Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

心臓電気生理学、不整脈原性Ex Vivo蛍光システムで心臓内のニューロンの影響

doi: 10.3791/57617 Published: May 22, 2018

Summary

ここでは、心臓内の自律神経系の変調とその基本的な電気生理学、不整脈原性、および前のヴィヴォ蛍光セットアップを使用してキャンプのダイナミクスに及ぼす影響の評価のためのプロトコルを提案する.

Abstract

遅く 19 世紀の発明、以来心臓灌流システム前のヴィヴォ蛍光が生理学的、生化学的、形態学的、および薬理学的パラメーターの広範なスペクトルを勉強に関連するツールであり続けます集中的に除神経心。ここでは、心腔内の自律神経系の変調とその基本的な電気生理学、不整脈原性、および環状アデノシン一リン酸 (cAMP) の動態に及ぼす影響の評価のためのセットアップをについて説明します。心臓内の自律神経系はどのマウス大脳基底核が主にあるパッドの心房の脂肪の機械的解離によって調節 — またはターゲットと同様、世界的な薬理学的介入法を用いた。右心房、右心室 octapolar 電気生理学的カテーテルが導入され、高解像度マッピングの心外膜に配置された多電極アレイ (MEA) が心臓電気生理・不整脈原性を決定するために使用されます。蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) をイメージング心臓各地のキャンプ レベルのリアルタイム監視が実行されます。Neuromorphology は全体心を同定と実行の研究で心臓自律神経系の特定のターゲットの変調をガイドする神経細胞のマーカーを使用して抗体を用いた染色を用いて検討しました。前のヴィヴォ蛍光セットアップは短時間で再現性のある実験の数が多いためことができます。セットアップの部分的オープンな性質にもかかわらず、(e.g。、MEA 測定中に) 一定の温度コントロールが難しく、最小限に抑える必要があります。この説明法分析し、分散心の心臓自律神経系を調節することが可能になります。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

心臓灌流システム前のヴィヴォ蛍光が生理学的、生化学的、形態学的、広範囲の実行に関連するツールであり続けます、薬理学的研究に集中的に横隔膜心1,2 ,3,4,5後半の 19th世紀6の発明以来。様々 なトピックの日には、このシステムはまだ広く使用されます (e.g。、虚血再灌流) または勉強する心の薬理学的効果を78、と心血管研究に基本的なツールであります。このメソッドの寿命に起因するいくつかの利点 (e.g。、中枢神経系または他の臓器、全身の循環やホルモンの影響を受けずに測定が実行されます)。必要な場合、医薬品を制御された方法で灌流バッファーに追加または特定の構造を直接適用できます。、再現可能な実験と実験数が比較的多いが短時間で実行できます。セットアップの部分は () のオープンな性質は、体温調節困難とを考慮する必要があることができます。小さい動物を主に使用する実験装置はより複雑より生物学的変動と蛍光システムはより大きい種9で使用されても、(例えば。、トランスジェニック マウス モデル) 使用することができます。

このプロトコルの実験のセットアップ、環状アデノシン一リン酸 (cAMP) ダイナミクス、心外膜伝導心室不整脈原性基本的な電気生理学的パラメーターに及ぼす心臓自律神経系は、します。評価されます。心房の脂肪パッドの中心に位置する、中央の神経支配から独立した心臓電気生理学を制御する知られている今、心臓内の節の数が多い、そのまままたは慎重な機械と手動で削除された左郭清。自律神経系の薬理学的変調は、グローバルに医薬品を灌流バッファーに追加することによって、または心房基底核のターゲット変調によるローカルに実行されます。実験の後、心は、免疫組織学的評価に適してすべての血液細胞は、染色の品質を高めることができる持続灌流により削除されています。

記載された方法の全体的な目標は、心臓電気生理学、不整脈原性マウスの心臓の自律神経系の影響についての詳細な研究の新しい視点を提供することです。このテクニックを使用する理由は研究し、自律神経系中枢神経系の影響を与えずに変更することが可能です。主要な利点の 1 つは潜在的なプロまたは不整脈プロパティの古いの薬理学的実験の簡単な雇用、新しいエージェントをテストすることができます。さらに、さまざまな心臓病のトランスジェニック、ノックアウト マウス モデルは代謝性疾患や心不全、不整脈の基になるメカニズムを調査承ります。このアプローチは、心房レベルで自律神経が心室の心臓電気生理・不整脈の誘発に影響する可能性がどのように理解を高めた。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

動物を含むすべてのプロシージャは、ハンブルク州立、ハンブルク大学のアニマル ・ ケアおよび使用委員会の地方自治体によって承認されました。

1. 蛍光装置の準備

注: 市販蛍光灌流システムが使用されます。

  1. 変更された促進ソリューション (119 mM 塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム一塩基、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、グルコース、8.3 mM とナトリウムの 2 mM の 2.5 mM から 1.1 mM の 1.2 mM の 4.6 mM の 25 mM の準備します。ピルビン酸)。カルシウム沈殿物を防ぐために灌流液に 95 %oxygen/5% 二酸化炭素の混合物を追加します。0.22 μ m の細孔径を持つバッファーをフィルター処理します。
  2. 心臓電気生理学、不整脈原性に応じてへの影響を調査するバッファーに薬理学的エージェントを追加します。
  3. 風呂の水を開始し、95 %oxygen/5% 二酸化炭素の混合物を含む灌流液を配置します。カニューレの前に直接灌流液温度は ~ 37 ° C、風呂の水の温度を調整します。
  4. ローラー ポンプを起動し、適切な温度に達するとすぐに、灌流液で装置を入力します。
  5. 装置にマウントする際の空気の泡がカニューレに残っていないように、中心部を接続する前にポンプの速度を調整します。

2. ハード ・ ソフトウェア等

  1. 灌流圧、流量、および心拍数の連続記録の蛍光装置にデジタル データ集録システムとその対応するソフトウェアを接続します。
    1. 80 mmHg に一般的な設定でターゲットを絞った灌流圧を設定します。
    2. 録音を開始します。
  2. 指定されたデジタル刺激発生器と白金電極、電極表面は 0.5 × 0.5 mm、0.5 mm の電極間隔とデータ記録そして刺激のための電気生理カテーテル (材料表) を使用します。
    1. 装置装着後、心臓の位置の地域の近くにカテーテルを配置します。
    2. カテーテルから 2 つの電極を選択することにより、刺激を準備し、100 ms のサイクルの長さを使用します。

3. 心の準備

  1. 風邪 (2 ~ 4 ° C) を追加灌流バッファー (10-20 mL と 40-50 mL で全体の料理が覆われているように) 氷の上に 2 シャーレ (直径 6 cm と 10 cm の) とカニューレおよび場所が付いている皿に直接次と顕微鏡下で。二重結びカニューレを準備します。
  2. 頚部転位後マヨはさみと狭いパターン鉗子を使用して胸郭を開くことによって心を急速に消費税します。ロンドン鉗子を用いた横隔膜上大静脈と大動脈をグリップし、斜視ハサミのすべての船舶や背骨近くの結合組織を切断することによって心肺ブロックを切除します。
  3. 冷たいバッファーでいっぱい (直径 6 cm) の最初の皿に心臓肺ブロックを転送、斜視はさみとロンドン鉗子を使用して心を損なうことがなく肺を慎重に取り外します。顕微鏡下で心を入れ、春はさみとデュモン SS 鉗子を用いた胸腺、食道と気管を注意深く取り外します。
  4. 春はさみを使用して、カテーテルの挿入のため右心房の上部に 1.5-2 mm の穴をカットします。肺動脈に穴を開けます。Supraaortic 枝の下で直接大動脈を切断し、結び目が簡単に付けることができるように、大動脈から組織を削除します。
  5. 心房の脂肪パッドを維持、atrially ganglionated プレキシ グラス、そのまま左のアトリウムの周りに位置するメジャーを含むまたは慎重な郭清によってそれらを完全に削除します。
  6. カニューレと料理に心を転送し、顕微鏡下に配置。大動脈カニューレを寄せるデュモン SS 鉗子で、大動脈周囲にしっかりと結び目を準備。大動脈弁と冠血管が自由残っているように、カニューレは大動脈に深すぎる配置されませんを確認します。
  7. 蛍光装置に迅速にカニューレを接続します。カニューレに気泡がないことを確認してください。
  8. 灌流圧を 80 mmHg、定圧灌流を許可に切り替えます。
  9. 感動や心を損なうことがなく、右心房と右心室にカテーテルを慎重に挿入し、カテーテルをテープでカニューレに添付します。
  10. 最初の 20 分平衡期間準備周期が 100 ms で刺激を開始します。
  11. 安定した温度を許可するように商工会議所を閉じます。

4 電気生理学的パラメーターと不整脈原性

  1. 2 回心房または心室ペーシング閾値で次の手順で説明するように、電気生理学的パラメーターを評価するカテーテルの遠位端または近位電極を介してプログラムされた刺激を適用します。
    1. 10 後最大戻り周期として洞結節回復時間を決定する固定金利 120 ms、100 ms、80 ms の S1S1 周期でペーシングの s。
    2. 最長 S1S1 サイクルの長さ (8 刺激としてウェンケバッハ ポイントを決定します。S1S1: 100 ms。2 ms の段階ごとの還元) 11 AV 結節伝導の損失と。最長の S1S2 として房室結節不応期を決定 (12 刺激;S1S1: 120 ms、110 ms、100 ms。1 つの短いと相まって 2 ms 段階ごとの S1S2 還元 extrastimulus) AV 結節伝導の損失と。
    3. 最長の S1S2 として心房と心室の不応期を決定 (12 刺激;S1S1: 120 ms、110 ms、100 ms。1 つの短いと相まって 2 ms 段階ごとの S1S2 還元 extrastimulus) 欠席心房または心室応答を10,11
  2. プログラム extrastimulation を実行 (S1S1: 120 ms、100 ms、80 ミリ秒、最大 3 の余分なビートに続く 60 20 ms と 2 ms の段階ごとの還元) またはバースト プロトコルをペーシング (5 S1S1 s: 50 10 ms 10 ms の段階ごとの還元と) エヴァにランベスそったluate 心室不整脈原性1011,12

5. 心外膜伝導測定

メモ: は、128 チャンネル、支援記録システムを使用して高解像度マッピングの 25 の kHz のサンプリング レートで単極心外膜東エレクトロ グラムを記録します。32 多電極アレイを使用 (MEA; 電極間距離: 300 μ m; 1.8 × 1.8 mm)。メモ データをバンドパス フィルター (50 Hz) をされた 12 ビットおよび 20 の信号範囲でデジタル化、mV。

  1. 中心の指定された領域に MEA を配置し、接地を心13,14,15の別の部分に追加します。
  2. MEA の近くに心外膜刺激カテーテルを置き、一定の刺激を開始します。
  3. 電極の良好な接触の確認後振幅信号の品質をチェックして録音を開始します。
  4. 波動伝播速度と伝導の方向に分散の決定のためのオフライン解析を使用します。

6. 蛍光共鳴エネルギー伝達 FRET ベースの環状アデノシン一リン酸 (cAMP) イメージング

注: フレット ベース計測向け CAG Epac1 キャンプ トランスジェニック マウス16から心を収穫します。

  1. 実体顕微鏡15,17周り自作イメージング システムを使用します。
  2. 心の前に実体顕微鏡を置き、視力を調整します。
  3. 励起光源をキャンプのセンサー [例えば、単一波長光発光ダイオードを使用して (440 nm)]。(シアン蛍光タンパク質/黄色蛍光タンパク質ペア、ダイクロイック ミラーを使用、565dcxr および D480/30 と D535/40 の発光フィルター) のビーム ・ スプリッターを使用してドナーとアクセプタのチャンネルに放射光を分割します。
  4. 商工会議所の周りのプラスチック製のラップを置くことにより安定した温度を確保します。
  5. 科学的な相補型金属-酸化物-半導体 (sCMOS) カメラを使用して撮影します。光源とカメラ画像キャプチャ画像マイクロ マネージャーなどソフトウェア オープン ソースで調整します。
  6. 、画像取得を開始するには、 Multi-D Acqをプッシュします。ボタンをクリックし、時間経過を設定イメージを身につけるすべての 10 s 蛍光信号 (約 100 ms) の強さに依存する適切な露光時間を持つ。
  7. 2 つのチャンネルに画像を分割、関心の領域を選択し、比トレースを監視する、以前記載されている、利用可能なオンラインのフレットし、フレット オンライン 2プラグイン17を使用します。
  8. 買収時心を灌流実験の性質によって、さまざまな物質を含む変更促進ソリューション。
  9. 実験の終わりには、電源取得停止ボタンを押して、画像のスタックを保存します。
  10. ドナーとアクセプタのチャンネルの 2 つの同一セクションに画像を分割することができますし、複数地域の利益のために解析を実行できる専用解析ソフトウェアを使用してオフライン フレット データを分析します。
    注: は、スプレンガーに必要な専用プラグイン (オフライン フレット) は17
    1. ソフトウェアを起動します。メニューのプラグインに行くことによって解析を開き、たがり、し、マイクロ マネージャー ファイルを開くをクリックします。
    2. CFP と YFP チャンネルの 2 つの同一の画像をコマ撮りを分割するためにオフラインのフレットプラグインを実行します。
    3. フリーハンド選択ツールを使用して、YFP 画像への関心の領域をマークします。マルチ測定ウィンドウに選択内容を追加する [追加] ボタンを押します。
    4. マルチ測定」ウィンドウで目的の地域を選択し、マルチフレームと地域ごとに平均グレー値を持つテーブルを取得するキーを押します。コピーして Excel シートにすべてのデータを貼り付けます。
    5. CFP 画像のスタックをクリックします。CFP スタックのステップ 6.10.4 のように同じ操作を実行し、同じ Excel シートに平均グレー値を貼り付けます。
  11. 受容体チャネル17にドナーの写り要因のオフラインの生データを修正します。
    1. B が写り要因を次の数式を使用します。
      比率 = (YFP - B x CFP)/CFP
    2. イメージングのみ CFP を表現する心、写り要因 B を調べ、YFP チャンネルでドナー蛍光の割合を測定 (B = YFP/CFP)。

7. Neuromorphology

注: は、そのままマウス心の全体マウント immunostainings を使用して心臓内の自律神経系を分析します。心臓神経節の大半は肺静脈の近くに心外膜脂肪組織にローカライズされているに注意してください。

  1. ニューロ フィラメント (一般的な神経構造; 鶏抗 NF-H、1:3, 000) の描写を異なる染色を使用 (チャット、副交感神経チロシンヒドロキシラーゼ (TH、交感神経の神経構造; ウサギ α 日, 1:1, 000)、およびコリン アセチルトランスフェラーゼ神経の構造;ヤギ α チャット、1:50)。
  2. 蛍光装置の灌流後、24 h のホルマリン 10 mL にマウス心を修正し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 4 ° C で保存します。
  3. デントの漂白剤で心を漂白剤 (4:1:1 メタノール: 過酸化水素のソリューション 30% (w/w) H2o: ジメチルスルホキシド (DMSO) で) 4 ° C で 1 週間と PBS でメタノールを降順一連の PBS にその後それらを水分補給 (100%、75%、50%、25%; 1 h)18
  4. 4 ° C で穏やかな攪拌と 24 ウェル プレート表示形式で次の孵化を実行します。
    1. 1% で心を permeabilize トリトン-X-100/PBS (PBS-T) 一晩ブロック バッファーにそれらをブロックする前に室温で 3 x 1 時間 [5% ウシ血清アルブミン (BSA)/PBS T + 0.2% アジ化ナトリウム]。
    2. 次のように、抗体を希釈: ヤギ α チャット (1:50)、ウサギ α TH (1:1, 000)、鶏 α ニューロ フィラメント (1:3, 000);蛍光分類のための二次抗体 (1: 500; または製造元の指示に従って)。発色性ラベリングのビオチン化二次抗体 (1: 200; または製造元の指示に従って)。
  5. 4 ° C で 1 週間のブロック バッファーで希釈した一次抗体の標本を孵化させなさい。
  6. 4 日間のブロック バッファーで二次抗体の孵化前に PBS T で 3 x 15 分間の心を洗います。
  7. PBS T で 3 x 15 分間の心を洗うと取付中室温で 3 h の蛍光汚損のために保存または製造元の指示に従ってアビジン-ビオチン複合体の検出キットを使用します。
  8. 事前製造元の指示に従って軽打を含むバッファーのビジュアル コントロールの下でそれらを開発する前に、1 h で 3, 3'-ジアミノベンジジン (軽打) の商業バッファーの心を孵化させなさい。
  9. 二重蒸留水に標本を保存します。
  10. パラフィン セクション、脱水およびパラフィンに心を埋め込みます。
    1. 4 μ m 厚いセクションをカットし、研究室のルーチンの手順に従ってそれらを deparaffinize します。抗原検索を実行する必要かどうか、どのように抗体の組み合わせによって異なりますので毎の個別セットアップを確立する必要があります。
    2. TBS で 3 x 5 分洗浄が続く 0.2% トリトン-X-100/トリス-緩衝生理食塩水 (TBS) で 10 分間のセクションを permeabilize します。
    3. 3% とそれらをブロック BSA/TBS 室温で 1 時間。
    4. 4 ° C でそれらを一晩インキュベート [一次抗体: ヤギ α チャット (1:50)、ウサギ α TH (1: 500) チキン α ニューロ フィラメント (1:1, 000)] または 1 %bsa ・ TBS 3 x 5 分で洗う間に TBS に室温 (蛍光標識二次抗体、1: 500) で 2 h。
    5. 二次抗体溶液を 1 μ g/mL bisbenzimide H33342 trihydrochloride を追加または異なる核染色法を使用します。
    6. 蛍光染色用メディアをマウント内のスライドをマウントします。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

2 多電極アレイ (Mea) を含む蛍光セットアップのイメージを図 1に示します。実験前に、心臓内のカテーテルを右心房・右心室の速く、容易な挿入を容易にして、平衡が開始できるまでに短い期間を確保するためカニューレの近くに位置します。商工会議所の下の部分を高め (図 1の矢印を参照) ので、商工会議所が完全に閉じられ、安定した温度を保証します。

図 2は、異なる代表的な心臓染色を示しています。図 2 aヘマトキシリンとエオシン (H & E) パラフィン切片の染色されます。模範的な拡大 (図 2 b)、1 つの心房神経節の免疫組織化学的染色以下多数の交感神経細胞 (緑, TH 陽性) と比較して主に副交感神経細胞 (赤、チャット正) を示します。どのように神経線維を示しています (図 2 e) の 2 つの画像のオーバーレイ、神経 (図 2、緑、ニューロ フィラメント) および交感神経線維 (図 2 D、赤、TH) の染色免疫組織化学的図 2-E後部脳室に向かって冠状洞経由心房から走査します。

図 3は、心臓は、右心房と右心室に挿入された octapolar カテーテル、蛍光装置のカニューレに接続されているし、前方左心室 (に置かれて心外膜の多電極アレイ (MEA) 痙攣を示します3 a を図)。心室性不整脈発生感受性テスト、RV の電極では、図 3 bに提示されます。部分的心房除神経後より頻繁に心の心室頻拍の誘発が発生しました。(図 3) の拡大の MEA 電極のスケマティック レイアウトが表示されます。すべての電極の安定した心外膜の接触を確保することが重要です。図 3 Dで MEA によって記録されたオフライン分析の心外膜伝導が描かれています。

図 4は、逆行性蛍光装置潅流されて全体の中心でフレット測定を示します。心のさまざまな分野に必要な (図 4 a) として分析できます。医薬品のグローバルとローカルの局所アプリケーションは、このセットアップ (図 4 b) で簡単に可能です。

Figure 1
図 1: 多電極アレイ (Mea) を含む蛍光セットアップします。Octapolar 刺激と記録カテーテルは中心部が添付されます地域の近くに配置されます。商工会議所の下の部分は上向きに移動されます (白い矢印) 後、心が安定した温度を確保できるように装置に接続されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 自律神経系の部分を描いた、心臓全体のマウント染色A)心臓 H & E 染色のパラフィンの描写のセクション (棒 1 mm スケール)。B) 1 法で免疫染色心房神経節の模範的な拡大を示して少ない多数の交感神経細胞 (グリーン, TH 陽性; スケール バー 75 μ m) と比較して主に副交感神経細胞 (赤、チャット陽性)。C E)神経 (図 2 緑、ニューロ フィラメント、NF) の代表の免疫組織化学的染色と交感神経線維 (図 2 D、赤、TH ・2 e のオーバーレイ) の方 (CS) 冠状洞経由心房からトラバース、後部脳室。模範的な繊維は、矢印で示されます。アスタリスクは、心房の神経節。スケール バーの 1 mm. ラ、左房;左心室、左心室;NF は、ニューロ フィラメント。太陽光発電、肺静脈;RA、右房;RAA は、右心耳;右心室、右心室。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Figure 3
図 3: 内および心外膜測定蛍光セットアップを使用しますA. このパネル蛍光システム内でマウス中心の例を示しています。右心房と心室と 1 つの心外膜多電極アレイ (MEA) に挿入される心内 octapolar カテーテルが描かれています。B. 不整脈感受性試験を用いたバースト (制御) することがなく刺激または自己終了 [部分的心房除神経 (PAD)] 後心室頻拍が描かれているの誘導と。C. 心外膜 MEA 電極のスケマティック レイアウトの拡大とともに描かれています。D. 波伝搬速度は、カスタムメイドのソフトウェアを使用して分析しました。市販の間の距離は 2 m/s.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 蛍光セットアップでフレット測定A.、differentcAMP バイオ センサー蛍光の 2 チャンネル [黄色い蛍光蛋白質 (YFP) シアンの蛍光蛋白質 (CFP)] 逆行灌流心におけるフレット測定中に描かれています。(例えば心房、心室) 心のさまざまな部分を分析できる必要な場合 (スケール バー: 1 mm)。B。 このパネルは、薬理学的刺激による心房と左心室の間にキャンプのレベルを測定する代表的なフレットの実験を示しています。最初に、心臓は全身アデニル酸シクラーゼ活性剤 NKH477、キャンプのレベルを高めるためのフォルスコリン類と灌流。ニコチンが局所的に適用、鋭く cAMP のレベルを減らす心房の節を対象とします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

別のマッピングと刺激テクニックによる心臓電気生理学、不整脈原性心内ニューロンの影響を研究するためのツールとして本稿では、よく知られている蛍光前のヴィヴォ心臓灌流システムを提案します。心内膜と心外膜アプローチを含みます。

プロトコルのいくつかの部分は、セットアップのために重要です。まず、心房の脂肪パッドはそのまま、または心筋を傷つけることがなく迅速に削除されます準備テクニックを使用することが重要です。第二に、適切なサイズの開口部は octapolar カテーテルを簡単に右心房と右心室に挿入のため右心房にカットされます。カテーテルは右心室に任意の圧力を生成することがなく簡単にスリップする必要があります。カニューレ、カテーテルの添付ファイルの中にカテーテルに浸しれない深い心室、心臓の損傷を避けるために。第三に、温度制御はすべて蛍光設定1,2,5の重要な部分です。恒温槽はテスト、安定した温度を確保する不整脈休業となります。しかし、MEA やフレットの録音商工会議所測定を許可するように部分的に開いて、少なくともする必要があります。録音時間は最小限にするべきか、室の周り長い測定中にプラスチック製のラップを置くような温度損失を低減する他の技術を実行する必要があります。第四に、MEAs はすべての実験では同じ解剖学的位置に配置する必要があります。リアルタイム分析で大きな振幅によって確認されると、よい表面の接触は、相殺が作り出されるので反対側のサイトに 2 つの測定を使用して実現できます。第五に、フレット測定の動きによって影響を受けています。自発運動を減らすために、心臓は心臓内のカテーテルで安定した周波数でペースです。追加の安定化のため、わずかな真空チューブは頂点を安定化できます。

蛍光システムの利点の 1 つは心が心臓の神経系の免疫組織学的評価の後に使用できます。持続灌流は、蛍光19、染色の質の向上のレベルが高い、ほとんどの赤い血液細胞を削除します。ホルマリン固定後、リン酸緩衝生理食塩水染色質に顕著な変更することがなく 1 年までの温度制御 (4 ° C) の環境で心を格納できます。

このセットアップの最も重要な機能は、集中的に除神経心ですべての測定を実行します。主に副交感神経の心房の心内節は、交感神経節 stellatum は内局との準備中には削除されるためにハート20内最後の中継ぎ局。心臓内のニューロンは中央の入力を得る、ただしは、心臓交感神経の photoactivation 増加心拍数と心臓の収縮力21生理学的な方法でアクティブであることを示されています。集中的に除神経心で心臓内のニューロンの機能的重要性を支えるこれらの調査結果に沿って最近心機能と不整脈原性15への影響を示した。

この集中的に除神経セットアップの利点の 1 つは、別の心内地域ニューラル ネットワーク (例えば心房と心室の間の相互作用)15間のコミュニケーションを研究する研究員できます。これらの違いは、選択的な洞結節変調器セルヴィエによる治療が生存率、β 遮断薬メトプロ ロール コハク酸22による治療に比べてを改善人心臓移植後患者に関連するかもしれない。将来のステップで副交感神経 (迷走神経) または交感神経構造 (Ggl。 stellatum23) の直接電気刺激は余分と心臓内の自律神経系の相互作用の知識を向上させるのに役立ちます。

その副交感神経を留意することが重要だし、交感神経線維は、主共局在ように心房または心室性不整脈のカテーテルアブレーションのような現在の治療法は必然的に両方の構造を変更しません。ここで説明されているセットアップの対象となる構造物 (例えば、副交感神経節の特定の刺激) のローカル医薬品変更を学ぶことができます。対象となる変更のほか異なる医薬品 (例えば、 β 遮断薬) とグローバルの灌流は、様々 なエージェントのプロパティを潜在的な proarrhythmic または不整脈を学ぶことができますので、簡単に可能です。この設定を使用すると、介入とさまざまなテクニック テストできます刺激または抑制の自律神経系の特定の部分の影響の情報を明らかに、心臓内の自律神経系のさまざまな部分の中に心機能と不整脈原性。さらに、マウスのセットアップは、心筋梗塞、心不全や糖尿病のような病気の状態の心臓自律神経系を勉強できます。

結論としては、シンプルでよく知られている蛍光前のヴィヴォ心臓灌流システム変更および心臓電気生理学、不整脈原性心内ニューロンの影響を研究する柔軟な基盤を提供します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は、彼の優秀な技術支援とウケ顕微鏡イメージング施設 (Umif) の大学エッペンドルフ メディカル センター ハンブルク顕微鏡およびサポートを提供するためのハートウィグ目下を感謝したいです。本研究では資金によって Förderverein デ Universitären Herzzentrums ハンブルク e. v.、DZHK (ドイツ語心血管研究センター) [FKZ 81Z4710141]。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014 Modified Krebs-Henleit solution
Sodium hydrogencarbonate Sigma-Aldrich 401676 Modified Krebs-Henleit solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 Modified Krebs-Henleit solution
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 Modified Krebs-Henleit solution
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M1880 Modified Krebs-Henleit solution
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 Modified Krebs-Henleit solution
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Modified Krebs-Henleit solution
Sodium pyruvate bioXtra Sigma-Aldrich P8574 Modified Krebs-Henleit solution
Carbogen (95% O2 / 5% CO2) SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany Modified Krebs-Henleit solution
Sterile filter steritop-GP 0.22 EMD Millipore SCGPT05RE Modified Krebs-Henleit solution
Atropine sulfate Sigma-Aldrich A0257 Neuromodulation
Hexamethonium chloride Sigma-Aldrich H2138 Neuromodulation
Nicotine free base 98-100% Sigma-Aldrich N3876 Neuromodulation
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128 Whole mount staining
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich 252859 Whole mount staining
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Whole mount staining
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O Merck, KGA, Darmstadt, Germany H1009 Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide Merck, KGA, Darmstadt, Germany D8418 Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets Gibco / Invitrogen 18912-014 Whole mount staining
Triton-x-100 Sigma-Aldrich T8787 Whole mount staining
Albumin bovine fraction V Biomol, Hamburg, Germany 11924.03 Whole mount staining
Chicken anti neurofilament EMD Millipore AB5539 Whole mount staining
Rabbit anti tyrosine hydroxylase EMD Millipore AB152 Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase EMD Millipore AP144P Whole mount staining
Donkey α rabbit IgG Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A21206 Whole mount staining
Donkey α goat IgG Alexa 568 Thermo Fisher Scientific A11057 Whole mount staining
Donkey α chicken IgY Alexa 647 Merck, KGA, Darmstadt, Germany AP194SA6 Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α rabbit igG R&D Systems AP182B Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α goat igG R&D Systems AP192P Whole mount staining
Biotin-conjugated goat α chicken igY R&D Systems BAD010 Whole mount staining
Vectashield mounting medium Vector laboratories, Burlingame, CA, USA H-1000 Immunohistochemistry
Vectastain ABC kit Vector laboratories, Burlingame, CA, USA PK-4000 Immunohistochemistry
Steady DAB/Plus Abcam plc, Cambridge, UK ab103723 Whole mount staining
HistoClear DiaTec, Bamberg, Germany HS2002 Immunohistochemistry
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA B2261 Immunohistochemistry
Vectashield HardSet mounting medium Vector laboratories, Burlingame, CA, USA VEC-H-1400 Immunohistochemistry
Perfusion system HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany  73-4343 Langendorff apparatus
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand PL3508 PowerLab 8/35 Langendorff setup
Octapolar catheter CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA custom Langendorff setup
Stimulus generator STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany STG4002-160µA Stimulation setup
Stimulation software Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany MC_Stimulus II Stimulation setup
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany USB-ME128-System MEA setup
Multi-electrode array MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany EcoFlexMEA36 MEA setup
Multi-electrode array recording software Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany MC_Rack MEA setup
Spring scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 15003-08 Heart Preparation
Strabismus Scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14575-09 Heart Preparation
Mayo Scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14110-15 Heart Preparation
Dumont SS Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11203-25 Heart Preparation
London Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11080-02 Heart Preparation
Narrow Pattern Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11003-13 Heart Preparation
Plastic Wrap Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States Consumable Materials
Stereomicroscope Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany FRET
LED CoolLED, Andover, UK pE-100 FRET
DualView Photometrics, Tucson, AZ, USA DV2-SYS FRET
DualView filter set Photometrics, Tucson, AZ, USA 05-EM FRET
optiMOS scientific CMOS camera Qimaging, Surrey, BC, Canada 01-OPTIMOS-R-M-16-C FRET
Imaging software   Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA FRET
Analysis Software Image J software; Public Domain, NIH, USA FRET

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, (6), 940-950 (2011).
  2. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41, (6), 613-627 (2000).
  3. Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41, (6), 597-603 (2000).
  4. Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49, (3), 171-181 (2004).
  5. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55, (2), 113-126 (2007).
  6. Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
  7. Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114, (14), 1497-1503 (2006).
  8. Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114, (10), 1601-1610 (2014).
  9. Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88, (88), 51671 (2014).
  10. Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7, (11), e49203 (2012).
  11. Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13, (3), 207-216 (2003).
  12. Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139, (2), 213-248 (2013).
  13. Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76, (2), 257-268 (2007).
  14. Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16, (4), 470-474 (2010).
  15. Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
  16. Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7, (8), e1000172 (2009).
  17. Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
  18. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4, (1), 31-33 (2007).
  19. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
  20. Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116, (12), 2005-2019 (2015).
  21. Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105, (2), 143-150 (2015).
  22. Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. (2017).
  23. Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3, (3), e12328 (2015).
心臓電気生理学、不整脈原性<em>Ex Vivo</em>蛍光システムで心臓内のニューロンの影響
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jungen, C., Scherschel, K., Bork, N. I., Kuklik, P., Eickholt, C., Kniep, H., Klatt, N., Willems, S., Nikolaev, V. O., Meyer, C. Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System. J. Vis. Exp. (135), e57617, doi:10.3791/57617 (2018).More

Jungen, C., Scherschel, K., Bork, N. I., Kuklik, P., Eickholt, C., Kniep, H., Klatt, N., Willems, S., Nikolaev, V. O., Meyer, C. Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System. J. Vis. Exp. (135), e57617, doi:10.3791/57617 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter