של האות פלורסנט (בסביבות 100 ms).
  7. השתמש בעבר תיאר וזמין תדאג באינטרנט , תדאג 2 באינטרנט תוספים17 כדי לפצל את התמונה שני ערוצים, בחר את האזורים של עניין ולאחר לנטר את העקיבה יחס.
  8. במהלך רכישת, perfuse את הלב עם הפתרון קרבס-Henseleit שונה המכילה חומרים שונים, בהתאם לאופי הניסוי.
  9. בסוף הניסוי, לכבות את הרכישה על-ידי לחיצה על לחצן עצור ולשמור על הערימה של תמונות.
  10. לנתח את הנתונים סריג במצב לא מקוון באמצעות תוכנה ייעודית ניתוח ניתן לפצל לשני חלקים זהים עבור הערוצים התורם ואת מקבל תמונות, באפשרותך לבצע ניתוח סריג לטובת מרובות אזורים-של.
    הערה: ייעודי plug-in (דאגה במצב לא מקוון) נדרשת, אשר ניתנת ספרנג'ר. et al. 17.
    1. הפעל את התוכנה. פתח את הניתוח על-ידי מעבר לתפריט תוספים ולאחר מכן לחץ על MicroManager, ולאחר מכן על פתח קובץ מיקרו-מנהל.
    2. להפעיל את התוסף תדאג במצב לא מקוון כדי לפצל מואץ שתי תמונות זהות עבור הערוצים CFP ו YFP.
    3. השתמש בכלי בחירות חופשיות כדי לסמן את האזור של עניין בתמונה YFP. לחצו על כפתור הוסף כדי להוסיף את הבחירה לחלון מידה מרובה .
    4. בחר אזור עניין בחלון מרובה מידה ולחץ רב להשיג שולחן עם ערכי אפור כלומר עבור כל מסגרת ואזור. העתק והדבק את כל הנתונים לתוך גיליון Excel.
    5. לחץ על אוסף תמונות CFP. לבצע את אותן פעולות כמו שלב 6.10.4 עבור המחסנית CFP ולהדביק את ערכי אפור כלומר באותו גיליון Excel.
  11. לתקן את הנתונים הגולמיים במצב לא מקוון עבור הגורם בליד-דרך של התורם לתוך ערוץ מקבל17.
    1. השתמש הנוסחה הבאה, כאשר B הוא הגורם בליד-דרך:
      יחס = (YFP - B x CFP) / CFP
    2. לקבוע את הגורם בליד-דרך B על ידי הדמיה לב לבטא CFP רק ולמדוד את האחוז של קרינה פלואורסצנטית התורם בערוץ YFP (B = YFP / CFP).

7. Neuromorphology

הערה: ניתוח של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac באמצעות immunostainings כולה-הר לב מאתר ללא פגע. שימו לב כי הרוב המכריע של הגרעינים intracardiac מותאמים את רקמת שומן epicardial קרוב הוורידים ריאתי.

  1. השתמש stainings שונים על תיאור של neurofilament (מבנים עצביים כללי; עוף אנטי-NF-H, 1:3, 000), hydroxylase טירוזין (TH, סימפטי מבנים עצביים; ארנב α TH, 1:1, 000), ו acetyltransferase כולין (צ'אט, הפארא-סימפתטי מבנים עצביים; α עז צ'אט, 1:50).
  2. לאחר זלוף במנגנון Langendorff, לתקן את הלבבות העכבר 10 מ"ל של פורמלין במשך 24 שעות ביממה, לאחסן אותם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 הלעפה תרוטרפמט.
  3. מלבין את הלבבות אקונומיקה של דנט (מתנול 4:1:1: מימן על-חמצני פתרון 30% (w/w) ב- H2o: דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)) עבור שבוע 1-4 הלעפה תרוטרפמט, נתרענן אותם לאחר מכן כדי PBS בסדרת יורד מתנול ב- PBS (100%, 75%, 50%, 25%; 1 h) 18.
  4. לבצע את incubations הבאים בתבנית 24-ובכן-צלחת עם עצבנות עדין-הלעפה תרוטרפמט 4:
    1. Permeabilize הלבבות 1% טריטון-X-100/PBS (PBS-T) עבור 3 x 1 h בטמפרטורת החדר לפני חסימת אותם בן לילה במאגר חסימה [5% אלבומין שור (BSA) / PBS-T + אזיד הנתרן 0.2%].
    2. לדלל את הנוגדנים כדלקמן: עז α צ'אט (1:50), ארנב α TH (1:1, 000), עוף α neurofilament (1:3, 000); נוגדנים משניים עבור תוויות פלורסנט (שבערך; או על פי הוראות היצרן); biotinylated נוגדנים משניים עבור תוויות הדפסות כסף (1:200; או על פי הוראות היצרן).
  5. דגירה דגימות של נוגדנים העיקרי מדולל במאגר חסימה לשבוע 1-4 הלעפה תרוטרפמט.
  6. רחץ את ליבם במשך 3 x 15 min ב- PBS-T לפני הדגירה נוגדנים משניים במאגר חסימה למשך 4 ימים.
  7. לשטוף את ליבם במשך 3 x 15 min ב- PBS-T ו לאחסן אותם במדיום הרכבה עבור צביעת פלורסנט עבור 3 שעות בטמפרטורת החדר או להשתמש ערכת זיהוי מורכבים אבידין-ביוטין בהתאם להוראות היצרן.
  8. מראש דגירה הלבבות עבור h 1 במאגר מסחרי בשביל 3, 3'-diaminobenzidine (DAB), לפני לפתח אותם תחת שליטה ויזואלית מאגר המכיל DAB בהתאם להוראות היצרן.
  9. אחסן את דגימות מים מזוקקים כפול.
  10. עבור מקטעים פרפין, מייבשים, להטביע את הלבבות פרפין.
    1. לחתוך חלקים בעובי 4-מיקרומטר ו deparaffinize אותם על פי הנהלים שגרתית של המעבדה. וכיצד אנטיגן אחזור צריך לבצע צריך שתוקם עבור כל התקנה בודדים כיוון שהוא תלוי על השילוב נוגדן.
    2. Permeabilize הסעיפים 10 דקות ב- 0.2% טריטון X-100/טריס-באגירה מלוחים (TBS), ואחריו 3 x 5 דקות שוטף ב- TBS.
    3. לחסום אותם עם 3% BSA/TBS לשעה בטמפרטורת החדר.
    4. דגירה אותם בן לילה-הלעפה תרוטרפמט 4 [נוגדנים ראשי: עז α צ'אט (1:50), ארנב α TH (שבערך), עוף neurofilament α (1:1, 000)] או 2 h בטמפרטורת החדר (נוגדנים משניים מתויג פלורסצנטיות, שבערך) 1% BSA/TBS עם 3 x 5 דקות שוטף TBS שביניהם.
    5. להוסיף 1 µg/mL של bisbenzimide H33342 trihydrochloride הפתרון נוגדנים משניים או להשתמש בשיטה שונה מכתימים גרעינית.
    6. לטעון את השקופיות במדיום הרכבה עבור צביעת פלורסנט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג תמונה של ההתקנה Langendorff כולל 2 מערכים רב אלקטרודה (אותי). לפני הניסוי, הקטטר intracardiac ממוקם קרוב הצינורית כדי להקל על הכניסה מהיר וקל בחלל האטריום/ממש ולהבטיח פרק זמן קצר עד equilibration יכולה להתחיל. החלק התחתון של החדר יכול להיות מוגבר כאן (ראו החיצים באיור1) כך הלשכה סגורה לחלוטין והוא מבטיח טמפרטורה יציבה.

איור 2 מציג שונה נציג stainings הלב. איור 2A hematoxylin ו אאוזין (H & E) צביעת של מקטע פרפין מוצג. ב ההרחבה למופת (איור 2B), נוגדן של גנגליון פרפור אחד מדגים את התאים בעיקר הפאראסימפתטית (אדום, צ'אט-חיוביים) לעומת פחות תאי אוהדים רבים (ירוק, תאנון חיובי). ב- 2C איור-E נוגדן של עצבי (איור 2C, ירוק, neurofilament) וסיבים סימפטי (איור דו-ממדי, אדום, ה) כמו גם הכיסוי של שתי תמונות (איור 2E) מתארת סיבים עצביים איך העברת מ אטריה דרך הסינוס התקף לב לכיוון החדרים האחוריים.

איור 3 מראה מאתר הלב קשור הצינורית של המנגנון Langendorff עם קטטר שנוסף octapolar העלייה הימנית, החדר הימני והניח מערך מרובה אלקטרודה epicardial (מאה) על החדר השמאלי הקדמי ( איור 3 א). הפרעות קצב חדרית הרגישות בדיקות באמצעות האלקטרודות בתוך הקרוואן מוצג באיור 3B. אינדוקציה של טכיקרדיה חדרית בלבבות אירעה בתדירות גבוהה יותר לאחר denervation פרפור חלקית. כר הדשא מוגדלת (איור 3C) הוא הציג את הפריסה סכמטי של האלקטרודות. חשוב להבטיח איש קשר epicardial יציב של כל אלקטרודות. דמות תלת-ממד מתואר את מנותק מנותח epicardial הולכה שהוקלט על ידי MEA.

איור 4 מראה סריג מדידות בלב שלם להיות retrogradely perfused במנגנון Langendorff. ניתן לנתח אותם אזורים שונים של הלב ככל הדרוש (איור 4A). יישום אקטואלי הכללית, כמו גם המקומי של תרופות אפשרי בקלות בתוכנית התקנה זו (איור 4B).

Figure 1
איור 1: הגדרת Langendorff כולל מערכים רב אלקטרודה (אותי). הקטטר להקלטה ולניתוח octapolar ממוקמת סמוך לאזור שבו יהיה צמוד ללב. החלק התחתון של התא יועבר כלפי מעלה (לבן חצים) אחרי הלב חובר למכשירים כך טמפרטורה יציבה מובטחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: דום לב כל הר stainings המתארים חלקים של מערכת העצבים האוטונומית. A) תיאור של הלב H & E שהוכתמו פרפין סעיף (גודל בר 1 מ"מ). B) הגדלה למופת של אחד immunohistochemically צבעונית גנגליון פרפור מדגים את התאים בעיקר הפאראסימפתטית (אדום, צ'אט-חיוביים) לעומת פחות תאי אוהדים רבים (ירוק, TH-חיובית; סולם בר מיקרומטר 75). C-E) נציג immunohistochemical stainings של עצבי (איור 2C, ירוק, neurofilament, NF) וסיבים סימפטי (איור דו-ממדי, אדום, TH ו שלהם כיסוי ב איור 2E) העברת מ אטריה דרך הסינוס התקף לב (CS) לעבר החדרים האחוריים. סיבי למופת מסומנים על ידי ראשי חץ. הכוכביות מציינות הגרעינים פרפור. גודל בר 1 מ מ. לה, אטריום שמאל; LV, החדר השמאלי; NF, neurofilament; PV, הוורידים ריאתי; רא, אטריום ימין; אטול ראה, גפה פרפור נכון; RV, החדר הימני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 3
איור 3: אינטרה - ומדידות epicardial באמצעות הגדרת Langendorff. א. לוח זה מראה דוגמה של לב מאתר בתוך מערכת Langendorff. הקטטר intracardiac octapolar, שבו מוכנס אטריום ימין החדר, ואת אחד epicardial מרובה האלקטרודות (מאה) מתוארים. B. הפרעה בקצב הלב באמצעות בדיקות רגישות פרץ גירוי ללא (בקרה) או עם תנאי הגיוס של עצמי הפסקת מתוארים טכיקרדיה חדרית [לאחר denervation פרפור חלקית (PAD)]. ג. כר הדשא epicardial מתואר – הגדלה של הפריסה אלקטרודה סכמטי. ד. מהירות התפשטות הגל נותחו באמצעות תוכנה בהזמנה אישית. המרחק בין isochrones הוא 2 m/s אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: סריג מידות מלכודת Langendorff. א. שני differentcAMP ביוסנסור פלורסצנטיות הערוצים [צהוב חלבון פלואורסצנטי (YFP), חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP)] במהלך המדידות סריג בלב perfused רטרוגרדית מתוארים. במידת הצורך, ניתן לנתח בחלקים שונים של הלב (למשל, אטריה, החדר) (סרגל קנה מידה: 1 מ מ). B. חלונית זו מציגה ניסוי סריג נציג, אשר מודד רמות במחנה במהלך גירוי תרופתי אטריום, החדר השמאלי. ראשית, הלב היה perfused מערכתית עם activator cyclase adenylyl NKH477, analogon forskolin, כדי להגדיל את רמות המחנה. לאחר מכן ניקוטין היה topically מוחל, מכוון את הגרעינים פרפור, אשר בחריפות מופחתת רמות המחנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כתב יד זה, Langendorff ידועים שמחוץ הלב זלוף המערכת מוצג ככלי לחקור את ההשפעה של נוירונים intracardiac על הלב אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis באמצעות מיפוי השונות וטכניקות גירוי כולל גישות endocardial epicardial.

בכמה חלקים של הפרוטוקול מכריעים עבור ההתקנה. ראשית, חשוב להשתמש בטכניקה הכנה בה רפידות השמן פרפור להישאר שלמים או יוסרו במהירות מבלי להזיק שריר הלב. שנית, חור בגודל תקין צריך להיות שותף אטריום ימין להכנסה קל של הקטטר octapolar לתוך העלייה הימנית ואת החדר הימני. הקטטר צריך להחליק בקלות לתוך החדר הימני מבלי ליצור לחץ כלשהו. במהלך הקובץ המצורף של הקטטר הצינורית, הקטטר צריך לא לטבול עמוק יותר לתוך החדר, כדי למנוע פציעות הלב. שלישית, בקרת טמפרטורה הוא חלק חיוני של כל Langendorff setups1,2,5. תא תרמי סגורה במהלך ההפרעה בדיקות, הקפדה על טמפרטורה יציבה. אך להקלטות MEA או סריג, החדר צריך להיות לפחות בחלקו פתוח כדי לאפשר מדידות. זמן ההקלטה יש לשמור עד למינימום או בטכניקות אחרות כדי לצמצם את אובדן חום, כמו לשים ניילון נצמד סביב החדר במהלך מדידות זמן רב יותר, יש לבצעו. רביעית, אותי צריך להיות ממוקם על אותם מקומות אנטומי כל הניסויים. משטח מגע טוב, אשר אושר על ידי amplitudes גדולה בניתוח בזמן אמת, יכולה להיות מושגת באמצעות שני אותי באתרי מול כך החלק הפנימי הוא מיוצר. חמישית, סריג מדידות מושפעים התנועה. כדי לצמצם תנועה ספונטנית, הלב הוא בקצב בתדר יציב על ידי הקטטר intracardiac. על ייצוב נוסף, צינור עם שואב אבק קטן יכול לייצב את השיא.

אחד היתרונות של מערכת Langendorff הוא כי הלבבות יכול לשמש לאחר מכן immunohistological הערכות של מערכת העצבים הלב. זלוף רציפה מסירה את רוב תאי דם אדומים אשר יש רמה גבוהה של autofluorescence19, שיפור איכות מכתים. לאחר קיבוע פורמלין, ניתן לאחסן את הלבבות בסביבה מבוקרת (הלעפה תרוטרפמט 4) הטמפרטורה בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח במשך שנה ללא שינויים בולטים מכתים איכות.

התכונה החשובה ביותר של תוכנית התקנה זו היא כי כל המדידות מבוצעות בלב denervated מרכזי. הגרעינים intracardiac פרפור בעיקר הפארא-סימפתטי הן תחנת הממסר האחרון בתוך הלב20 stellatum גנגליון אוהדת הינו ממוקם intrathoracically, לפיכך מוסר במהלך ההכנה. למרות intracardiac הנוירונים לקבל קלט המרכזי, הוכח כי הם עדיין פעילים באופן פיזיולוגי, כמו photoactivation של הלב העצבים הסימפתטית מגבירה את קצב הלב ואת הכוח כויץ לב21. בקנה אחד עם ממצאים אלה תומכים את חשיבות תפקודית של נוירונים intracardiac בלב מרכזי denervated, לאחרונה להדגים את ההשפעה שלהם על תפקוד ו- arrhythmogenesis15.

אחד היתרונות של תוכנית התקנה זו מרכזי denervated הוא שהיא מאפשרת החוקר ללמוד התקשורת בין שונים intracardiac אזוריים רשתות עצביות (למשל, האינטראקציה בין אטריום לבין החדר)15. הבדלים אלה שעשוי להיות רלוונטי עבור חולים לאחר השתלת לב אשר טיפול עם ivabradine אפנן סלקטיבי סינוס צומת משפר הישרדות, לעומת טיפול עם בטא metoprolol succinate22. בשלב עתידי, גירוי חשמלי ישיר של סימפתטית (העצב התועה) או מבנים סימפטי (Ggl. stellatum23) יסייע לשפר את הידע שלנו על האינטראקציה בין תוספת - intracardiac מערכת העצבים האוטונומית.

חשוב לזכור סימפתטית הזה והם סיבי סימפטי בעיקר שותף מקומי כך טיפולים שוטפים כמו אבלציה קטטר של הפרעות קצב פרפור או חדרית יהיה בלתי נמנע לשנות שני מבנים. בכיוונון שתואר כאן, השינוי התרופות המקומי של יישוב מבנים (למשל, גירוי ספציפי של הגרעינים הפארא-סימפתטי) ניתן יהיה ללמוד. מלבד השינויים יישוב, זלוף גלובלית עם תרופות שונות (למשל, חוסמי בטא) אפשרי בקלות, כך שניתן יהיה לחקור את המאפיינים proarrhythmic או תרופות פוטנציאליות של סוכנים שונים. באמצעות תוכנית התקנה זו, התערבויות וטכניקות שונות יכול להיבדק במהלך גירוי או עיכוב של חלקים שונים של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac, חשיפת מידע ההשפעה של חלקים מסוימים של מערכת העצבים האוטונומית על תפקוד הלב, arrhythmogenesis. עוד יותר, הגדרת מאתר מאפשר לימוד של מערכת העצבים האוטונומית הלב במצבים של מחלות כמו אוטם שריר הלב, אי ספיקת לב או סוכרת.

לסיכום, ידוע ופשוט Langendorff ex-vivo הלב זלוף המערכת מספקת בסיס גמיש כדי לשנות וללמוד את ההשפעה של נוירונים intracardiac על הלב אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצה להודות Hartwig Wieboldt שלו סיוע טכני מעולה, דוק מיקרוסקופ הדמיה המתקן (Umif) של אוניברסיטת רפואי במרכז המבורג-גלאים עבור מיקרוסקופים ותמיכה. מחקר זה היה לפי ממומן Förderverein des Universitären Herzzentrums המבורג e.V. ועל ידי את DZHK (גרמנית מרכז למחקר קרדיו) [FKZ 81Z4710141].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014 Modified Krebs-Henleit solution
Sodium hydrogencarbonate Sigma-Aldrich 401676 Modified Krebs-Henleit solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 Modified Krebs-Henleit solution
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 Modified Krebs-Henleit solution
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M1880 Modified Krebs-Henleit solution
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 Modified Krebs-Henleit solution
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Modified Krebs-Henleit solution
Sodium pyruvate bioXtra Sigma-Aldrich P8574 Modified Krebs-Henleit solution
Carbogen (95% O2 / 5% CO2) SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany Modified Krebs-Henleit solution
Sterile filter steritop-GP 0.22 EMD Millipore SCGPT05RE Modified Krebs-Henleit solution
Atropine sulfate Sigma-Aldrich A0257 Neuromodulation
Hexamethonium chloride Sigma-Aldrich H2138 Neuromodulation
Nicotine free base 98-100% Sigma-Aldrich N3876 Neuromodulation
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128 Whole mount staining
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich 252859 Whole mount staining
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Whole mount staining
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O Merck, KGA, Darmstadt, Germany H1009 Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide Merck, KGA, Darmstadt, Germany D8418 Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets Gibco / Invitrogen 18912-014 Whole mount staining
Triton-x-100 Sigma-Aldrich T8787 Whole mount staining
Albumin bovine fraction V Biomol, Hamburg, Germany 11924.03 Whole mount staining
Chicken anti neurofilament EMD Millipore AB5539 Whole mount staining
Rabbit anti tyrosine hydroxylase EMD Millipore AB152 Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase EMD Millipore AP144P Whole mount staining
Donkey α rabbit IgG Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A21206 Whole mount staining
Donkey α goat IgG Alexa 568 Thermo Fisher Scientific A11057 Whole mount staining
Donkey α chicken IgY Alexa 647 Merck, KGA, Darmstadt, Germany AP194SA6 Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α rabbit igG R&D Systems AP182B Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α goat igG R&D Systems AP192P Whole mount staining
Biotin-conjugated goat α chicken igY R&D Systems BAD010 Whole mount staining
Vectashield mounting medium Vector laboratories, Burlingame, CA, USA H-1000 Immunohistochemistry
Vectastain ABC kit Vector laboratories, Burlingame, CA, USA PK-4000 Immunohistochemistry
Steady DAB/Plus Abcam plc, Cambridge, UK ab103723 Whole mount staining
HistoClear DiaTec, Bamberg, Germany HS2002 Immunohistochemistry
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA B2261 Immunohistochemistry
Vectashield HardSet mounting medium Vector laboratories, Burlingame, CA, USA VEC-H-1400 Immunohistochemistry
Perfusion system HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany  73-4343 Langendorff apparatus
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand PL3508 PowerLab 8/35 Langendorff setup
Octapolar catheter CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA custom Langendorff setup
Stimulus generator STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany STG4002-160µA Stimulation setup
Stimulation software Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany MC_Stimulus II Stimulation setup
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany USB-ME128-System MEA setup
Multi-electrode array MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany EcoFlexMEA36 MEA setup
Multi-electrode array recording software Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany MC_Rack MEA setup
Spring scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 15003-08 Heart Preparation
Strabismus Scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14575-09 Heart Preparation
Mayo Scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14110-15 Heart Preparation
Dumont SS Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11203-25 Heart Preparation
London Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11080-02 Heart Preparation
Narrow Pattern Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11003-13 Heart Preparation
Plastic Wrap Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States Consumable Materials
Stereomicroscope Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany FRET
LED CoolLED, Andover, UK pE-100 FRET
DualView Photometrics, Tucson, AZ, USA DV2-SYS FRET
DualView filter set Photometrics, Tucson, AZ, USA 05-EM FRET
optiMOS scientific CMOS camera Qimaging, Surrey, BC, Canada 01-OPTIMOS-R-M-16-C FRET
Imaging software   Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA FRET
Analysis Software Image J software; Public Domain, NIH, USA FRET

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
  2. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  3. Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41 (6), 597-603 (2000).
  4. Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (3), 171-181 (2004).
  5. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
  6. Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
  7. Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114 (14), 1497-1503 (2006).
  8. Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114 (10), 1601-1610 (2014).
  9. Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88 (88), 51671 (2014).
  10. Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7 (11), e49203 (2012).
  11. Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13 (3), 207-216 (2003).
  12. Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139 (2), 213-248 (2013).
  13. Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76 (2), 257-268 (2007).
  14. Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16 (4), 470-474 (2010).
  15. Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
  16. Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7 (8), e1000172 (2009).
  17. Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
  18. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
  19. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
  20. Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
  21. Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).
  22. Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. , (2017).
  23. Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3 (3), e12328 (2015).

Tags

רפואה גיליון 135 מערכת העצבים האוטונומית טכיקרדיה חדרית הגרעינים האוטונומית מערכת העצבים intracardiac אבלציה מוות לבבי פתאומי
ההשפעה של נוירונים Intracardiac על הלב אלקטרופיזיולוגיה, Arrhythmogenesis במערכת Langendorff <em>Vivo לשעבר</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jungen, C., Scherschel, K., Bork, N. … More

Jungen, C., Scherschel, K., Bork, N. I., Kuklik, P., Eickholt, C., Kniep, H., Klatt, N., Willems, S., Nikolaev, V. O., Meyer, C. Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System. J. Vis. Exp. (135), e57617, doi:10.3791/57617 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter