Summary
Aquí, presentamos un organotypic cultivo protocolo para crecer órganos embrionarios de pollo en vitro. Usando este método, el desarrollo de tejidos de embrión de pollo puede ser estudiado, manteniendo un alto grado de control sobre el ambiente de cultivo.
Abstract
El pollo embrionario se utiliza comúnmente como un organismo modelo confiable para el desarrollo de vertebrados. Su accesibilidad e incubación corto período es ideal para la experimentación. En la actualidad, el estudio de estas vías de desarrollo en el embrión de pollo se lleva a cabo mediante la aplicación de inhibidores y las drogas en los sitios localizados y a bajas concentraciones usando una variedad de métodos. In vitro cultivo de tejidos es una técnica que permite el estudio de los tejidos separados del organismo anfitrión, mientras que al mismo tiempo pasando por alto muchas de las limitaciones físicas presentes al trabajar con embriones enteros, como la susceptibilidad de los embriones a altas dosis de químicos potencialmente letales. Aquí, presentamos un organotypic cultivo de protocolo para el cultivo del embrionario pollo media cabeza en vitro, que presenta nuevas oportunidades para el examen de los procesos de desarrollo más allá de los métodos actualmente establecidos.
Introduction
El embrionario pollo (Gallus gallus) es un organismo de excelente modelo comúnmente utilizado en el campo de la biología. Su período de incubación es de aproximadamente 21 días y muchos huevos pueden incubarse simultáneamente, haciendo experimentación rápida y eficiente. Tal vez lo más importante, el embrión es también fácilmente manipulable, permite el estudio exhaustivo de procesos clave del desarrollo y de los genes y las proteínas que impulsan estos procesos.
El ojo de embrión de pollo es un órgano complejo que se desarrolla a través de la interacción de un número de diferentes tejidos similares a muchos otros sistemas del cuerpo. Este método permite el estudio del desarrollo de estos tejidos, especialmente en etapas avanzadas de desarrollo. Por ejemplo, la retina varias capas puede ser de particular interés para quienes estudian el desarrollo del sistema nervioso. Métodos alternativos que permiten el estudio de otros tejidos oculares como la córnea, el cuerpo de vitreal, la lente, la esclera y los párpados son de beneficio para los investigadores. El ojo de embrión de pollo también contiene una serie de huesos planos, los osículos esclerales, que pueden ser utilizados como un modelo para el estudio de inducción ósea intramembranosa y osificación en vertebrados1.
Actualmente, hay una serie de métodos utilizados para estudiar el desarrollo embrionario. Microinyecciones de anticuerpos inhibitorios u otras moléculas inhibidoras2,3, implantaron quirúrgicamente microbeads en inhibidor de la4, y electroporación5 son todos los métodos que pueden utilizarse para regular a la baja los genes o proteínas de interés en un embrión. Métodos similares se utilizan a las proteínas del alza. Estos métodos no están sin sus limitaciones. Por ejemplo, al utilizar productos químicos para alterar el desarrollo embrionario, los efectos letales sobre los embriones deben ser evaluados, y esto limita el uso de los métodos mencionados para sitios localizados de la aplicación en dosis lo suficientemente bajas para asegurar la supervivencia de la embrión.
In vitro cultivo de tejidos se ha utilizado en una amplia gama de organismos para el estudio de desarrollo y se puede utilizar para saltarse algunas de las limitaciones mencionadas. Por ejemplo, los fémures6pluma yemas7,8y miembros9 del pollo se todos han estudiado usando métodos de cultivo de tejidos como los testículos del ratón10 y las raíces y tallos de las plantas11. Estos métodos otorgan a los científicos un alto grado de control sobre el desarrollo de tejido, tales como la capacidad de fluctuar la temperatura y alterar la disponibilidad de nutrientes. El aislamiento de los tejidos del embrión entero también hace mucho menos susceptible a los efectos letales de sustancias químicas, lo que permite estudios de manipulación a escala global en concentraciones más altas. Otra ventaja notable de cultivo en vitro es la preservación del medio ambiente celular del tejido; el arreglo de los tejidos permanece relativamente sin cambios, lo que es posible estudiar las interacciones entre tipos de tejido diferentes9. Así, en vitro cultivo abre puertas a más experimental acercamientos no disponible en modelos en vivo o en ovo .
Actualmente, estudiando el desarrollo del ojo de pollo embrionario utilizando productos químicos es particularmente desafiante. Cubierta de una serie de membranas extraembrionarias del embrión, lo que hace difícil aplicar microesferas o productos químicos. el embrión también es muy activo dentro del huevo como se pone más viejo, complicando aún más un método ya difícil. Este protocolo permite el acceso fácil para el ojo y los tejidos circundantes, eliminando esas barreras, mientras que también proporciona nuevas oportunidades para examinar los procesos del desarrollo dentro del ojo. Este protocolo fue establecido para estudiar la inducción de los osículos esclerales en el ojo embrionario.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: Para las etapas de embrión, utilizar el Hamburger y Hamilton12 (HH) escenificando la mesa.
1. embrión incubación
- Incubar huevos de gallina fecundados en una incubadora estéril, control de temperatura a 37 ° C ± 1 ° C y 40% humedad.
- Gire los huevos 1 x por día y que puedan incubar a HH34 (8 días tras la fertilización).
2. preparación y esterilización de los materiales
- 12 embriones, autoclave 2 L de agua destilada, 1 L de solución salina al 0,85% pollo, 12 pipetas de vidrio, 1 caja de papel de fumar, 24 2,5 x 2,5 cm cuadrados semi porosa del papel de filtro y plazas 24 2,5 x 2,5 cm de alambre de acero del acoplamiento con los bordes curvados hacia abajo. Para esterilizar los materiales, autoclave a 121 ° C durante al menos 15 minutos.
Nota: El autoclave de los materiales puede hacerse por adelantado. - Esterilizar la incubadora con etanol al 70% por limpiar los lados estantes y puerta. Coloque 2 recipientes de plástico que contienen autoclave destilación agua dentro de la incubadora para mantener la humedad. Precaliente la incubadora de cultivo a 37 ° C ± 1 ° C y 40% humedad. La incubadora esté completamente a oscuras; Si la puerta es transparente, cubrirlo con papel de aluminio.
- Precaliente 100 mL de medio nutritivo y 1 mL de la penicilina por colocarlos en la incubadora de la cultura.
- Cubrir el espacio de trabajo con una toalla de papel y esterilizar el Banco rociando con etanol al 70%. Esterilizar 2 pares de pinzas, tijeras de disección, una hoja de afeitar y una cuchara de plástico con etanol al 70% de manera similar.
- Lugar 12 placas de Petri estériles de 100 mm y 24 placas de Petri estériles de 35 mm en el Banco para el uso. Mantener los platos en una bolsa estéril hasta su utilización.
3. embrión preparación
Nota: De aquí en adelante, usar una máscara protectora de polvo para evitar la contaminación de las culturas. Una infección bacteriana o micótica arruinará la cultura y existe un riesgo de separarse rápidamente a todas las culturas en la incubadora.
- Crack abre el huevo y transferir el embrión a un plato de Petri de 100 mm que contiene solución salina al 0,85% chick. Etapa del embrión según las características anatómicas descritas en la Hamburger y Hamilton escenificando las pautas12 y confirmar el embrión está en HH34.
- Cortar el cuello y luego atraviesan la cabeza del embrión en la línea media usando una navaja esterilizada. Utilizando pinzas estériles, quite el cerebro. Deje intacto el pico.
4. cultura configuración
- 2 lugar de los platos de Petri de 35 mm dentro de un plato de Petri de 100 mm.
- Colocar una malla de alambre de acero dentro de cada plato de Petri de 35 mm.
- Con unas pinzas, transferencia 1 de las cabezas bisecadas una pieza de 2,5 x 2,5 cm semi poroso papel de filtro con el ojo mirando hacia arriba. Asegúrese de que el tejido es seguro y no se deslice fuera inclinándola ligeramente.
- Utilizando pinzas, coloque con cuidado el tejido ocular y el papel de filtro sobre la malla de alambre de acero en 1 de los platos de Petri de 35 mm, creando un escenario levantado con el tejido del ojo en la parte superior.
- Repita los pasos 4.3 y 4.4, con la otra media cabeza.
- Cuidadosamente con una pipeta de vidrio estéril, añadir medio nutritivo directamente en cada plato de Petri de 35 mm hasta alcanzar el nivel del papel de filtro. No sumerja la cabeza medio en el medio nutritivo.
- Añadir 50 μl de 10.000 U/mL de penicilina-estreptomicina en el medio nutritivo en cada placa de Petri.
- Doble un pedazo de papel de tejido en una pequeña plaza y colocar dentro de la caja de Petri de 100 mm. Humedecer con agua destilada esterilizada.
- Coloque la placa de cultivo en la incubadora a 37 ° C ± 1 ° C y 40% humedad estéril, oscurezca durante 4 días.
- Repita los pasos 3 y 4 para cada embrión.
Nota: El número de embriones necesarios dependerá de la experiencia específica; aquí, describimos el protocolo de 12 embriones.
5. cultura mantenimiento
- Una vez al día, depositar los envases de plástico en la incubadora con agua destilada esterilizada.
- Diario comprobar todas las culturas para las infecciones bacterianas o por hongos. Infectan a las culturas que se han desintegrado o que el medio ha cambiado de color. Deseche todas las culturas que están infectadas.
6. fijación
- Siguiente cultivo, retirar todos los platos de la incubadora.
- Usando un par de pinzas, eliminar suavemente el ojo desde el papel de filtro, teniendo cuidado de no para rasgar el tejido.
- Fijar el tejido ocular en paraformaldehído al 4% en el 1 x de solución salina con tampón fosfato durante la noche a 4 ° C o en formalina tamponada neutra 10% durante la noche a temperatura ambiente.
- Guarde el tejido a 4 ° C en 1 x solución salina con tampón fosfato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Usando este método, un ojo de embrión de pollo puede cultivarse del día 8 de su desarrollo (HH34) en vitro durante 4 días. Cuatro días de desarrollo en ovo corresponde a HH38.
Este método de cultivo apoya el desarrollo de brotes de plumas que rodean el ojo y los párpados (figura 1B). Estos brotes de plumas no están presentes en ovo en HH34 antes el cultivo (figura 1A), indicando que desarrollo del cogollo de pluma se inicia durante el período de cultivo, ya que es de ovo13 (figura 1). Los párpados y membrana nictitante crecen para cubrir el ojo durante el cultivo (figura 1B). Los párpados aparecen más maduros después de la en vitro cultivo que al inicio del cultivo en el HH34 (figura 1A) pero están menos desarrollados que en HH38 (figura 1). Estos datos muestran que los aspectos claves del desarrollo embrionario son compatibles, aunque con algún pequeño retraso.
Después de cultivo, diseccionamos la porción anterior del ojo para mostrar las papilas conjuntivales (un anillo transitoria de protuberancias epiteliales 13-14), que actúan como una señal que indica que los eventos del desarrollo se apoya en la cultura. Por lo general, estas papilas están completamente formadas por HH34 (figura 1) y degenerado con el tiempo como inducen condensations de skeletogenic en el mesénquima subyacente; desaparecen por HH381 (Figura 1F). Nuestros datos muestran que esta degeneración ocurre en vitro (Figura 1E) y está precedida por un aplanamiento de las papilas siguiendo el patrón de ovo de desarrollo. Sin mancha condensaciones, sin embargo, no son visibles en las muestras en vitro , a diferencia de en HH38 (Figura 1F). Se utilizó la coloración, la fosfatasa alcalina que detecta actividad osteoblástica precoz para evaluar más la inducción de estas condensaciones14; Este proceso se produce junto con la degeneración de las papilas conjuntivales en ovo. La inducción de las condensaciones de skeletogenic, que comienza a las HH34 (figura 1), proceder en vitro evidenciada por la fosfatasa alcalina tinción (figura 1 H). Estas condensaciones, sin embargo, son no tan grande como son HH3814 (figura 1I), otra vez indicando que hay un pequeño retraso en el desarrollo. Estimamos que los 4 días de cultivo representan aproximadamente 2 días de desarrollo embrionario; por lo tanto, un retraso de 50%. Colectivamente, estos resultados demuestran que la inducción y el desarrollo de los huesos intramembranosa, las condensaciones esclerales, es soportado en vitro y que los procesos de desarrollo como crecimiento del párpado y de la formación de cogollos de pluma siga en Vitro.
Figura 1 . Características morfológicas de los en vitro cultivadas ojos, ojos HH34 y HH38 ojos. A - F son sin mancha y G - se tiñen por la enzima fosfatasa alcalina (FA) distinguir osteoblastos activos dentro de las condensaciones esclerales. A, Dy G ver ojos en el inicio del período de cultivo en HH34. B, Ey H muestran ojos después de 4 días de cultivo en vitro . C, Fy muestran ojos después de 4 días en ovo de cultivo, en HH38. Todos los ojos son vistos lateralmente. (A) la conjuntival papilas son visibles en un anillo que rodea la córnea. Un asterisco indica papila #12, la primera de ellas a la forma. La flecha indica el borde del párpado en la región nasal del ojo. (B) las papilas conjuntivales han aplanado y empezado a degenerar. La flecha indica un creciente brote de pluma. (C) la conjuntival papilas han degenerado totalmente y están cubiertas por los párpados y la membrana nictitante. La flecha abierta indica el borde del párpado en la región nasal del ojo. La flecha sólida indica un creciente brote de pluma. (D) una disecada la porción anterior del ojo HH34. El asterisco indica papila #12. (E) A disecar la porción anterior de un HH34 + 4 en vitro ojo mostrando papilas aplanadas. Las papilas en la región temporal (flecha sólida) han empezado a degenerar; Estas son las papilas más viejo en el ring. Funa porción anterior disecada de HH38 ojos con los párpados y nictitante quitadas, mostrando que todas las papilas han degenerado. Las líneas discontinuas del esquema la posición de dos condensaciones sin manchas adyacentes. (G) A HH34 ojo manchado para AP mostrando condensaciones skeletogenic muy pequeño indicativo del comienzo de la inducción. (H) A HH34 + 4 ojo manchado para AP muestra ampliada, creciendo skeletogenic condensaciones. () A HH38 ojo manchado para AP mostrando skeletogenic grandes condensaciones. Todas las barras de escala son 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo hace uso de técnicas de cultivo del tejido establecido para lograr el crecimiento de un ojo de pollo del día embrionario 8 (HH34) en vitro por 4 días. Este método de cultivo de rejilla fue descrito originalmente por Trowell15. Hemos optimizado un protocolo de Pinto y Hall 1991 estudio16 utilizando una membrana semi porosa con la red para el estudio de señales inductivas entre capas de tejido separadas del embrionario pollo ojo15. Usando este método, Roach cultivados 14 días de edad del fémur pollo6. Este método también ha demostrado ser eficaz en cultivo de tejidos de ratón6,17. El uso del papel de filtro es fundamental para el éxito del protocolo ya que ayuda a los tejidos para tomar nutrientes del medio con eficacia sin saturar o inmersión del tejido.
Medio nutritivo a un pH adecuado es crítico para un crecimiento óptimo. El medio debe ser en o cerca del pH fisiológico y el uso de rojo de fenol en el medio como un indicador proporciona una ventaja en que se pueden detectar fácilmente cambios en el pH. Pueden utilizarse medios libres de suero, y cambiando los medios de comunicación diariamente no es necesario y no afecta los resultados. El protocolo fue desarrollado utilizando un medio comercialmente disponible (véase Tabla de materiales), que contiene altos niveles de aminoácidos y glucosa; no es necesario ningún suplemento adicional de los medios de comunicación. Más apariciones de pobre crecimiento mediante este protocolo se produjeron cuando los medios nutrientes era a un pH inadecuado o contaminación.
El ojo puede sobrevivir y crecer para un máximo de 4 días en vitro, a partir de embrionario día 8, cuando el protocolo se lleva a cabo en condiciones óptimas. Una limitación de este protocolo es que la supervivencia se ven afectada más allá de 4 días de cultivo. Así, los procesos de desarrollo que abarcan un período de tiempo más largo requiere modificaciones en el protocolo. Otra limitación del protocolo es la ausencia de un flujo de sangre activa y vascularización. Los vasos sanguíneos son importantes para muchos procesos del desarrollo, no sólo para la entrega de nutrientes al tejido9, que se consigue in vitro vía acción capilar a través del papel de filtro sobre los que descansa el tejido.
Este protocolo se puede utilizar para estudiar el desarrollo de órganos enteros o trozos de tejidos en vitro. Órganos vertebrados son muy complejos, y su desarrollo está regulado por muchos patrones espacio-temporales distintos. El estudio de estas vías de desarrollo se basa en la habilidad de manipular las señales que les regulan. Los métodos actuales limitan esta manipulación a áreas relativamente pequeñas, localizadas y a concentraciones lo suficientemente bajas para evitar la mortalidad embrionaria. Por ejemplo, el método ex ovo de cultivo el embrión de pollo entero en cultura18 o el método de ventana huevos19 para llevar a cabo manipulaciones están limitados en que sea el embrión todo debe ser tratado, que pueden causar mortalidad o solo un pequeña área localizada se trata. La ventaja del protocolo presentado aquí es que se puede estudiar el efecto de estas señales en órganos enteros o grandes cantidades de tejido, sin afectar la viabilidad embrionaria. Este protocolo no requiere ninguna suplementación con dióxido de carbono como en protocolos anteriores15. El retraso en el desarrollo que observamos es una ventaja que se pueden estudiar los procesos de desarrollo rápidos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer Gregory Haller (Universidad de Mount Saint Vincent) para sus trabajos preliminares en el desarrollo del protocolo. Los autores también gustaría agradecer Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) por su experiencia técnica y asistencia con el rodaje y producción de la parte audiovisual del manuscrito. Daniel Andrews fue apoyado por fondos de MSVU y las ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC) a través de un premio de investigación del estudiante de pregrado. Tamara A. Franz-Odendaal es apoyada por una subvención de descubrimiento de NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
References
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).
