Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Virkningen av Intracardiac Neurons Cardiac Electrophysiology og Arrhythmogenesis i en Ex Vivo Langendorff System

doi: 10.3791/57617 Published: May 22, 2018

Summary

Her presenterer vi en protokoll for modulering av intracardiac autonome nervesystemet og vurdering av dens innflytelse på grunnleggende elektrofysiologi, arrhythmogenesis og leiren dynamics ved hjelp av en ex vivo Langendorff oppsett.

Abstract

Siden sin oppfinnelse late 19th -tallet fortsetter Langendorff ex vivo hjertet perfusjon systemet å være et relevant verktøy for å studere et bredt spekter av fysiologiske, biokjemiske, morfologiske og farmakologiske parametere i sentralt denervated hjerter. Her beskriver vi et oppsett for modulering av intracardiac autonome nervesystemet og vurdering av dens innflytelse på grunnleggende elektrofysiologi, arrhythmogenesis og syklisk adenosin monofosfat (cAMP) dynamics. Intracardiac autonome nervesystemet modulert av mekanisk dissection atrial fett pads-i hvilke murine Ganglion ligger hovedsakelig- eller ved bruk av globale samt målrettet farmakologiske intervensjoner. En octapolar elektrofysiologiske kateter brukes på høyre atrium og høyre ventrikkel og epicardial plassert flere elektrode matriser (MEA) for høy oppløsning tilordning brukes til å fastsette cardiac electrophysiology og arrhythmogenesis. Han selvmord resonans energioverføring (bånd) imaging utføres for sanntids overvåking av leiren i enkelte regioner. Neuromorphology er studert ved hjelp av antistoff-basert flekker av hele hjerter med neuronal markører for å veilede identifikasjon og modulering av konkrete mål av intracardiac autonome nervesystemet i utført studiene. Ex vivo Langendorff oppsettet gir et høyt antall reproduserbar eksperimenter på kort tid. Likevel, den delvis åpne naturen oppsettet (f.eks., under MEA målinger) gjør konstant temperaturkontroll vanskelig og bør holdes til et minimum. Denne beskrevet metoden gjør det mulig å analysere og modulere intracardiac autonome nervesystemet i desentraliserte hjerter.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Langendorff ex vivo hjertet perfusjon systemet fortsetter å være et relevant verktøy for å utføre et bredt spekter av fysiologiske, morfologiske og biokjemiske og farmakologiske studier i sentralt denervated hjerter1,2 ,3,4,5 siden sin oppfinnelse i slutten 19th århundre6. Hittil dette systemet er fortsatt mye brukt for ulike emner (f.eks., iskemi reperfusion) eller å studere cardiac farmakologiske effekter7,8, og er et grunnleggende verktøy i hjerte forskning. Levetiden til denne metoden resultater fra flere fordeler (f.eks., mål utføres uten påvirkning av det sentrale nervesystemet eller andre organer, systemisk sirkulasjon eller sirkulerende hormoner). Eventuelt legemidler kan legges på en kontrollert måte til perfusjon bufferen eller brukes til spesifikke strukturer direkte. Eksperimenter er reproduserbare, og et relativt høyt antall eksperimenter kan utføres i en kort periode. (Delvis) åpne natur oppsettet kan gjøre temperaturregulering vanskelig og må tas i betraktning. Selv om Langendorff systemet brukes også i større arter9, mindre dyr blir hovedsakelig brukt som eksperimentelle oppsettet er mindre kompleks, og en større biologisk variasjon (f.eks., transgene mouse modeller) kan brukes.

I eksperimentelle oppsett av denne protokollen er påvirker det intracardiac autonome nervesystemet grunnleggende elektrofysiologiske parametere, ventrikulær arrhythmogenesis, epicardial ledning og syklisk adenosin monofosfat (cAMP) dynamics evaluert. Et stort antall intracardiac Ganglion, som er hovedsakelig lokalisert i atrial fett pads og er nå kjent å kontrollere cardiac elektrofysiologi uavhengig av sentral nevrale kontroll, er enten venstre intakt eller manuelt fjernet med forsiktig mekaniske disseksjon. En farmakologisk modulering av det autonome nervesystemet utføres enten globalt ved å legge til legemidler perfusjon bufferen eller lokalt målrettede modulering av atrial Ganglion. Etter eksperimentene er hjerter godt egnet for å bedømme immunohistological som alle blod celler har blitt fjernet på grunn av kontinuerlig perfusjon, som kan øke kvaliteten på flekker.

Det overordnede målet med beskrevet teknikker er å tilby nye perspektiver for detaljerte studier om effekten av det autonome nervesystemet cardiac electrophysiology og arrhythmogenesis i musen hjertet. En grunn til å bruke denne teknikken er at det er mulig å studere og endre det autonome nervesystemet uten virkningen av sentralnervesystemet. En stor fordel er lett sysselsetting farmakologiske eksperimenter, i hvilke potensielle pro- eller antiarrhythmic egenskaper av gamle og nye agenter kan testes. I tillegg er transgene og knockout musen modeller av ulike hjerte sykdommer tilgjengelig å undersøke mekanismene bak arytmi, hjertesvikt eller metabolske sykdommer. Denne tilnærmingen har forbedret vår forståelse av hvordan det autonome nervesystemet på atrial nivå kan påvirke ventrikkel cardiac electrophysiology og induksjon av arytmier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av lokale myndigheter i staten of Hamburg, Universitetet i Hamburg dyr omsorg og bruk komiteer.

1. forberedelse av Langendorff apparater

Merk: Et kommersielt tilgjengelig Langendorff perfusjon systemet brukes.

  1. Forberede en modifisert Krebs-Henseleit løsning (119 mM av natriumklorid, 25 mM av natrium bikarbonat, 4.6 mM av kalium klorid, 1,2 mM kalium fosfat monobasic, 1.1 mM magnesium sulfat, 2,5 av kalsium klorid, 8.3 mM av glukose og 2 mM av natrium pyruvate). Legg en blanding av 95% oxygen/5% karbondioksid perfusjon løsningen forhindre kalsium nedbør. Filtrere buffer med en porestørrelse på 0.22 µm.
  2. Legge til en farmakologisk agent bufferen undersøke dens virkning på hjerte electrophysiology og arrhythmogenesis etter behov.
  3. Start vannbad og plassere perfusjon løsning med en blanding av 95% oxygen/5% karbondioksid i den. Justere temperaturen på vannbad, slik at perfusjon løsning temperaturen rett før kanyle ~ 37 grader.
  4. Start Berg-pumpe og fylle apparatet med perfusjon løsningen når riktig temperatur er nådd.
  5. Justere pumpe monterer hjertet, slik at ingen luftbobler igjen i kanyle når montere den på apparatet.

2. hard - og programvare

  1. Koble en digital data oppkjøpet system og den tilsvarende programvaren til Langendorff apparater for en kontinuerlig opptak av perfusjon press, flyt og hjertefrekvens.
    1. Angi mål perfusjon trykket i de generelle innstillingene til 80 mmHg.
    2. Starte innspillingen.
  2. Bruke en elektrofysiologi kateter (Tabell for materiale) med platina elektroder, en elektrode overflate 0.5 x 0,5 mm og en elektrode avstanden mellom 0,5 mm for registrering av data og stimulering med en angitt digital stimulans generator.
    1. Plass kateter nær området der hjertet plasseres etter vedlegget på apparatet.
    2. Forberede stimulering ved å velge 2 elektroder fra kateter og bruke en syklus lengde på 100 ms.

3. forberedelse av hjertet

  1. Legge til kaldt (~ 2-4 grader) perfusjon buffer (10-20 mL og 40-50 mL, slik at hele parabolen er dekket) 2 Petri retter (diameter på 6 cm og 10 cm) og parabolen med kanyle og legg dem på is direkte neste og under mikroskopet. Forberede en dobbel knute rundt kanyle.
  2. Raskt avgiftsdirektoratet hjertet etter cervical forvridning ved å åpne thorax Mayo saks og smale mønster tang. Deretter grep den aorta og vena cava over membranen bruker London tang og avgiftsdirektoratet hjerte-lunge blokken ved å klippe alle fartøy og bindevev nær ryggraden med strabisme saksen.
  3. Overføre hjerte-lunge blokken til den første parabolen (6 cm diameter) fylt med iskald bufferen og fjern forsiktig lungene uten å skade hjertet med strabisme saks og London tang. Legg hjertet under mikroskopet og fjern forsiktig thymus, spiserøret og spor ved hjelp av våren saks og Dumont SS tang.
  4. Bruk vår saksen for å klippe et hull på 1,5-2 mm i den øvre delen av høyre atrium kateter innsetting. Skjære hull i lungearterien. Deretter kuttet aorta direkte under supraaortic grener og fjerne vev fra aortabuen, slik at knuten kan festes enkelt.
  5. Holde atrial fett pads, inkludert store atrially ligger ganglionated plexi, rundt venstre atrium intakt eller fjerne dem av forsiktig disseksjon.
  6. Overføre hjertet til parabolen med kanyle og plasser den under mikroskopet. Trekk aorta over kanyle med Dumont SS tang og knytte forberedt knute tett rundt aorta. Kontroller at kanyle ikke er plassert for dypt i aorta slik at aortic ventilen og av coronary fartøy er igjen gratis.
  7. Fest kanyle raskt Langendorff apparatet. Kontroller at det ikke er noen bobler i kanyle.
  8. Bytte perfusjon presset til 80 mmHg, slik at en konstant press perfusjon.
  9. Kateter nøye inn i høyre atrium og høyre ventrikkel uten å berøre eller skade hjertet og fest kateter til kanyle med tape.
  10. Start stimulering med forberedt syklus lengden på 100 ms for en første 20 min balanse periode.
  11. Lukk kammeret å tillate en stabil temperatur.

4. elektrofysiologiske parametere og Arrhythmogenesis

  1. Bruke en programmert stimulering de distale eller proksimale elektroder av kateter på to ganger atrial eller ventrikkel pacing terskelen vurdere parameterne elektrofysiologiske som beskrevet i fremgangsmåten nedenfor.
    1. Bestemme sinus node utvinningen tid som maksimal avkastning syklus lengden etter 10 s av fast rente pacing på en S1S1 syklus lengde på 120 ms, 100 ms og 80 ms.
    2. Bestemme Wenckebach punktet som den lengste S1S1 syklus lengden (8 stimuli; S1S1: 100 ms; 2 ms gradvis reduksjon) med et tap på 11 AV knutepunktet ledning. Bestemme atrioventrikulær knutepunktet ildfaste periodene som den lengste S1S2 (12 stimuli; S1S1: 120 ms, 110 ms og 100ms; en kort kombinert extrastimulus med 2 ms gradvis S1S2 reduksjon) med et tap av AV knutepunktet varmeledning.
    3. Bestemme atrial og ventrikkel ildfaste periodene som den lengste S1S2 (12 stimuli; S1S1: 120 ms, 110 ms og 100ms; en kort kombinert extrastimulus med 2 ms gradvis S1S2 reduksjon) med et fraværende atrial eller ventrikkel svar10,11.
  2. Utføre et programmert extrastimulation (S1S1: 120 ms, 100 ms og 80 ms, etterfulgt av opptil 3 ekstra beats, 60-20 ms med 2 ms gradvis reduksjon) eller briste pacing protokoller (5 s på S1S1: 50-10 ms med 10 ms gradvis reduksjon) i tråd med Lambeth konvensjonene til eva luate ventrikulær arrhythmogenesis10,11,12.

5. epicardial ledning målinger

Merk: Registrere unipolar epicardial electrograms med en 128-kanal, computer-assistert innspillingssystem med en samplingsfrekvens på 25 kHz for høyoppløselig kartlegging. Bruk en 32 multi elektrode matrise (MEA; Inter elektrode avstand: 300 µm; 1,8 x 1,8 mm). Merk at dataene ble Båndpassdesign filtrert (50 Hz) og digitalisert med 12 bit og en signalrekkevidde 20 mV.

  1. Plasser MEA i det angitte området av hjertet, og legger til jording av hjertet13,14,15.
  2. Plasser en epicardial stimulering kateter nær MEA og starte en konstant stimulering.
  3. Starte innspillingen etter god kontakt mellom elektrodene ved signalkvaliteten og amplitude.
  4. Bruk en frakoblet analyse for fastsettelse av bølge overføring hastighet og spredning i ledning retning.

6. han selvmord resonans energi overføring bånd-baserte syklisk adenosin monofosfat (cAMP) bildebehandling

Merk: For bånd-baserte målinger, høste hjerter fra CAG-Epac1-leirene transgene mus16.

  1. Bruk en selvbygde tenkelig system rundt en stereomicroscope15,17.
  2. Plasser stereomicroscope foran hjertet og justere den for skarphet.
  3. Opphisse leiren sensoren med en lyskilde [f.eksbruker en enkelt-bølgelengde light emitting diode (440 nm)]. Delt utslipp lys i giver og acceptor kanalene benytter en bjelke-splitter (for noen cyan fluorescerende protein/gul fluorescerende protein, bruk en 565dcxr dichroic speil og D480/30 og D535/40 utslipp filtre).
  4. Sikre en stabil temperatur ved å sette en plast brytes rundt kammeret.
  5. Ta bilder ved hjelp av en vitenskapelig complementary metal-oxide-semiconductor (sCMOS) kameraet. Koordinere lyskilde og kameraet avbildningsopptak med åpen kildekode bildebehandlingsprogrammer som mikro-Manager.
  6. For å starte bilde oppkjøpet, trykk Multi-D Acq. knappen og sette opp en time-lapse, som et bilde hver 10 s, med passende eksponeringstid, som avhenger av styrken fluorescerende signalet (rundt 100 ms).
  7. Bruk de tidligere beskrevet og tilgjengelige bånd online og SLITE online 2 plugins17 å dele bildet opp i to kanaler, Velg områdene rundt og overvåke forhold sporing.
  8. Under oppkjøpet, perfuse hjertet med endrede Krebs-Henseleit løsning som inneholder forskjellige stoffer, avhengig av eksperimentet.
  9. På slutten av eksperimentet, slå av oppkjøpet ved å trykke på Stop -knappen og lagre stabelen av bilder.
  10. Analysere bånd dataene frakoblet ved å bruke en dedikert analyseprogramvare som kan dele bilder i to identiske for giver og acceptor kanaler og kan utføre bånd analyse i flere områder av interesse.
    Merk: En dedikert plug-in (SLITE frakoblet) er nødvendig, som finnes i Sprenger et al. 17.
    1. Start programvaren. Åpne analyse ved å gå til Plugins -menyen, og klikk på MicroManager, og deretter Åpne mikro-Manager-fil.
    2. Kjøre SLITE frakoblet plugin for å dele den time-lapse i to identiske bilder for CFP og YFP kanaler.
    3. Bruk verktøyet Frihånd valg for å merke regionen rundt i YFP bildet. Trykk Legg til valg til vinduet Multi .
    4. Velg regionen for interesse i vinduet Multi og trykk Multi å få en tabell med mener grå verdier for hver ramme og regionen. Kopiere og lime inn alle dataene i en Excel-ark.
    5. Klikk i CFP bildestakk. Utføre de samme handlingene som i trinn 6.10.4 for CFP stakken og lim mener grå verdiene i det samme Excel-arket.
  11. Korrigere rådata frakoblet til gjennomslag faktoren for giveren i acceptor kanal17.
    1. Bruk følgende formel, der B er gjennomslag faktor:
      Forholdet = (YFP - B x CFP) / CFP
    2. Bestemme faktoren gjennomslag B av imaging et hjerte uttrykke CFP bare og måle andelen donor fluorescens i kanalen YFP (B = YFP / CFP).

7. Neuromorphology

Merk: Analysere intracardiac autonome nervesystemet med hele-mount immunostainings intakt murine hjerter. Merk at flertallet av intracardiac Ganglion er lokalisert i epicardial fettvev nær pulmonary venene.

  1. Bruke forskjellige stainings for beskrivelsen av neurofilament (generell neuronal strukturer, kylling anti-NF-H, 1:3, 000), tyrosin hydroksylase (TH, sympatisk neuronal strukturer, kanin α TH, 1:1, 000), og kolin acetyltransferase (ChAT, parasympatiske neuronal strukturer; geit α ChAT, 1:50).
  2. Etter perfusjon i Langendorff apparatet, fikse musen hjerter i 10 mL formalin 24 h og lagre dem i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 4 grader.
  3. Bleach hjertene i Dent blekemiddel (4:1:1 metanol: hydrogenperoksid løsning 30% (w/w) i H2O: dimethyl sulfoxide (DMSO)) for 1 uke på 4 grader og rehydrate dem senere til PBS i en serie av synkende metanol i PBS (100%, 75%, 50%, 25%; 1 h) 18.
  4. Utføre følgende incubations i en 24-vel-plate-format med en mild agitasjon på 4 grader:
    1. Permeabilize hjerter i 1% Triton-X-100/PBS (PBS-T) 3 x 1 h ved romtemperatur før blokkerer dem over natten i en sperring buffer [5% bovin serum albumin (BSA) / PBS-T + 0,2% Natriumazid].
    2. Fortynne antistoffer som følger: geit α ChAT (1:50), kanin α TH (1:1, 000), kylling α neurofilament (1:3, 000); sekundær antistoffer for fluorescerende merking (1:500, eller i henhold til produsentens instruksjoner); biotinylated sekundære antistoffer for kromogent merking (1:200, eller i henhold til produsentens instruksjoner).
  5. Inkuber eksemplarer i primære antistoffer fortynnet i en sperring buffer for 1 uke på 4 grader.
  6. Legg hjertene i 3 x 15 min i PBS-T før den sekundære antistoff inkubering i en sperring buffer for 4 dager.
  7. Vaske hjerter i 3 x 15 min i PBS-T og lagre dem i et montering medium for fluorescerende flekker for 3t ved romtemperatur eller bruker en avidin-biotin komplekse oppdagelsen utstyr i henhold til produsentens instruksjoner.
  8. Pre ruge hjerter 1t i en kommersiell buffer for 3, 3-diaminobenzidine (DAB), før utvikler seg under en visuell kontroll i en DAB-inneholder buffer i henhold til produsentens instruksjoner.
  9. Lagre de i dobbel destillert vann.
  10. For parafinsnitt, tørke og bygge hjerter i parafin.
    1. Skjær 4-µm tykke snitt og deparaffinize dem ifølge laboratoriets rutinemessige prosedyrer. Hvorvidt og hvordan antigen henting må utføres må opprettes for hver enkelte oppsettet siden det avhengig av antistoff kombinasjonen.
    2. Permeabilize avsnittene for 10 min i 0,2% Triton-X-100/Tris-bufret saltvann (SS), etterfulgt av 3 x 5 min vasker i TBS.
    3. Blokkere dem med 3% BSA/SS 1t ved romtemperatur.
    4. Inkuber dem over natten på 4 grader [primær antistoffer: geit α ChAT (1:50), kanin α TH (1:500), kylling α neurofilament (1:1, 000)] eller 2 timer ved romtemperatur (fluorescens-merkede sekundære antistoffer, 1:500) i 1% BSA/SS med 3 x 5 min vasker TBS i mellom.
    5. Legge 1 µg/mL av bisbenzimide H33342 trihydrochloride til sekundære antistoff løsningen eller bruke en annen kjernefysiske flekker metode.
    6. Montere lysbildene i et montering medium for fluorescerende flekker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1 viser et bilde av Langendorff inkludert 2 flere elektrode matriser (tiltak). Før eksperimentet plasseres intracardiac kateter nær kanyle å lette en rask og enkel innsetting i høyre atrium/høyre ventrikkel og sikre en kort tidsperiode før balanse kan starte. Den nedre delen av kammeret kan bli forsterket (se pilene i figur 1) slik at kammeret er helt lukket og garanterer en stabil temperatur.

Figur 2 viser forskjellige representant cardiac stainings. I figur 2A en hematoxylin og eosin er (H & E) flekker for en parafin presentert. Eksemplarisk utvidelsen (figur 2B) demonstrerer en immunohistochemical farging av en atrial ganglion hovedsakelig parasympatiske cellene (rød, ChAT-positive) sammenlignet med mindre rekke sympatisk celler (grønn, TH positiv). I figur 2C-E viser en immunohistochemical farging av nevrale (figur 2C, grønn, neurofilament) og sympatisk fiber (figur 2D, rød, TH) samt overlegget de to bildene (figur 2E) hvordan nevrale Fibre traversen fra atria via koronar sinus mot bakre ventriklene.

Figur 3 viser murint hjertet koblet til kanyle av Langendorff apparatet med en innsatt octapolar kateter i høyre atrium og høyre ventrikkel og en epicardial multi elektrode matrise (MEA) plassert på fremre venstre ventrikkel ( Figur 3A). Ventrikulær arytmi mottakelighet testing via elektrodene i RV vises i figur 3B. Induksjon av en ventrikkel takykardi i hjerter oppstod oftere etter delvis atrial denervation. Forstørret MEA (Figur 3 c) presenteres skjematisk oppsettet av elektrodene. Det er viktig å sikre en stabil epicardial kontakt med alle elektroder. Frakoblet-analysert epicardial gjennomføring av en MEA er avbildet i figur 3D .

Figur 4 viser bånd målinger i et helt hjerte blir retrogradely parfyme i Langendorff apparatet. Forskjellige områder av hjertet kan analyseres som nødvendig (figur 4A). En global samt lokale aktuell anvendelse av legemidler er lett mulig i dette oppsettet (figur 4B).

Figure 1
Figur 1: Langendorff installasjonen inkludert flere elektrode matriser (tiltak). Octapolar stimulering og opptak kateter plasseres nær området der hjertet skal festes. Den nedre delen av kammeret flyttes oppover (hvite piler) når hjertet har vært knyttet til apparatet slik at en stabil temperatur er sikret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Cardiac hele mount stainings som viser deler av det autonome nervesystemet. A) skildring av en hjertestans H & E-farget parafin delen (skala bar 1 mm). B) en eksemplarisk utvidelse av en immunohistochemically farget atrial ganglion demonstrerer hovedsakelig parasympatiske cellene (rød, ChAT-positive) sammenlignet med mindre rekke sympatisk celler (grønne, TH-positive, skala bar 75 µm). C-E) Representant immunohistochemical stainings av nevrale (figur 2C, grønn, neurofilament, NF) og sympatisk fiber (figur 2D, rød, TH og deres overlegg i figur 2E) travers fra atria via koronar sinus (CS) mot den bakre ventriklene. Eksemplarisk fiber er markert med pilspisser. Stjerner betegne atrial Ganglion. Skalere bar 1 mm. LA, venstre atrium. LV, venstre ventrikkel; NF, neurofilament; PV, pulmonary årer; RA høyre atrium. RAA, rett atrial appendage; RV, høyre ventrikkel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 3
Figur 3: Intra- og epicardial mål med Langendorff oppsettet. A. dette panelet viser et eksempel på et murint hjerte i Langendorff systemet. Intracardiac octapolar kateter, som settes inn i høyre atrium ventrikkel og en epicardial multi elektrode matrise (MEA) vises. B. arytmi mottakelighet testing ved bruk av burst stimulering uten (kontroll) eller med induksjon av en selv avslutte ventrikkel takykardi [etter delvis atrial denervation (PAD)] vises. C. epicardial MEA er avbildet med en utvidelse av oppsettet skjematisk elektroden. D. bølge overføring hastighet ble analysert ved hjelp av en skreddersydd programvare. Avstanden mellom isochrones er 2 m/s. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: bånd mål i et Langendorff oppsett. A. to differentcAMP biosensor fluorescens kanalene [gule fluorescerende protein (YFP) og cyan fluorescerende protein (CFP)] under bånd mål i en retrograd perfused hjerte er avbildet. Hvis nødvendig, ulike deler av hjertet (f.eks, atria og ventrikkel) kan analyseres (skala bar: 1 mm). B. dette panelet viser et representativt bånd eksperiment, som måler leiren nivåer under en farmakologisk stimulering i atrium og venstre ventrikkel. Først var hjertet systemisk parfyme med det adenylyl cyclase aktivatoren NKH477, en forskolin analogon, å øke leiren nivåer. Deretter var nikotin lokalt brukt og rettet mot de atrial Ganglion, som akutt redusert leiren nivåer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I dette manuskriptet er den velkjente Langendorff ex vivo hjertet perfusjon systemet presentert som et verktøy for å studere virkningen av intracardiac neurons cardiac electrophysiology og arrhythmogenesis ved hjelp av ulike kartlegging og stimulering teknikker inkludert endocardial og epicardial tilnærminger.

Flere deler av protokollen er avgjørende for oppsettet. Først er det viktig å bruke en forberedelse teknikk som atrial fett pads forblir intakt eller fjernes raskt uten skadet myokard. Andre har en riktig størrelse åpning kuttes i høyre atrium for en enkel innsetting av octapolar kateter inn i høyre atrium og høyre ventrikkel. Kateter bør settes enkelt i høyre ventrikkel uten å generere noe press. Under kateter feste til kanyle, bør kateter ikke dukkert dypere i ventrikkel, unngå hjertestans skade. Tredje er temperaturkontroll en viktig del av alle Langendorff oppsett1,2,5. Termisk kammeret er stengt i arrhythmia testing, sikrer en jevn temperatur. Men MEA eller bånd opptak, kammeret må være minst delvis åpen for å tillate målinger. Enten opptakstid bør holdes til et minimum, eller andre teknikker til å redusere temperaturen tap, som å sette en plast brytes rundt kammeret under lengre målinger, skal utføres. Fjerde bør tiltak plasseres på samme anatomiske steder i alle eksperimentene. God overflate kontakt, som er bekreftet av store amplituder i sanntid analyse, kan oppnås ved å bruke to tiltak på motsatt områder slik at en motvekt produseres. Femte er bånd målinger påvirket av bevegelse. For å redusere spontan bevegelse, er hjertet tempoet på en stabil frekvens av den intracardiac kateter. For ytterligere stabilisering, kan en tube med en liten vakuum stabilisere apex.

En fordel av Langendorff er at hjerter kan brukes senere til immunohistological vurderinger av cardiac nervesystemet. Kontinuerlig perfusjon fjerner de fleste røde blod celler som har høy autofluorescence19, forbedre kvaliteten på flekker. Etter formalin fiksering, kan hjertene lagres i temperatur kontrollert (4 grader) omgivelser i fosfat-bufret saltløsning i opp til ett år uten merkbare forandringer i flekker kvalitet.

Den viktigste funksjonen av dette oppsettet er at alle mål utføres i et sentralt denervated hjerte. De overveiende parasympatiske atrial intracardiac Ganglion er den siste relay-stasjonen i hjertet20 sympatisk ganglion stellatum ligger intrathoracically og er derfor fjernet under forberedelse. Selv om intracardiac neurons får ingen sentral innspill, har det vært vist at de er fortsatt aktiv i en fysiologisk måte som photoactivation av cardiac sympatiske nerver øker hjertefrekvens og cardiac contractile kraften21. I tråd med disse funnene støtte funksjonell betydningen av intracardiac nerveceller i sentralt denervated hjertet, viste vi nylig deres innvirkning på ventrikkel funksjon og arrhythmogenesis15.

En fordel med dette sentralt denervated oppsettet er at forskeren å studere kommunikasjonen mellom ulike intracardiac regionale nevrale nettverk (f.eks, samspillet mellom atrium og ventrikkel)15. Disse forskjellene kan være relevante for pasienter etter hjertet transplantasjon som forbedrer behandling med selektiv sinus node modulator ivabradine overlevelse, sammenlignet med behandling med det beta-blocker metoprolol succinate22. I en fremtidig trinnet direkte elektrisk stimulering av parasympatiske (nervus vagus) eller sympatisk strukturer (Ggl. stellatum23) vil bidra til å forbedre vår kunnskap om samspillet mellom den ekstra- og intracardiac autonome nervesystemet.

Det er viktig å huske på at parasympatiske sympatisk fiber er hovedsakelig samlokalisert slik at gjeldende behandlinger som kateter ablasjon av atrial eller ventrikulær arytmi vil uunngåelig endre både strukturer. I her beskrevet stilling, kan lokale farmasøytisk endring av målrettet strukturer (f.eks, spesiell stimulering av parasympatisk Ganglion) studeres. Foruten målrettet endringer er global perfusjon med ulike legemidler (f.eks beta-blokkere) enkelt mulig, slik at potensielle proarrhythmic eller antiarrhythmic egenskaper av ulike agenter kan studeres. Bruker dette oppsettet, kan intervensjoner og ulike teknikker testes under stimulering eller hemming av ulike deler av intracardiac autonome nervesystemet, avsløre informasjon om virkningen av bestemte deler av det autonome nervesystemet på hjertefunksjon og arrhythmogenesis. Videre kan murine oppsettet studere cardiac autonome nervesystemet i stater av sykdommer som hjerteinfarkt, hjertesvikt eller diabetes.

I konklusjonen, enkle og velkjente Langendorff ex vivo hjertet perfusjon systemet gir fleksibel grunnlag for å endre og studere virkningen av intracardiac neurons cardiac electrophysiology og arrhythmogenesis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Hartwig Wieboldt for hans utmerket kundestøtte og UKE mikroskopi Imaging anlegget (Umif) den University Medical Center Hamburg-Eppendorf for å gi mikroskop og støtte. Denne forskningen ble finansiert bythe Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. og DZHK (tysk Centre for hjerte forskning) [FKZ 81Z4710141].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014 Modified Krebs-Henleit solution
Sodium hydrogencarbonate Sigma-Aldrich 401676 Modified Krebs-Henleit solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 Modified Krebs-Henleit solution
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 Modified Krebs-Henleit solution
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M1880 Modified Krebs-Henleit solution
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 Modified Krebs-Henleit solution
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Modified Krebs-Henleit solution
Sodium pyruvate bioXtra Sigma-Aldrich P8574 Modified Krebs-Henleit solution
Carbogen (95% O2 / 5% CO2) SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany Modified Krebs-Henleit solution
Sterile filter steritop-GP 0.22 EMD Millipore SCGPT05RE Modified Krebs-Henleit solution
Atropine sulfate Sigma-Aldrich A0257 Neuromodulation
Hexamethonium chloride Sigma-Aldrich H2138 Neuromodulation
Nicotine free base 98-100% Sigma-Aldrich N3876 Neuromodulation
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128 Whole mount staining
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich 252859 Whole mount staining
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Whole mount staining
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O Merck, KGA, Darmstadt, Germany H1009 Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide Merck, KGA, Darmstadt, Germany D8418 Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets Gibco / Invitrogen 18912-014 Whole mount staining
Triton-x-100 Sigma-Aldrich T8787 Whole mount staining
Albumin bovine fraction V Biomol, Hamburg, Germany 11924.03 Whole mount staining
Chicken anti neurofilament EMD Millipore AB5539 Whole mount staining
Rabbit anti tyrosine hydroxylase EMD Millipore AB152 Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase EMD Millipore AP144P Whole mount staining
Donkey α rabbit IgG Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A21206 Whole mount staining
Donkey α goat IgG Alexa 568 Thermo Fisher Scientific A11057 Whole mount staining
Donkey α chicken IgY Alexa 647 Merck, KGA, Darmstadt, Germany AP194SA6 Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α rabbit igG R&D Systems AP182B Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α goat igG R&D Systems AP192P Whole mount staining
Biotin-conjugated goat α chicken igY R&D Systems BAD010 Whole mount staining
Vectashield mounting medium Vector laboratories, Burlingame, CA, USA H-1000 Immunohistochemistry
Vectastain ABC kit Vector laboratories, Burlingame, CA, USA PK-4000 Immunohistochemistry
Steady DAB/Plus Abcam plc, Cambridge, UK ab103723 Whole mount staining
HistoClear DiaTec, Bamberg, Germany HS2002 Immunohistochemistry
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA B2261 Immunohistochemistry
Vectashield HardSet mounting medium Vector laboratories, Burlingame, CA, USA VEC-H-1400 Immunohistochemistry
Perfusion system HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany  73-4343 Langendorff apparatus
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand PL3508 PowerLab 8/35 Langendorff setup
Octapolar catheter CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA custom Langendorff setup
Stimulus generator STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany STG4002-160µA Stimulation setup
Stimulation software Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany MC_Stimulus II Stimulation setup
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany USB-ME128-System MEA setup
Multi-electrode array MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany EcoFlexMEA36 MEA setup
Multi-electrode array recording software Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany MC_Rack MEA setup
Spring scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 15003-08 Heart Preparation
Strabismus Scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14575-09 Heart Preparation
Mayo Scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14110-15 Heart Preparation
Dumont SS Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11203-25 Heart Preparation
London Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11080-02 Heart Preparation
Narrow Pattern Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11003-13 Heart Preparation
Plastic Wrap Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States Consumable Materials
Stereomicroscope Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany FRET
LED CoolLED, Andover, UK pE-100 FRET
DualView Photometrics, Tucson, AZ, USA DV2-SYS FRET
DualView filter set Photometrics, Tucson, AZ, USA 05-EM FRET
optiMOS scientific CMOS camera Qimaging, Surrey, BC, Canada 01-OPTIMOS-R-M-16-C FRET
Imaging software   Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA FRET
Analysis Software Image J software; Public Domain, NIH, USA FRET

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, (6), 940-950 (2011).
  2. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41, (6), 613-627 (2000).
  3. Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41, (6), 597-603 (2000).
  4. Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49, (3), 171-181 (2004).
  5. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55, (2), 113-126 (2007).
  6. Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
  7. Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114, (14), 1497-1503 (2006).
  8. Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114, (10), 1601-1610 (2014).
  9. Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88, (88), 51671 (2014).
  10. Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7, (11), e49203 (2012).
  11. Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13, (3), 207-216 (2003).
  12. Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139, (2), 213-248 (2013).
  13. Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76, (2), 257-268 (2007).
  14. Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16, (4), 470-474 (2010).
  15. Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
  16. Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7, (8), e1000172 (2009).
  17. Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
  18. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4, (1), 31-33 (2007).
  19. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
  20. Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116, (12), 2005-2019 (2015).
  21. Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105, (2), 143-150 (2015).
  22. Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. (2017).
  23. Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3, (3), e12328 (2015).
Virkningen av Intracardiac Neurons Cardiac Electrophysiology og Arrhythmogenesis i en <em>Ex Vivo</em> Langendorff System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jungen, C., Scherschel, K., Bork, N. I., Kuklik, P., Eickholt, C., Kniep, H., Klatt, N., Willems, S., Nikolaev, V. O., Meyer, C. Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System. J. Vis. Exp. (135), e57617, doi:10.3791/57617 (2018).More

Jungen, C., Scherschel, K., Bork, N. I., Kuklik, P., Eickholt, C., Kniep, H., Klatt, N., Willems, S., Nikolaev, V. O., Meyer, C. Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System. J. Vis. Exp. (135), e57617, doi:10.3791/57617 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter