Summary
여기, 선물이 intracardiac 자율 신경의 변조 및 기본 전기 생리학, arrhythmogenesis, 및 비보 전 Langendorff 설치를 사용 하 여 캠프 역학에 미치는 영향의 평가 대 한 프로토콜.
Abstract
늦게 19 세기에서 그것의 발명품부터 심장 관류 시스템 ex vivo Langendorff 계속 광범위 한 생리, 생화학, 형태학, 및 약리학 매개 변수에서 공부 관련 도구 중앙에서 denervated 마음입니다. 여기, intracardiac 자율 신경의 변조 및 기본 전기 생리학, arrhythmogenesis, 및 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 역학에 미치는 영향의 평가 대 한 설정을 설명합니다. Intracardiac 자율 신 경계는 murine 중추는 주로 심 방 지방 패드에 기계 해 부에 의해 변조-또는 대상 뿐 아니라 글로벌 약리학 내정간섭의 사용에 의해. Octapolar electrophysiological 테 오른쪽 아 트리 움과 우 심 실에 도입 되 고 배치 epicardial 다중 전극 배열 (MEA) 고해상도 매핑에 대 한 심장 전기 생리학 및 arrhythmogenesis 결정 하 사용 됩니다. 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워) 이미징 여러 심장 지역에 캠프 레벨의 실시간 모니터링에 대 한 수행 됩니다. Neuromorphology 항 체 기반 신경 마커를 사용 하 여 식별 및 수행 연구에서 intracardiac 자율 신경 시스템의 특정 대상의 변조를 이끌어 온 마음의 얼룩에 의해 공부 된다. Ex vivo Langendorff 설치 짧은 시간에 재현 실험의 높은 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 설치의 부분적으로 열려 자연 (예., MEA 측정 동안) 일정 한 온도 제어를 어렵게 하 고 최소한으로 유지 되어야 한다. 이 설명된 방법을 분석 하 고 분산 된 마음에 intracardiac 자율 신 경계를 조절 가능 하 게.
Introduction
심장 관류 시스템 ex vivo Langendorff 계속 광범위 한 생리, 생화학, 형태학, 수행 하기 위한 관련 도구 및 약리 연구에 중앙 마음1,2 denervated ,3,,45 후반 19번째 세기6에 그것의 발명품부터. 날짜 하려면,이 시스템은 다양 한 주제에 대 한 아직도 널리 이용 된다 (예., 국 소 빈 혈 reperfusion) 또는 연구 심장 약리 효과7,8, 그리고 심장 혈관 연구에 기본적인 도구입니다. 이 방법의 장 수 결과 여러 가지 이점에서 (예., 중앙 신경 조직 또는 다른 장기, 조직의 순환, 또는 순환 호르몬의 영향 없이 측정 수행 됩니다). 필요한 경우, 제약 관류 버퍼를 제어 방식으로 추가 하거나 특정 구조를 직접 적용할 수 있습니다. 실험은 재현성, 그리고 실험의 상대적으로 높은 숫자를 시간의 짧은 기간에 수행할 수 있습니다. 설치의 (부분적으로) 오픈 자연 온도 조절 어려운 고려 될 필요가 만들 수 있습니다. 실험적인 체제는 덜 복잡 하 고 큰 생물 다양성에 작은 동물 주로 사용 Langendorff 시스템은 또한 더 큰 종9에서 사용 되, (예., 유전자 변형 마우스 모델) 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜의 실험 설정에서 기본 electrophysiological 매개 변수, 심 실 arrhythmogenesis, epicardial 유도 그리고 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 역학에 intracardiac 자율 신경의 영향이입니다. 평가. 주로 심 방 지방 패드에 있습니다 그리고 지금 심장 전기 생리학 중앙 신경 제어에서 독립을 제어 하는 잘 알려진, intracardiac 중추의 많은 수는 그대로 또는 주의 기계와 수동으로 제거 왼쪽 해 부입니다. 자율 신경 약리학 변조는 세계적으로 관류 버퍼에 제약을 추가 하거나 로컬 심 중추의 타겟된 변조에 의해 수행 됩니다. 모든 혈액 세포 얼룩의 품질을 증가 시킬 수 있는 지속적인 관류로 인해 제거 된 대로, 실험 후 마음 잘 immunohistological 평가 적합 하다.
설명 기술의 전반적인 목표 심장 전기 생리학 및 마우스 마음에 arrhythmogenesis 자율 신 경계에 미치는 영향에 관한 자세한 연구에 대 한 새로운 관점을 제공 하는 것입니다. 이 기술을 사용 하 여 이유를 공부 하 고 자율 신 경계는 중추의 영향을 주지 않고 변경할 수 있다는. 주요 장점 중 하나는 오래 된 잠재적인 프로-또는 antiarrhythmic 속성에서 약리 실험의 쉬운 고용 하 고 새로운 에이전트를 테스트할 수 있습니다. 또한, 다양 한 심장 질환의 유전자 변형 및 녹아웃 마우스 모델 조사 부정맥, 심장 마비, 또는 대사 질환을 기본 메커니즘을 사용할 수 있습니다. 이 접근은 어떻게 심 방 수준에 자율 신 경계 심 실 심장 전기 생리학 및 부정맥의 유도 영향 수 있다의 우리의 이해를 강화 했다.
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Protocol
동물 관련 된 모든 절차는 함부르크의 상태, 함부르크의 대학 동물 보호와 사용 위원회의 지방 자치 단체에 의해 승인 되었다.
1입니다. Langendorff 기구 준비
참고: 상용 Langendorff 관류 시스템 사용 됩니다.
- 수정된 Krebs Henseleit 솔루션 (119 m m 염화 나트륨, 중 탄산 나트륨, 염화 칼륨, 칼륨 인산 이수소, 황산 마그네슘, 염화 칼슘, 포도 당의 8.3 m m와 나트륨의 2 mM의 2.5 m m의 1.1 m m의 1.2 m m의 4.6 m m의 25 밀리미터의 준비 pyruvate)입니다. 칼슘 강 수를 방지 하기 위해 관류 솔루션에 95 %oxygen/5% 이산화탄소의 혼합물을 추가 합니다. 0.22 μ m의 기 공 크기와 버퍼 필터링.
- 심장 전기 생리학 및 필요에 따라 arrhythmogenesis에 미치는 영향을 조사 하기 위해 버퍼를 약리 에이전트를 추가 합니다.
- 물 목욕을 시작 하 고 그것에 95 %oxygen/5% 이산화탄소의 혼합물을 포함 한 관류 솔루션을 배치. 정 전에 직접 관류 솔루션 온도 37 ~ ˚C 물 목욕의 온도 조정 합니다.
- 롤러 펌프를 시작 하 고 정확한 온도 관류 솔루션 기구를 작성.
- 기구에 장착할 때 아무 기포는 정에 남아 있도록 마음을 연결 하기 전에 펌프 속도 조정 합니다.
2. 하드-및 소프트웨어 준비
- 관류 압력, 유량, 그리고 심장 박동의 연속 녹음 Langendorff 장치를 디지털 데이터 수집 시스템 및 해당 소프트웨어를 연결 합니다.
- 80 mmHg에 일반 설정에서 대상된 관류 압력을 설정 합니다.
- 녹음을 시작 합니다.
- 지정 된 디지털 자극 발생기와 데이터 기록 및 자극에 대 한 백 금 전극, 전극 표면의 0.5 x 0.5 m m와 0.5 m m의 전극 간격 전기 생리학 카 테 터 (자료 테이블) 사용 합니다.
- 심장 기구를 부착 후 배치 됩니다 지역 카 테 터를 놓습니다.
- 2 전극 카 테 터에서 선택 하 여 자극을 준비 하 고 100 밀리초의 주기 길이 사용 하 여.
3입니다. 마음의 준비
- 감기 (˚C ~ 2-4) 추가 관류 버퍼 (10-20 mL 및 40-50 mL, 그렇게 전체 요리 덮여 있다)는 2 접시 (6 cm, 10 cm의 직경) 및 정 및 장소 요리에 얼음 직접 다음 현미경. 주위에 정 두 번 매듭을 준비 합니다.
- 마요가 위와 집게를 좁은 패턴을 사용 하 여 가슴을 열어 심장 자 궁 경관 탈 구 후 빠르게 삭제할. 다음 대동맥 및 런던 집게를 사용 하 여 횡 경 막 위에 베 나 카바를 모든 선박 및 척추 주변 결합 조직 Strabismus가 위로 절단 하 여 심장-폐 블록을 삭제할.
- 얼음 처럼 차가운 버퍼 가득 첫 번째 접시 (6cm 직경)에 심장-폐 블록을 전송 하 고 신중 하 게 Strabismus가 위 및 런던 집게를 사용 하 여 마음을 손상 하지 않고 폐를 제거 합니다. 다음에 현미경 마음 놓고 봄이 위 및 Dumont SS 집게를 사용 하 여 thymus, 식도 및 기관지를 조심 스럽게 제거 합니다.
- 봄이 위를 사용 하 여 카 테 터의 삽입에 대 한 오른쪽 아 트리 움의 상단 부분에 1.5-2 m m의 구멍을 뚫고. 폐 동맥에 구멍을 절단. 그리고 supraaortic 지점 바로 아래 대동맥을 잘라 매듭 쉽게 장착할 수 있도록 대동맥에서 조직 제거.
- 심 방 지방 패드, 메이저를 포함 하 여 atrially ganglionated plexi, 그대로 왼쪽된 아 트리 움 주위 또는 완전히 주의 절 개 하 여 그들을 제거.
- 정으로 요리에 마음을 전송 하 고 현미경 두십시오. Dumont SS 집게와는 정에 대동맥을 당겨 하 고 대동맥 주위 단단히 준비 매듭. 그는 정에에서 배치 되지 않습니다 너무 깊이 대동맥 대동맥 밸브 및 관상 동맥 혈관 무료 남아 있도록 다는 것을 확인 하십시오.
- Langendorff 기구에는 정을 신속 하 게 연결 합니다. 아니 거품은 정에 남아 있는지 확인 합니다.
- 일정 한 압력 관류를 수 있도록 80 mmHg 관류 압력 스위치.
- 만 지 나 심장 손상 없이 오른쪽 아 트리 움과 우 심 실에 신중 하 게 카 테 터를 삽입 하 고 테이프와 정 맥에 카 테 터 연결.
- 초기 20 분 평형 동안 100 ms의 준비 주기 길이 자극을 시작 합니다.
- 수 있도록 안정적인 온도 챔버를 닫습니다.
4. electrophysiological 매개 변수 및 Arrhythmogenesis
- 두 번 심 방 또는 심 실 서 성 임계값에는 다음 단계에 설명 된 대로 electrophysiological 매개 변수를 평가 하는 카 테 테 르의 원심 또는 인접 전극을 통해 프로그램 된 자극을 적용 합니다.
- 10 후 반환 최대 사이클 길이 공동 노드 복구 시간 확인 120 ms, 100 ms, 및 80 ms의 S1S1 주기 길이에서 서 성 고정 속도의 s.
- 가장 긴 S1S1 주기 길이 (8 자극; Wenckebach 포인트를 확인 S1S1: 100 ms; 2 ms stepwise 감소) 11 AV 꾸벅꾸벅 졸 기 전도의 손실. 가장 긴 S1S2 것 꾸벅꾸벅 졸 기 내 화물 기간 결정 (12 자극; S1S1: 120 ms, 110 ms 및 100ms; 한 개의 짧은 2 ms stepwise S1S2 감소와 extrastimulus을 결합) AV 꾸벅꾸벅 졸 기 전도의 손실.
- 가장 긴 S1S2로 심 방 및 심 실 내 화물 기간 결정 (12 자극; S1S1: 120 ms, 110 ms 및 100ms; 한 개의 짧은 2 ms stepwise S1S2 감소와 extrastimulus을 결합) 결 석 심 방 또는 심 실 응답10,11.
- 수행 프로그램된 extrastimulation (S1S1: 120 ms, 100 ms, 및 뒤에 최대 3 여분의 비트; 80 ms 2 ms stepwise 감소 60-20 ms) 또는 버스트 프로토콜을 서 성 (5 S1S1에서 s: 10 ms stepwise 감소와 함께 50-10 ms) 램버스 규칙에 바를 맞춰 luate 심 실 arrhythmogenesis10,,1112.
5. epicardial 전도 측정
주: 고해상도 매핑을 위한 25 kHz의 샘플링 속도와 128 채널, 컴퓨터 기반 녹화 시스템을 사용 하 여 유 니 폴라 epicardial electrograms를 기록 합니다. 32 다중 전극 배열 사용 (MEA; 전극 간 거리: 300 µ m; 1.8 x 1.8 m m). 참고 데이터 대역 통과 필터링 (50 Hz) 되었고, 20의 신호 범위와 12 비트 디지털 mV.
- 심장의 지정 된 지역에는 MEA를 놓고 심장13,,1415의 다른 부분에는 접지를 추가 합니다.
- 가까이 MEA epicardial 자극 테 놓고 지속적인 자극을 시작 합니다.
- 신호 품질 및 진폭을 선택 하 여 전극의 좋은 접촉의 확인 후 녹음을 시작 합니다.
- 파 전파 속도 전도 방향으로 분산의 결정에 대 한 오프 라인 분석을 사용 합니다.
6. 포스터 공명 에너지 전송 무서 워-기반 순환 아데노신 Monophosphate (캠프) 영상
참고: 무서 워 기반 측정의 경우, 수확 CAG-Epac1-캠프 유전자 변형 마우스16에서 마음.
- Stereomicroscope15,17주위 자체 내장된 이미징 시스템을 사용 합니다.
- 심장 앞 stereomicroscope를 배치 하 고 시력에 대 한 조정.
- 광원으로 캠프 센서 자극 [예를 들어, 단일 파장 빛 발광 다이오드를 사용 (440 nm)]. 분할 사용 하 여 빔 스플리터 (청록색 형광 단백질/황색 형광 단백질 쌍, 사용 된 565dcxr dichroic 거울 D480/30 및 D535/40 방출 필터) 기증자 및 수락자 채널로 빛 방출.
- 실로 주위 플라스틱 랩 넣어 안정적인 온도 확인 합니다.
- 과학적인 보완 금속-산화물-반도체 (sCMOS) 카메라를 사용 하 여 이미지를 가져가 라. 광원 및 카메라 이미징 마이크로 매니저 같은 소프트웨어는 오픈 소스와 이미지 캡처를 조정.
- 이미지 수집을 시작 하려면 Multi-D 취득을 밀어. 버튼 및 설정 시간 경과, 이미지를 획득 하는 모든 10 s, 적절 한 노출 시간, (약 100 ms) 형광 신호 강도 따라 달라 집니다.
- 이전 설명 하 고 사용 가능한 온라인 초조해 하 고 무서 워 온라인 2 플러그인17 를 사용 하 여 두 개의 채널로 이미지를 분할 관심 영역을 선택 하 고 비율 추적 모니터링.
- 인수, 동안 수정 Krebs Henseleit 솔루션 실험의 특성에 따라 서로 다른 물질을 포함 하는 심장 perfuse.
- 실험의 끝에, 중지 버튼을 누르면 인수 떨어져 전환 하 고 이미지의 스택에 저장 합니다.
- 기증자 및 수락자 채널에 대 한 두 개의 동일한 부분으로 이미지를 분할 수와 관심의 여러 지역에서 무서 워 분석을 수행할 수 있는 전용된 분석 소프트웨어를 사용 하 여 오프 라인으로 무서 워 데이터를 분석 합니다.
Sprenger 외 에 제공 되는 참고: 필요 하다는 전용 플러그인 (오프 라인 무서 워) 17.- 소프트웨어를 시작 합니다. 플러그인 메뉴로 이동 하 여 분석을 열고 마이크로, 고 마이크로-관리자 파일 열기를 클릭 합니다.
- 시간 경과 CFP YFP 채널에 대 한 두 개의 동일한 이미지로 분할 하려면 오프 라인 초조해 플러그인을 실행 합니다.
- 자유형 선택 도구를 사용 하 여 YFP 이미지에 대 한 관심의 영역 표시를. 선택 다중 측정값 창에 추가 하려면 추가 단추를 누릅니다.
- 멀티 측정 창에 관심 영역을 선택 하 고 멀티 각 프레임 및 지역에 대 한 평균 회색 값과 표를 누릅니다. 복사 하 고 Excel 시트에 모든 데이터를 붙여 넣습니다.
- C f P 이미지 스택을클릭 하십시오. CFP 스택에 대 한 단계 6.10.4로 동일한 작업을 수행 하 고 동일한 Excel 시트에 평균 회색 값을 붙여 넣습니다.
- 수락자 채널17로 기증자의 피를 통해 요소에 대 한 원시 데이터를 오프 라인으로 수정 합니다.
- 다음 수식을 사용 합니다, 여기서 B는 출혈을 통해 요소입니다.
비율 = (YFP-B x CFP) / CFP - CFP만 표현 하는 마음을 이미징 하 여 화상 물림 재단을 통해 요소 B를 결정 하 고 YFP 채널에서 기증자 형광의 백분율을 측정 (B = YFP / c f P).
- 다음 수식을 사용 합니다, 여기서 B는 출혈을 통해 요소입니다.
7입니다. Neuromorphology
참고: 그대로 murine 마음의 전체-마운트 immunostainings를 사용 하 여 intracardiac 자율 신 경계 분석. 참고 대부분 intracardiac 중추의 폐 정 맥 가까이 epicardial 지방 조직에 지역화 됩니다.
- (일반 신경 구조, 치킨 안티-NF-H는, 1:3, 000), neurofilament의 묘사에 대 한 다른 stainings를 사용 하 여 티로신 hydroxylase (TH, 교감 신경 구조, 토끼 α 일, 1:1, 000), 그리고 콜린 acetyltransferase (채팅, 부 교감 신경 신경 구조; 염소 α 채팅, 1시 50분).
- Langendorff 장치에 재 관류 후 24 h에 대 한 포 르 말린 10 mL에 마우스 마음을 해결 하 고 인산 염 버퍼 (PBS) 염 4 ˚C에서에서 그들을 저장 합니다.
- 덴트의 표 백제에 마음을 표 백제 (4:1:1 메탄올: H2소개할 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 과산화 수소 솔루션 30% (w/w)) 4 ˚C에서 1 주에 대 한 일련의 하강 하는 PBS에 메탄올에 PBS에 그들을 이후에 rehydrate 하 고 (100%, 75%, 50%, 25%; 1 h) 18.
- 4 ˚C에서 부드러운 동요와 24-잘-플레이트 형식에서 다음 외피를 수행.
- 1%의 마음 permeabilize 트리톤-X-100/PBS (PBS-T) 하룻밤 블로킹 버퍼에서 그들을 차단 하기 전에 실내 온도에 3 x 1 h [5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) / PBS-T + 0.2% 나트륨 아 지 드].
- 다음과 같이 항 체 희석: 염소 α 채팅 (1:50), 토끼 α 일 (1:1, 000), 치킨 α neurofilament (1:3, 000); 형광 라벨에 대 한 2 차 항 체 (1: 500; 또는 제조업체의 지침에 따라); biotinylated 비 라벨에 대 한 2 차 항 체 (1: 200; 또는 제조업체의 지침에 따라).
- 4 ˚C에서 1 주에 대 한 블로킹 버퍼에 희석 하는 주 항 체에서 표본 품 어.
- 4 일에 대 한 블로킹 버퍼에 이차 항 체 부 화 하기 전에 PBS-T에서 3 x 15 분에 대 한 마음을 씻어.
- PBS-T에서 3 x 15 분에 대 한 마음을 씻어 실 온에서 3 h에 대 한 형광 염색에 대 한 설치 매체에 저장 하거나 avidin 비타민 b 복합체 복잡 한 탐지 키트 제조업체의 지침에 따라 사용 합니다.
- 전 시각적 제어 제조업체의 지침에 따라 소량 포함 된 버퍼에 그들을 개발 하기 전에 1 시간 3, diaminobenzidine (한 덩어리),-3'에 대 한 상업 버퍼에 대 한 마음을 품 어.
- 두 배 증류수에는 견본을 저장 합니다.
- 파라핀 섹션, 탈수 하 고 파라핀에 마음을 포함 합니다.
- 4 µ m 두꺼운 부분을 잘라내어 실험실의 일상적인 절차에 따르면 그들을 deparaffinize. 항 원 복구 여부와 어떻게 수행 해야 항 체 조합에 따라 이후 모든 개별 설정에 대 한 설립 될 필요가 있다.
- 3 x 5 분 세척 tbs.에 다음 0.2% 트리톤-X-100/트리 스-버퍼링 염 분 (TBS)에서 10 분 섹션 permeabilize
- 3%와 그들을 차단 실 온에서 1 h BSA/TBS.
- 밤새 4 ˚C에서 품 어 [주 항 체: 염소 α 채팅 (1:50), 토끼 α 일 (1: 500), 치킨 α neurofilament (1:1, 000)] 또는 실내 온도 (이차 항 체 형광 분류, 1: 500) 1 %BSA / 3 x 5 분으로 TBS TBS 사이 세척에 2 h.
- 이차 항 체 솔루션 bisbenzimide H33342 trihydrochloride의 1 µ g/mL를 추가 하거나 다른 핵 얼룩 방법을 사용 합니다.
- 형광 염색에 대 한 설치 매체에 슬라이드를 탑재 합니다.
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Representative Results
그림 1 2 다중 전극 배열 (MEAs)를 포함 하 여 Langendorff 설치의 이미지를 보여 줍니다. 실험 전에 intracardiac 테 정 오른쪽 아 트리 움/우 심 실에 신속 하 고 쉽게 삽입을 용이 하 게 하 고는 평형 수 있습니다 시작할 때까지 짧은 시간 기간에 되도록 가까이 배치 됩니다. 챔버의 아래쪽 수 수 고조 (참조 그림1에서 화살표) 챔버 완전히 폐쇄 하 고 안정적인 온도 보장.
그림 2 다른 대표적인 심장 stainings 묘사. 그림 2A 는 hematoxylin에 오신 (H & E) 파라핀 섹션의 얼룩 제공 됩니다. 모범적인 확대 (그림 2B)에 한 심 방 신경 절의 immunohistochemical 얼룩 적은 수많은 동정 세포 (녹색, 긍정적인 일)에 비해 우세한 부 교감 신경 세포 (레드, 채팅-양성)을 보여 줍니다. 그림 2C-E 에 얼마나 신경 섬유를 묘사는 immunohistochemical 얼룩 신경 (그림 2C, 녹색, neurofilament) 및 동 정적인 섬유 (그림 2D, 빨강, 일)의 두 개의 이미지 (그림 2E)의 오버레이 뿐만 아니라 심 방에서 후부 심 쪽으로 관상 공동 통해 횡 장.
그림 3 은 murine 심장 Langendorff 장치 오른쪽 아 트리 움과 우 심 실에 삽입 된 octapolar 카 테 테 르와의 정 맥에 연결 하 고 epicardial 다중 전극 배열 (MEA) 앞쪽 좌 심 실 ( 에 배치 그림 3A). 심 실 부정맥 민감성 RV에 전극을 통해 테스트 그림 3B에서 제공 됩니다. 마음에 심 실 심 박 급진의 유도 부분 atrial denervation 후에 더 자주 발생 했습니다. (그림 3C) 확대 MEA 전극의 도식 레이아웃 제공 됩니다. 그것은 모든 전극의 안정적인 epicardial 접촉 되도록 해야 합니다. 그림 3d에서는 MEA에 의해 기록 된 오프 라인 분석 epicardial 전도 그려져 있습니다.
그림 4 는 Langendorff 장치에 끼얹는다 retrogradely 되 고 전체 마음에 무서 워 측정을 보여준다. 심장의 다른 지역으로 필요한 (그림 4A) 분석할 수 있습니다. 의약품의 지역 뿐 아니라 글로벌 국 소 응용이이 설치 (그림 4B)에서 쉽게 가능 하다.
그림 1: Langendorff 설치 등 다중 전극 (MEAs). Octapolar 자극과 녹음 테 마음 것입니다 연결 되어 있는 지역에 배치 됩니다. 챔버의 하단 부분을 위쪽으로 이동 됩니다 (흰색 화살표) 안정적인 온도 보장 되도록 심장 장치에 연결 된 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 자율 신 경계 부분의 묘사 심장 전체 마운트 stainings. A) 심장 H & E 스테인드 파라핀의 묘사 섹션 (1 m m 바 스케일). B) 스테인드 심 방 신경 절의 한 immunohistochemically의 모범적인 확대 적은 수많은 동정 세포 (녹색, TH-긍정적인; 75 µ m 바 규모)에 비해 우세한 부 교감 신경 세포 (레드, 채팅-양성)을 보여 줍니다. C-E) 신경 (그림 2C, 녹색, neurofilament, NF)의 대표 immunohistochemical stainings 및 동 정적인 섬유 (2D 그림, 빨강, TH, 및 그들의 오버레이에 그림 2E)으로 관상 동맥 공동 (CS)를 통해는 atria에서 통과 사후 심입니다. 모범적인 섬유 화살촉으로 표시 됩니다. 별표는 심 방 중추를 나타냅니다. 스케일 바 1 m m. 라, 좌 심; 라스베가스, 좌 심 실; NF, neurofilament; PV, 폐 정 맥; RA, 오른쪽 아 트리 움; RAA, 오른쪽 심 방 부속 기; RV, 우 심 실입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 내부-및 epicardial 측정 Langendorff 설치를 사용 하 여. A.이 패널 murine 심장 Langendorff 시스템 내에서 예를 보여 줍니다. Intracardiac octapolar 카 테 터, 오른쪽 아 트리 움과 심, 그리고 하나의 epicardial 다중 전극 배열 (MEA)에 삽입 되는 묘사 된다. B. 부정맥 민감도 테스트를 사용 하 여 버스트 (통제) 없이 자극 또는 자체 종료 [부분 atrial denervation (패드)] 후 심 실 심 박 급진은 묘사의 유도. C. epicardial MEA 도식 전극 레이아웃의 확대와 함께 묘사 된다. D. 파 전파 속도 맞춤 소프트웨어를 사용 하 여 분석 했다. isochrones 사이의 거리가 2 m/s 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: Langendorff 설치에 무서 워 측정. A.는 2 개의 differentcAMP 바이오 센서 형광 채널 [노란 형광 성 단백질 (YFP)과 청록색 형광 성 단백질 (CFP)] 역행 perfused 마음에 무서 워 측정 하는 동안 표시 됩니다. 필요한 경우 (예를 들어, 심 방 및 심 실) 심 혼의 다른 부분을 분석할 수 있습니다 (눈금 막대: 1 m m). B.이 패널 심 방 및 좌 심 실에서 약리학 자극 동안 캠프 레벨을 측정 하는 대표적인 무서 워 실험을 보여줍니다. 첫째, 심장 adenylyl 있고 활성 제 NKH477, 캠프 수준을 높이려면 산림 analogon와 함께 끼얹는다 체계적으로 되었다. 다음 니코틴은 몸에 붙이기도 적용 하 고 대상으로 심하게 캠프 수준을 감소 심 중추. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 원고는 잘 알려진 Langendorff ex vivo 심장 관류 시스템 다른 매핑 및 자극 기법을 사용 하 여 심장 전기 생리학 및 arrhythmogenesis intracardiac 신경의 영향을 연구 하는 도구로 서 제시 endocardial 및 epicardial 접근을 포함 하 여.
프로토콜의 여러 부분에서 설치에 대 한 중요 한 있습니다. 첫째, 심 방 지방 패드 그대로 유지 또는 myocardium 부상 없이 신속 하 게 제거 됩니다 준비 기술을 사용 하 여 중요 하다. 둘째, 제대로 크기의 개방 오른쪽 아 트리 움과 우 심 실에 octapolar 카 테 터의 쉬운 삽입에 대 한 오른쪽 아 트리 움에 얽혀 있다. 카 테 터는 어떤 압력을 생성 하지 않고 우 심 실에 쉽게 슬립 해야 합니다. 정 맥 카 테 터의 첨부, 동안 테 해야 하지 딥 더 깊이 심장 부상을 피하기 위해 심 실에. 셋째, 온도 제어 모든 Langendorff 설정1,,25의 중요 한 부분 이다. 열 챔버 부정맥 테스트, 안정적인 온도 보장 하는 동안 폐쇄 됩니다. 하지만 MEA 또는 무서 워 녹음에 대 한 챔버 열어야 적어도 분할 측정을 허용 합니다. 녹음 시간 최소한으로 유지 되어야 한다 또는 더 긴 측정 중 챔버 주위 비닐 포장 같은 온도 손실을 줄이기 위해 다른 기법을 수행 해야 합니다. 넷째, MEAs 모든 실험에서 같은 해 부 위치에 배치 되어야 합니다. 실시간 분석에 큰 진폭에 의해 확인 된다, 좋은 표면 접촉 평형 력 생산을 반대 위치에 2 개의 MEAs를 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 다섯째, 무서 워 측정 운동에 의해 영향을 받습니다. 자연 스러운 움직임을 줄이기 위해, 마음은 안정적인 주파수에서 intracardiac 카 테 터에 의해 진행 됩니다. 추가적인 안정화에 대 한 약간의 진공 튜브 꼭대기를 안정 수 있습니다.
Langendorff 시스템의 장점 중 하나는 마음에 사용할 수 있습니다 이후 심장 신경 시스템의 immunohistological 평가입니다. 지속적인 관류 autofluorescence19, 얼룩의 품질 향상의 높은 수준의 대부분 적혈구를 제거 합니다. 포 르 말린 고정 후 인산 염 버퍼 염 분에 대 한 최대 품질 얼룩에 눈에 띄는 변화 없이 1 년에 온도 제어 (4 ˚C) 환경에 마음을 저장할 수 있습니다.
이 설정의 가장 중요 한 기능은 모든 측정 중앙 denervated 마음에 수행 됩니다. 주로 부 교감 신경 심 intracardiac 중추는 심장20 내 마지막 중계 교감 신경 절 stellatum 있는 intrathoracically 이며 따라서 준비 하는 동안 제거 됩니다. Intracardiac 신경 중앙 입력 하지만, 그것은 보였다 들은 생리 적 방법으로 여전히 활성 심장 교감 신경의 photoactivation 증가 심장 박동, 심장 수축 힘21. 중앙 denervated에 intracardiac 뉴런의 기능적 중요성을 지 원하는 이러한 결과 따라 우리는 최근 심 실 기능 및 arrhythmogenesis15에 그들의 영향을 증명 하고있다.
이 중앙에서 denervated 설치의 한 장점은 다른 intracardiac 지역 신경 네트워크 (예, 심 방 및 심 실 사이의 상호 작용)15사이의 통신을 연구 하는 연구원을 수 있다는. 이러한 차이에 선택적 공동 노드 변조기 ivabradine 치료 향상 생존, 차단제 metoprolol 호박22치료에 비해 심장 이식 후 환자에 대 한 관련 수 있습니다. 앞 단계에서 부 교감 (미주 신경) 또는 동 정적인 구조 (stellatum Ggl.23)의 직접 전기 자극 추가-그리고 intracardiac 자율 신 경계 사이 상호 작용의 우리의 지식을 개선 하기 위해 도움이 됩니다.
그 부 교감을 명심 하는 것이 중요 하다 고 공감 섬유는 주로 공동 화 된 심 방 또는 심 실 부정맥의 카 테 터 절제 같은 현재의 치료는 필연적으로 수정 두 구조. 여기 설명된 설정에서 타겟된 구조 (예를 들어, 부 교감 신경 중추의 특정 자극)의 로컬 제약 수정 공부 될 수 있다. 대상된 수정 외 다른 제약 (예를 들어, 베타 차단제)과 글로벌 관류는 쉽게 가능 하 고, 다양 한 에이전트의 잠재적인 proarrhythmic 또는 antiarrhythmic 속성은 공부 될 수 있다. 이 설정을 사용 하 여, 개입 및 다른 기술이 시험 될 수 있다 자극 또는 금지에 자율 신경 시스템의 특정 부분에의 영향의 정보를 공개 하는 intracardiac 자율 신경 시스템의 다른 부분 중 심장 기능 그리고 arrhythmogenesis입니다. 또한, murine 설치 심근 경색, 심장 마비 또는 당뇨병 같은 질병의 상태에서 심장 자율 신 경계를 공부 하 고 있습니다.
결론적으로, 간단 하 고 잘 알려진 Langendorff ex vivo 심장 관류 시스템 수정 하 고 심장 전기 생리학 및 arrhythmogenesis intracardiac 신경의 영향을 공부 유연한 기초를 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 그의 우수한 기술 지원 및 평판 현미경 이미징 시설 (Umif)의 대학 의료 센터 함부르크-Eppendorf 현미경 및 지원 제공 Hartwig Wieboldt 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는 투자 곁 Förderverein des Universitären Herzzentrums 함부르크 e.V. DZHK (심장 혈관 연구를 위한 독일 센터)에 의해 [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET |
References
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