Summary
今回、切片培養ニワトリ胚の器官を成長するプロトコル体外。このメソッドを使用すると、ニワトリ胚のティッシュの開発を学べる、文化環境の制御の高度を維持しながら。
Abstract
ニワトリ胚は、脊椎動物の発展のため信頼性の高いモデル有機体として使用されます。そのアクセシビリティと短い潜伏期間最適実験のためです。現在、鶏胚におけるこれらの発達の経路の研究は、阻害剤とローカライズされたサイトで、さまざまな方法を使用して低濃度で薬を適用することによって行われています。同時に全体の胚は、胚の感受性などを扱う際に問題の物理的な制限の多くを回避しながらホストの有機体から分離組織の研究を可能にする手法は、体外で細胞の培養潜在的に致命的な化学物質の高用量。培養ニワトリ胚半分頭、生体外で、現在確立された方法を超えて発達過程の検討のための新しい機会を提示するためのプロトコルを培養、切片を紹介します。
Introduction
ニワトリ (ギャラス) 生物学の分野でよく使用される優秀なモデル生物であります。その潜伏期間は約 21 日と迅速かつ効率的な実験を行う同時に多くの卵を孵化することができます。おそらく最も重要なは、胚はまた容易に操作、キーの発達過程とこれらのプロセスを駆動する蛋白質および遺伝子の広範な研究を有効にします。
ニワトリ胚目を介して数異なったティッシュのような他の多くのボディ システムの相互作用を開発する複雑な器官であります。このメソッドにより、研究開発の高度な段階で特にこれらの組織の開発のです。たとえば、多層の網膜は神経系の発達を学ぶものに特に関心のあります。眼瞼、強膜、レンズ vitreal 体、角膜などの他の眼組織の研究を有効にする別の方法は研究者に利点が。鶏胚の目には、平らな骨、膜内骨誘導および脊椎動物1の骨化の研究のためのモデルとして使用できる強耳小骨のシリーズも含まれています。
現在、胚を研究するために使用するメソッド数があります。誘発抑制抗体または他阻害分子の2,3, 外科的移植4阻害剤で浸したマイクロ ビーズとエレクトロポレーション5レセプター遺伝子を使用することができますすべてのメソッドまたは胚の興味の蛋白質。同様のメソッドは、リポタンパクリパーゼ蛋白質に使用されます。これらのメソッドは、制限ではないです。たとえば、萌芽期の開発を変更する化学物質を使用している場合は、胎児に対する致死効果を評価しなければならないとこれの生存を確保するため十分な低用量でのアプリケーションのローカライズされたサイトに前述のメソッドの使用を制限、胚。
体外の組織培養研究に有機体の広い範囲で使用されています、上記の制限の一部をバイパスに使用することができます。たとえば、大腿骨6羽芽7、8、および手足9鶏のすべてを調べたマウス10および根の精巣と11植物の茎を持っている組織培養の方法を使用しています。これらのメソッドは温度を変動し、栄養素の可用性を変更する機能など、組織開発の制御の高度科学者を付与します。全胚から組織の分離では、はるかに少ないより高い濃度でグローバル規模で操作研究ができ、化学物質の致死的な影響を受け。体外培養のもう一つの顕著な利点は、組織の細胞環境の保全組織の配置は比較的変わらない、異なったティッシュのタイプ9間の相互作用を研究することが可能となっています。したがって、体外養殖開きますドア追加実験アプローチ体内またはovo のモデルでは利用できません。
現在、化学物質を使用して萌芽期鶏眼研究開発は特に困難です。初期胚胚体外膜数カバー胚、ミクロ粒子のニキビトリートメントまたは化学薬品の適用が困難それにつれて、さらに複雑なメソッドがすでに困難胚にも卵の内で非常にアクティブです。このプロトコルは、目およびその周囲の組織、また眼内の発達過程を検討する新たな機会を提供しながら、これらの障壁を排除することに簡単にアクセスできます。このプロトコルは、萌芽期の目の強膜の小骨の誘導の研究に設立されました。
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Protocol
注: 胚の段階、ハンバーガーとハミルトン12 (HH) ステージング テーブルを使用します。
1. 胚培養
- 受精鶏卵で 37 ° C ± 1 ° C ~ 40% 湿度、滅菌温度制御のインキュベーターで孵化させなさい。
- 卵 1 を有効に 1 日あたり x HH34 に孵化するようにし、(8 日後受精)。
2. 準備中と材料の殺菌
- 12 胚、蒸留水、0.85% ひよこ生理食塩水、12 ガラス ピペット、紙ペーパー、半多孔質フィルター紙の 24 2.5 cm × 2.5 cm の正方形および鋼線の 24 2.5 cm × 2.5 cm 正方形の 1 ボックスの 1 L の 2 L メッシュ下方に湾曲したエッジのオートクレーブ。材料を滅菌するオートクレーブで 121 ° C、15 分以上。
注: マテリアルのオートクレーブは事前に行うことができます。 - 側面、棚、ドアを拭くことによって 70% エタノールでインキュベーターを滅菌します。オートクレーブを含む場所 2 プラスチック容器に蒸留水湿度を維持するために孵化器の中。37 ° C ± 1 ° C ~ 40% 湿度に文化のインキュベーターを prewarm します。インキュベーターが完全に暗い;ドアが透明の場合は、アルミ箔でカバーします。
- 100 mL の培養液とペニシリンの 1 mL を prewarm 文化のインキュベーターでそれらを配置することによって。
- ペーパー タオルでワークスペースをカバーし、ベンチを 70% エタノールを噴霧して消毒します。同様の方法で 2 組の鉗子、解剖はさみ、かみそりの刃、70% エタノールとプラスチック スプーンを消毒します。
- 場所 12 滅菌 100 mm ペトリ皿と 24 滅菌 35 mm シャーレ用ベンチ。滅菌バッグでの使用まで、料理を確認します。
3. 胚の準備
注: この時点から文化の汚染を避けるために防塵マスクを着用します。細菌や真菌感染を台無しに文化とインキュベーターのすべての文化にすぐに広がっていることの危険性があります。
- 亀裂は、卵を開き、0.85% ひよこ生理食塩水を含む 100 mm のペトリ皿に胚を転送します。解剖学的特徴によると胚のハンバーガーとステージングのガイドライン12ハミルトンと胚を確認の段階は、HH34 にあります。
- 首を切り、二等分する殺菌かみそりの刃を使用して正中線で胚の頭。滅菌鉗子を使用して、脳を削除します。くちばしをそのまま。
4. 文化セットアップ
- 1 つの 100 mm ペトリ皿内 35 mm のペトリ皿の場所 2。
- 各 35 mm のペトリ皿の中のスチール ワイヤ メッシュを配置します。
- 鉗子を使用すると、上を向いて目を 2.5 cm × 2.5 cm 半多孔質フィルター紙に切断 2 分離の頭の 1 を転送します。組織が安全であり、それを少し傾けることによってオフにスリップしていませんを確認します。
- 眼組織とろ紙を 1 上眼組織の発生段階を作成する 35 mm ペトリ皿のスチール ワイヤ メッシュの上に置きます鉗子を使用して、慎重に。
- 4.3 や 4.4 他の半分の頭で手順を繰り返します。
- 滅菌ガラス ピペットを使用して、フィルター ペーパーのレベルに到達するまでそれぞれ 35 mm のペトリ皿に直接培養液を追加することは慎重に。栄養培地で半分の頭を漬けないでください。
- 10,000 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシンの 50 μ L を各シャーレで培養液に追加します。
- 小さな広場にティッシュ ペーパーの部分を折るし、100 mm ペトリ皿の中に置きます。オートクレーブの蒸留水で湿ら します。
- 4 日間で 37 ° C ± 1 ° C ~ 40% 湿度滅菌、暗いインキュベーターに培養皿を配置します。
- それぞれの胚の手順 3 と 4 を繰り返します。
注: 胚の数必要によって異なります特定の実験;ここでは、12 の胚のプロトコルについて述べる。
5 文化の維持
- 一日に一回、新鮮なオートクレーブ蒸留水でインキュベーターでプラスチック容器をトップします。
- 細菌や真菌感染症のすべての文化を毎日確認します。文化の崩壊を持っているまたは媒体が色を変更された感染しています。感染しているすべての文化を破棄します。
6. 固定
- インキュベーターからすべての料理を削除次の養殖。
- ピンセットのペアを使用して、慎重組織を引き裂くように注意して、ろ紙から目を取り外します。
- 4% のパラホルムアルデヒドの 4 ° C で一晩リン酸緩衝生理食塩水 x 1 または室温で一晩 10% 中性緩衝ホルマリンの眼組織を修正します。
- リン酸緩衝生理食塩水 x 1 に 4 ° C で組織を保存します。
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Representative Results
このメソッドを使用すると、ニワトリ胚目でく体外の開発 (HH34) の 8 日目から 4 日間培養します。Ovo の開発の 4 日間は、HH38 に対応します。
この培養方法は、まぶた (図 1 b) に目を囲む羽芽の開発をサポートします。これらの羽芽はありません現在ovo でHH34 で前培養 (図 1 a)、ovoに13 (図 1)、養殖期間中に羽芽の開発を開始することを示します。まぶたと瞬膜成長、養殖 (図 1 b).の中に目をカバーするためまぶたは表示後の in vitro培養よりも HH34 で培養開始時より成熟した (図 1 a) が、HH38 でより発展途上 (図 1)。このデータは、いくつかの小さな遅延はあるものの、萌芽期の開発の重要な側面をサポートされていることを示しています。
培養後、結膜乳頭 (13-14 上皮突起の過渡リング)、行動発達のイベントがカルチャでサポートされていることを示す、まだ別のランドマークを表示する目の前方の部分を解剖しました。通常、これらの乳頭は、完全に HH34 によって形成される (図 1)、彼らは、基になる間充織; で成体濃縮を誘発する、時間の経過とともに縮退彼らは HH381 (図 1 階) で消えます。我々 のデータは、この変性は体外(図 1E) が発生し、次の開発のovo でパターン乳頭の平坦化が先行を示しています。ただし、縮合を無染色の in vitroサンプルで表示されないとは異なり HH38 で (図 1 階)。これらの縮合の14; の誘導をさらに評価するために早期の骨芽細胞活性を検出するアルカリ ・ フォスファターゼ染色を用いてください。このプロセスは、 ovo で結膜乳頭の変性症と一緒に発生します。HH34 で始まる成体濃縮の誘導体外進むことが (図 1)、アルカリホスファターゼ染色 (図 1 H) によって証明されます。これらの縮合ただし、大きいではなく HH3814 (図 1I)、彼らは、再び示している開発にわずかな遅延があること。予想では養殖の表す萌芽期の開発の約 2 日の 4 日間それ故に約 50% の遅延が発生します。総称して、これらの結果を示す誘導と強膜濃縮、膜内骨の開発はサポートされている体外とまぶたの成長など羽芽の形成発達のプロセスがでを続行体外。
図 1.形態的特性の in vitro 目、HH34 目、HH38 目を培養します。A ~ Fはステンド グラスとG -私が強膜濃縮内でアクティブな骨芽細胞を区別するアルカリフォスファターゼ (AP) 酵素染色します。A D、および HH34 の養殖期間の開始時のGを目。B E、 H後の in vitro培養 4 日目を見る。 C F 卵の培養、HH38 で 4 日後の目を表示します。すべての目は横方向に表示されます。(A)、結膜乳頭が角膜の周囲のリングで表示されます。アスタリスクは、乳頭 #12 フォームに最初の 1 つを示します。矢印は目の鼻の領域で瞼の端を示します。(B) 結膜乳頭に平坦化して退化しはじめた。矢印は、羽芽の成長を示します。(C)、結膜乳頭は完全に退化したし、まぶたと瞬膜で覆われています。開矢印は目の鼻の領域で瞼の端を示します。実線の矢印は、羽芽の成長を示します。(D) A HH34 目の解剖の前方部分。アスタリスクは、乳頭 #12 を示します。(E) A は、HH34 + 4 は、体外の平面的な乳頭を示す目の前方部分を解剖しました。時間領域 (実線矢印) で乳頭縮退; はじめたこれらはリングで最も古い乳頭です。(F) A まぶたと瞬膜の削除、すべての乳頭が退化したことを示す HH38 目の解剖の前方部分。破線は、2 つの隣接する無染色縮合の位置を概説します。 (G) A HH34 目染色 AP 誘導の開始を示す非常に小さな成体濃縮を示します。(H) は HH34 + 4 目は成体濃縮を成長、拡大を示す AP のステンド グラス。(私) A HH38 目は、大きな成体濃縮を示す AP のステンド グラス。すべてのスケール バーは、1 ミリメートルこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
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Discussion
このプロトコル (HH34) は 8 日目胚から鶏の目の成長を達成するために確立された組織培養技術を活用の in vitroの 4 日間。このグリッド培養法は、もともと Trowell15によって記述されていた。ニワトリ胚目15の分離組織層の間の誘導信号を研究するためにグリッドを持つ半多孔性膜を利用したピントとホールの 1991年研究16からプロトコルを最適化されています。このメソッドを使用して、ゴキブリは培養 14 日間の古い鶏大腿骨6です。このメソッドは、マウス組織6,17を養殖に効果的な実証されても。ろ紙の使用は、飽和または組織を浸せず効果的に媒体からの栄養素を取る組織ことをプロトコルの成功に不可欠です。
栄養培地で適切な pH は最適な成長にとって重要です。媒体は、pH の変化を容易に検出することができますでは、インジケーター、利点として生理学的 pH およびフェノールレッド培地での使用に近いはずです。無血清メディアを使用することができますと毎日メディアを変更する必要はありませんし、結果には影響しません。プロトコルは、市販媒体を使用して開発された (参照材料表)、アミノ酸とグルコース; の高レベルを含むメディアのそれ以上の補充は必要ありません。このプロトコルを使用して貧しい人々 の組織の成長のほとんどの出現は、栄養媒体の不適切な pH でいずれかまたは汚染されたときに発生しました。
目は、生き残るし、まで 4 日間体外、萌芽期日 8、最適な条件でプロトコルを実行するときに開始の成長できます。このプロトコルの制限の 1 つは培養 4 日先以降生存に影響します。したがって、長い期間にわたる発達プロセス プロトコルへの変更が必要になります。プロトコルのもう一つの制限は、アクティブな血流と血管新生の不在です。血管は9組織への栄養素の配信だけではなく多くの発達プロセスに対して重要な経由で体外毛細管組織がかかっているフィルター ペーパーを通してを達成であります。
このプロトコルは、すべての臓器または組織体外の大きい部分の研究開発に使用できます。脊椎動物の器官が非常に複雑なと彼らの開発は多くの異なる時空間パターンによって調整されます。これらの発達の経路の研究は、それらを調節する信号を処理する機能に依存します。現在の方法は、比較的小さな、ローカライズされた領域に、胚性致死を避けるために十分に低い濃度にこの操作を制限します。たとえば、文化18またはウィンドウ卵19操作を実施する方法の全体の鶏胚を培養のovo exメソッドは限られただけまたは全体のいずれかの胚は扱われなければならない、致死性を引き起こすことができる、という点で、小型のローカライズされた領域が扱われます。ここで提示されたプロトコルの利点は、萌芽期の実行可能性に影響を与えずにすべての臓器や組織の大量にことこれらの信号の効果を学ぶことができますです。このプロトコルでは、以前のプロトコル15のように炭酸ガスの補充は必要ありません。我々 が観察した開発の遅れは利点急速な発達過程を学ぶことができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者感謝したいグレゴリー ・ ハラー (サスカチュワン大学) プロトコルの開発に彼の準備作業のため。著者も感謝したいニコラス ・ ジョーンズ (マウント ・ サン ・ ヴァンサン ・大学) 彼の技術的専門知識と撮影と原稿のオーディオ/ビジュアル部分の生産に関するご案内のため。ダニエル ・ アンドリュースは、MSVU と自然科学工学研究会議のカナダ (レベル)経由から学部学生研究奨励賞の資金によって支えられました。タマラ A. フランツ スティーブンオデンダールスーターは、レベル検出補助金によってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
References
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).
