Summary
Qui, presentiamo un organotipiche coltura protocollo per crescere organi embrionali di pollo in vitro. Utilizzando questo metodo, lo sviluppo del tessuto embrionale pollo può essere studiato, pur mantenendo un elevato grado di controllo dell'ambiente di cultura.
Abstract
Il pollo embrionale è comunemente utilizzato come organismo modello affidabile per lo sviluppo dei vertebrati. L'accessibilità e l'incubazione breve periodo lo rende ideale per la sperimentazione. Attualmente, lo studio di queste vie inerenti allo sviluppo nell'embrione di pollo è condotto applicando inibitori e farmaci presso siti localizzati e alle concentrazioni basse utilizzando una varietà di metodi. La coltura in vitro del tessuto è una tecnica che consente lo studio dei tessuti separati dall'organismo ospite, evitando contemporaneamente molte delle limitazioni fisiche presenti quando si lavora con interi embrioni, come la suscettibilità degli embrioni per alte dosi di sostanze chimiche potenzialmente letale. Qui, presentiamo un organotipiche coltura protocollo per coltura l'embrionale pollo mezza testa in vitro, che presenta nuove opportunità per l'esame dei processi di sviluppo oltre i metodi attualmente stabiliti.
Introduction
Il pollo embrionale (Gallus gallus) è un organismo di modello eccellente comunemente utilizzato nel campo della biologia. Il periodo di incubazione è di circa 21 giorni e molte uova possono essere incubate contemporaneamente, rendendo sperimentazione rapido ed efficiente. Forse la cosa più importante, l'embrione è anche facilmente manipolabili, consentendo il vasto studio chiavi dei processi di sviluppo e dei geni e proteine che guidano questi processi.
L'occhio di pollo embrionale è un organo complesso che si sviluppa attraverso l'interazione di un numero di diversi tessuti simili a molti altri sistemi del corpo. Questo metodo consente lo studio dello sviluppo di questi tessuti, specialmente nelle fasi avanzate di sviluppo. Ad esempio, la retina a più strati può essere di particolare interesse per coloro che studiano lo sviluppo del sistema nervoso. Metodi alternativi che permettono lo studio di altri tessuti dell'occhio come la cornea, il corpo vitreal, la lente, la sclera e le palpebre sono di beneficio ai ricercatori. L'occhio embrionali di pollo contiene anche una serie di ossa piatte, gli ossicini sclerali, che possono essere utilizzati come un modello per lo studio di induzione dell'osso intramembranous e ossificazione in vertebrati1.
Attualmente, ci sono una serie di metodi utilizzati per studiare lo sviluppo embrionale. Microiniezioni di anticorpi inibitori o altre molecole inibitorie2,3, impiantato chirurgicamente microsfere imbevuto di inibitore4, e5 di elettroporazione sono tutti metodi che possono essere utilizzato per downregulate geni o le proteine di interesse in un embrione. Metodi simili vengono utilizzati per aumentare il proteine. Questi metodi non sono senza loro limitazioni. Ad esempio, quando si utilizza sostanze chimiche per alterare lo sviluppo embrionale, devono essere valutati gli effetti letali sull'embrione, e questo limita l'utilizzo di metodi di cui sopra per siti localizzati di applicazione a dosi sufficientemente basse per garantire la sopravvivenza della dell'embrione.
La coltura in vitro del tessuto è stata utilizzata in una vasta gamma di organismi nello studio dello sviluppo e può essere utilizzata per ignorare alcune delle limitazioni di cui sopra. Ad esempio, i femori6, piuma germogli7,8e membra9 del pollo sono tutti stati studiati usando il tessuto di coltura metodi, come hanno i testicoli dei mouse10 e le radici e gambi di piante11. Questi metodi concedono gli scienziati un alto grado di controllo sullo sviluppo dei tessuti, come la possibilità di variare la temperatura e alterare la disponibilità di nutrienti. L'isolamento del tessuto dall'embrione intero rende anche molto meno sensibili agli effetti letali di sostanze chimiche, consentendo in tal modo gli studi di manipolazione su scala globale a concentrazioni più elevate. Un altro notevole vantaggio di in vitro coltura è la conservazione dell'ambiente cellulare del tessuto; la disposizione dei tessuti rimane relativamente invariata, rendendo possibile lo studio delle interazioni tra tessuto differenti tipi9. Così, in vitro coltura apre le porte a ulteriori sperimentale si avvicina non è disponibile in modelli in vivo o in ovo .
Attualmente, studiare lo sviluppo dell'occhio embrionale pollo usando i prodotti chimici è particolarmente impegnativo. Una serie di Membrane Extraembrionali copertina l'embrione, che lo rende difficile applicare microsfere o prodotti chimici; l'embrione è anche molto attivo all'interno l'uovo come esso invecchia, complicando ulteriormente un metodo già difficile. Questo protocollo consente un facile accesso all'occhio e relativi tessuti circostanti, eliminando queste barriere, fornendo nel contempo nuove opportunità per esaminare i processi inerenti allo sviluppo all'interno dell'occhio. Questo protocollo è stato istituito per studiare l'induzione dei ossicles scleral all'interno dell'occhio embrionale.
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Protocol
Nota: Per le fasi di embrione, utilizzano l'Hamburger e Hamilton12 (HH) tabella di gestione temporanea.
1. embrione incubazione
- Incubare uova di gallina fertilizzate in un'incubatrice sterile, termostatato a 37 ° C ± 1 ° C e ~ 40% di umidità.
- Girare le uova 1 x al giorno e consentire loro di incubare a HH34 (post-fecondazione 8 giorni).
2. preparazione e sterilizzazione dei materiali
- Per 12 embrioni, autoclave 2 L di acqua distillata, 1 L di soluzione salina allo 0,85% pulcino, 12 pipette in vetro, 1 scatola di carta velina, 24 2,5 x 2,5 cm quadrati di carta da filtro semi-porosa e piazze 24 2,5 x 2,5 cm di filo d'acciaio della maglia con i bordi curvi verso il basso. Per sterilizzare i materiali, autoclave a 121 ° C per almeno 15 min.
Nota: La sterilizzazione in autoclave dei materiali può essere fatto in anticipo. - Sterilizzare l'incubatrice con etanolo al 70% pulendo i fianchi, mensole e porta. Posto 2 contenitori di plastica contenenti in autoclave acqua distillata acqua all'interno dell'incubatrice per mantenere l'umidità. Preriscaldare l'incubatore di coltura a 37 ° C ± 1 ° C e circa il 40% di umidità. Garantire che l'incubatrice è completamente buia; Se la porta è trasparente, coprire con carta stagnola.
- Preriscaldare 100 mL di terreno nutritivo e 1 mL di penicillina inserendoli nell'incubatrice cultura.
- Coprire l'area di lavoro con un tovagliolo di carta e sterilizzare la panchina spruzzando con etanolo al 70%. Sterilizzare 2 paia di pinze, forbici di dissezione, una lama di rasoio e un cucchiaio di plastica con etanolo al 70% in un modo simile.
- Capsule di Petri sterili 100 mm posto 12 e 24 capsule di Petri sterile 35 mm sul banco per l'uso. Garantire che i piatti rimangono in un sacchetto sterile fino all'utilizzo.
3. embrione preparazione
Nota: Da questo punto in poi, indossare una maschera protettiva polvere per evitare di contaminare le culture. Un'infezione batterica o fungina rovinerà la cultura e c'è il rischio che si sta diffondendo rapidamente a tutte le culture nell'incubatrice.
- Crack aprire l'uovo e trasferimento dell'embrione in una capsula Petri 100 mm contenente soluzione fisiologica allo 0,85% pulcino. Fase dell'embrione secondo le caratteristiche anatomiche descritte in Hamburger e Hamilton stadiazione linee guida12 e confermare l'embrione è a HH34.
- Tagliare il collo e poi bisecare la testa dell'embrione al midline usando una lama di rasoio sterilizzata. Utilizzando pinze sterili, rimuovere il cervello. Lasciare intatto il becco.
4. cultura Setup
- Posto 2 dei piatti Petri 35 mm all'interno di una capsula di Petri di 100 mm.
- Collocare una rete metallica in acciaio all'interno di ogni scatola di Petri 35 mm.
- Usando il forcipe, trasferire 1 delle teste diviso in due per un pezzo di carta da filtro semi-porosa 2,5 x 2,5 cm con l'occhio rivolto verso l'alto. Garantire il tessuto è sicuro e non scivolare inclinando leggermente.
- Usando il forcipe, collocare attentamente tessuto oculare e il filtro di carta sopra la maglia di filo di acciaio in 1 il 35mm piastre Petri, creando un palcoscenico rialzato con il tessuto dell'occhio sulla parte superiore.
- Ripetere i passaggi da 4.3 e 4.4 con l'altra metà testa.
- Utilizzando una pipetta di vetro sterile, aggiungere cautamente mezzo nutritivo direttamente in ogni capsula di Petri 35 mm fino a quando non raggiunge il livello della carta da filtro. Non immergere la testa mezza in mezzo nutritivo.
- Aggiungere 50 µ l di 10.000 U/mL penicillina-streptomicina per il terreno di coltura in ogni capsula di Petri.
- Piegare un pezzo di carta velina in una piccola piazza e posizionarlo all'interno il 100mm di Petri. Inumidire con acqua distillata in autoclave.
- Inserire la piastra di coltura sterile, scuro incubatore a 37 ° C ± 1 ° C e circa il 40% di umidità per fino a 4 giorni.
- Ripetere i passaggi 3 e 4 per ciascun embrione.
Nota: Il numero di embrioni necessari dipenderà l'esperimento specifico; qui, descriviamo il protocollo per 12 embrioni.
5. cultura manutenzione
- Una volta al giorno, rabboccare i contenitori di plastica nell'incubatrice con acqua distillata in autoclave.
- Controllo quotidiano di tutte le culture per infezioni batteriche o fungine. Culture che hanno disintegrato o in cui il mezzo ha cambiato colore sono infettate. Scarta tutte le culture che si sono infettate.
6. fissazione
- Dopo coltura, rimuovere tutti i piatti dall'incubatrice.
- Utilizzando un paio di pinze, rimuovere delicatamente l'occhio dalla carta da filtro, facendo attenzione a non per strappare il tessuto.
- Difficoltà tessuto oculare in paraformaldeide al 4% in tampone fosfato salino durante la notte a 4 ° C: 1x o in formalina neutra tamponata al 10% durante la notte a temperatura ambiente.
- Conservare il tessuto a 4 ° C in 1x tampone fosfato salino.
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Representative Results
Utilizzando questo metodo, un occhio di pollo embrionali possa essere coltivato dal giorno 8 del suo sviluppo (HH34) in vitro per 4 giorni. Quattro giorni di sviluppo in ovo corrisponde a HH38.
Questo metodo di coltura supporta lo sviluppo di germogli di piuma che circondano l'occhio e sulle palpebre (Figura 1B). Questi germogli di piume non sono presenti in ovo a HH34 prima alla coltura (Figura 1A), indicazione del fatto che sviluppo del germoglio di piuma è iniziato durante il periodo di coltura, in quanto è in ovo13 (Figura 1). Crescono le palpebre e la membrana nittitante per coprire l'occhio durante la coltura (Figura 1B). Le palpebre appaiono più mature dopo il in vitro coltura rispetto all'inizio della coltura alle HH34 (Figura 1A), ma sono meno sviluppate che in HH38 (Figura 1). Questi dati mostrano che gli aspetti principali dello sviluppo embrionale sono supportati, anche se con qualche piccolo ritardo.
Dopo la coltura, abbiamo dissecato la porzione anteriore dell'occhio per mostrare le papille congiuntivale (un anello transitoria di protrusioni epiteliali 13-14), che agiscono come un'altra pietra miliare che indica che gli eventi inerenti allo sviluppo sono supportati nella cultura. In genere, queste papille sono completamente formate da HH34 (Figura 1) e degenerare nel corso del tempo, come essi inducono skeletogenic condensazioni nel mesenchima sottostante; scompaiono di HH381 (Figura 1F). I nostri dati mostrano che questa degenerazione si verifica in vitro (Figura 1E) ed è preceduta da un appiattimento dei papillae seguendo il modello in ovo di sviluppo. Senza macchia condensazioni, tuttavia, non sono visibili nei campioni in vitro , a differenza di al HH38 (Figura 1F). Abbiamo usato la fosfatasi alcalina che macchia, che rileva l'attività degli osteoblasti presto per valutare ulteriormente l'induzione di questi condensazioni14; Questo processo si verifica a fianco la degenerazione di papille congiuntivali in ovo. L'induzione delle condensazioni di skeletogenic, che inizia a HH34 (Figura 1), procedere in vitro , come testimoniano la fosfatasi alcalina macchiatura (Figura 1 H). Queste condensazioni, tuttavia, sono non come grande come sono al HH3814 (Figura 1I), che indica che c'è un piccolo ritardo nello sviluppo. Si stima che i 4 giorni di coltura rappresentano circa 2 giorni di sviluppo embrionale; quindi un ritardo di circa il 50%. Collettivamente, questi risultati indicano che l'induzione e lo sviluppo delle ossa intramembranous, le condensazioni sclerale, è supportato in vitro e che i processi di sviluppo come la palpebra crescita e formazione di gemme di piuma procedono in vitro.
Figura 1 . Caratteristiche morfologiche del in vitro coltivate gli occhi, gli occhi HH34 e HH38 occhi. A - F sono senza macchia e G - mi sono macchiato per l'enzima fosfatasi alcalina (AP) distinguere osteoblasti attivi entro le condensazioni sclerale. A, Ded G Visualizza occhi all'inizio del periodo di coltura a HH34. B, Eed H mostrano occhi dopo 4 giorni di messa in coltura in vitro . C, Fe mostrano occhi dopo 4 giorni di in ovo coltura, alle HH38. Tutti gli occhi sono visti lateralmente. (A) il congiuntivale papille sono visibili in un anello che circonda la cornea. Un asterisco indica papilla #12, quella prima di forma. La freccia indica il bordo della palpebra nella regione nasale dell'occhio. (B) le papille congiuntivale hanno appiattito e cominciato a degenerare. La freccia indica un crescente germoglio di piuma. (C) il congiuntivale papille sono completamente degenerati e sono coperti da palpebre e la membrana nittitante. La freccia aperta indica il bordo della palpebra nella regione nasale dell'occhio. La tinta freccia indica un crescente germoglio di piuma. (D), una porzione anteriore dissecati dell'occhio HH34. L'asterisco indica papilla #12. (E) A dissecato porzione anteriore di un HH34 + 4 in vitro eye risultati papille appiattiti. Le papille in regione temporale (tinta freccia) hanno cominciato a degenerare; Queste sono le papille più antiche sul ring. (F), una porzione anteriore dissecata d'occhio HH38 con le palpebre e la membrana nittitante rimosso, mostrando che tutte le papille hanno degenerato. Le linee tratteggiate delineano la posizione di due adiacenti non macchiate condensazioni. (G) A HH34 occhio macchiato per AP risultati molto piccolo skeletogenic condensazioni indicativo dell'inizio dell'induzione. (H) A HH34 + 4 occhio macchiato per AP mostrando allargata, crescendo skeletogenic condensazioni. (io) A HH38 occhio macchiato per AP mostrando grande skeletogenic condensazioni. Tutte le barre della scala sono 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo si avvale del tessuto consolidato tecniche di coltura per ottenere la crescita di un occhio di pollo da embrionale giorno 8 (HH34) in vitro per 4 giorni. Questo metodo di coltura griglia fu originariamente descritto da Trowell15. Abbiamo ottimizzato un protocollo da Pinto e di Hall 1991 Studio16 utilizzando una membrana semi-porosa con griglia per studiare segnali induttivi tra strati di tessuto separati del pollo embrionale occhio15. Utilizzando questo metodo, Roach coltivate 14 - giorno-vecchio pollo femore6. Questo metodo inoltre ha provato efficace nella coltura del mouse tessuti6,17. L'uso della carta da filtro è fondamentale per il successo del protocollo, in quanto aiuta il tessuto a prendere le sostanze nutrienti dal terreno in modo efficace senza saturare o immergere il tessuto.
Terreno di coltura a pH corretto è fondamentale per una crescita ottimale. Il mezzo deve essere a o vicino a pH fisiologico e l'uso del fenolo rosso nel mezzo come un indicatore fornisce un vantaggio in quanto le variazioni del pH possono essere facilmente individuate. Terreni privi di siero possono essere usate, e cambiando i media ogni giorno non è necessario e non influenza i risultati. Il protocollo è stato sviluppato utilizzando un mezzo commercialmente disponibile (Vedi Tabella materiali), che contiene alti livelli di aminoacidi e glucosio; non è necessario nessun ulteriore completamento dei media. Più occorrenze di crescita dei tessuti poveri usando questo protocollo si è verificato quando il media nutrienti era o a un pH improprio o contaminati.
L'occhio può sopravvivere e crescere per fino a 4 giorni in vitro, a partire dal giorno 8, quando il protocollo viene eseguito in condizioni ottimali. Una limitazione di questo protocollo è che le possibilità di sopravvivenza è interessato oltre i 4 giorni di coltura. Così, i processi di sviluppo che si estendono su un arco di tempo più lungo richiede modifiche al protocollo. Un'altra limitazione del protocollo è l'assenza di un flusso di sangue attivo e la vascolarizzazione. Vasi sanguigni sono importanti per molti processi di sviluppo, non solo per la consegna delle sostanze nutrienti al tessuto9, che è raggiunto in vitro tramite azione capillare attraverso la carta da filtro su cui poggia il tessuto.
Questo protocollo può essere usato per studiare lo sviluppo di interi organi o grossi pezzi di tessuti in vitro. Organi dei vertebrati sono altamente complessi, e loro sviluppo è regolato da molti modelli spatiotemporal distinti. Lo studio di queste vie di sviluppo si basa sulla capacità di manipolare i segnali che li regolano. Gli attuali metodi di limitano questa manipolazione relativamente piccoli, localizzate aree e a concentrazioni abbastanza basse per evitare la mortalità embrionale. Ad esempio, il metodo ex ovo di coltura dell'embrione di pollo intero in cultura18 o il metodo a finestra uova19 effettuare manipolazioni sono limitati in quanto sia l'intero embrione deve essere trattato, che può causare mortalità, o solo un piccola area localizzata è trattata. Il vantaggio del protocollo presentato qui è che l'effetto di questi segnali possa essere studiato su interi organi o grandi quantità di tessuto, senza compromettere la vitalità embrionale. Questo protocollo non richiede alcun completamento con biossido di carbonio come in precedenti protocolli15. Il ritardo nello sviluppo che abbiamo osservato è un vantaggio in quanto possono essere studiati i processi di sviluppo rapidi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare Gregory Haller (Mount Saint Vincent University) per il suo lavoro preliminare nello sviluppo del protocollo. Gli autori inoltre vorrei ringraziare Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) per la sua competenza tecnica e assistenza con le riprese e la produzione della parte audio/visivo del manoscritto. Daniel Andrews è stato sostenuto da finanziamenti da MSVU e scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC) tramite un Undergraduate Student Research Award. Tamara A. Franz-Odendaal è sostenuta da una sovvenzione di scoperta di NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
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