Summary
Här presenterar vi en organotypic odling protokoll för att odla embryonala kyckling organ in vitro-. Med den här metoden, kan utvecklingen av embryonala kyckling vävnad studeras, samtidigt som en hög grad av kontroll över kultur miljö.
Abstract
Den embryonala kycklingen används ofta som en tillförlitlig modellorganism för ryggradsdjur utveckling. Dess tillgänglighet och kort inkubation gör period den idealisk för experiment. Studien av dessa utvecklingsmässiga vägar i kyckling embryot genomförs för närvarande genom att tillämpa-hämmare och läkemedel vid lokaliserade platser och vid låga koncentrationer med hjälp av olika metoder. In vitro vävnad odling är en teknik som möjliggör studier av vävnader som separerade från värd organismen, men samtidigt kringgå många av de fysiska begränsningarna som är närvarande när du arbetar med hela embryon, såsom känslighet av embryon till höga doser av potentiellt dödliga kemikalier. Här presenterar vi en organotypic odling protokoll för odla embryonala kyckling halva huvudet i in vitro-som presenterar nya möjligheter för undersökning av utvecklingsprocesser utanför de för närvarande etablerade metoderna.
Introduction
Den embryonala kycklingen (Gallus gallus) är en utmärkt modellorganism som vanligen används inom biologi. Dess inkubationstiden är ungefär 21 dagar och många ägg kan inkuberas samtidigt, att göra experiment snabbt och effektivt. Kanske viktigast av allt, är embryot också lätt manipuleras, aktivera den omfattande studien av viktiga utvecklingsprocesser och av gener och proteiner som kör dessa processer.
Det embryonala kyckling ögat är en komplexa organ som utvecklar via samverkan mellan ett antal olika vävnader liknar många andra kroppssystem. Denna metod möjliggör studier av utvecklingen av dessa vävnader, särskilt i avancerade stadier av utveckling. Till exempel kan flerskikts näthinnan vara av särskilt intresse för de som studerar utvecklingen av nervsystemet. Alternativa metoder som möjliggör studier av andra ögat vävnader såsom hornhinnan, vitreal kroppen, linsen, sklera och ögonlocken är till nytta för forskare. Kyckling embryonala ögat innehåller också en rad platta ben, de skleral hörselbenen, som kan användas som en modell för studier av intramembranous ben induktion och förbening i ryggradsdjur1.
För närvarande finns det ett antal metoder som används för att studera embryonal utveckling. Microinjections av hämmande antikroppar eller andra hämmande molekyler2,3, implanterad mikrokulor indränkt i hämmare4och elektroporation5 är alla metoder som kan användas till downregulate gener eller proteiner av intresse i ett embryo. Liknande metoder används för att upregulate proteiner. Dessa metoder är inte utan sina begränsningar. Till exempel när du använder kemikalier för att förändra den embryonala utvecklingen, dödliga effekterna på embryot måste utvärderas, och detta begränsar användningen av de ovan nämnda metoder till lokaliserade platser i ansökan vid doser som är tillräckligt låg för att garantera överlevnadsförmågan för den embryo.
In vitro vävnad odling har använts i en lång rad organismer för att studera utvecklingen och kan användas för att kringgå några av de ovannämnda begränsningarna. Till exempel den platsen6, fjäder knoppar7,8, och lemmar9 av kyckling har alla studerats med vävnad odling metoder, som har testiklarna mus10 och rötter och stjälkar av växter11. Dessa metoder ge forskare en hög grad av kontroll över vävnad utveckling, såsom förmågan att variera temperaturen och förändra näringsämnen tillgängligheten. Isolering av vävnad från hela embryot gör det också långt mindre mottagliga för dödliga effekterna av kemikalier, vilket möjliggör manipulation studier på en global skala vid högre koncentrationer. En annan anmärkningsvärd fördel av in vitro- odling är bevarandet av vävnadens cellulära miljön; arrangemanget av vävnader är relativt oförändrad, vilket gör det möjligt att studera interaktioner mellan olika vävnad typer9. Således metoder in vitro- odling öppnar dörrar till ytterligare experimentella inte finns i i vivo eller ovo modeller.
För närvarande är studerar utvecklingen av embryonala kyckling ögat med hjälp av kemikalier särskilt utmanande. Ett antal embryoniskt membran täcka embryot, vilket gör det svårt att tillämpa mikrokulor eller kemikalier; embryot är också mycket aktiva inom ägget som det blir äldre, ytterligare komplicerar en redan svår metod. Detta protokoll möjliggör enkel tillgång till ögat och dess omgivande vävnader, att undanröja dessa hinder, samtidigt som nya möjligheter att undersöka utvecklingsprocesser i ögat. Detta protokoll fastställdes för att studera induktionen av de skleral hörselbenen i embryonala ögat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: För embryo stadier, utnyttja den hamburgare och Hamilton12 (HH) mellanlagring tabell.
1. embryot inkubation
- Inkubera befruktade hönsägg i en steril, temperaturkontrollerad inkubator vid 37 ° C ± 1 ° C och ~ 40% luftfuktighet.
- Slå ägg 1 x per dag och tillåta dem att Inkubera till HH34 (8 dagar efter befruktning).
2. upprättande och sterilisering av material
- För 12 embryon, autoklav 2 L destillerat vatten, 1 L 0,85% chick koksaltlösning, 12 Glas Pipetter, 1 låda med papper vävnad, 24 2,5 x 2,5 cm fyrkanter semi porösa filtrerpapper och 24 2,5 x 2,5 cm kvadrater av ståltråd mesh med kanterna böjda nedåt. Att sterilisera material, autoklav dem vid 121 ° C under minst 15 minuter.
Obs: Autoklaveringen av material kan göras i förväg. - Sterilisera inkubatorn med 70% etanol genom att torka sidor, hyllor, och dörren. Plats 2 plastbehållare innehållande Ånghärdad destillerat vatten inuti inkubatorn att behålla fuktigheten. Prewarm kultur inkubatorn till 37 ° C ± 1 ° C och ~ 40% luftfuktighet. Inkubatorn är helt mörkt; om dörren är öppen, täck den med aluminiumfolie.
- Prewarm 100 mL näringsmedium och 1 mL av penicillin genom att placera dem i kultur inkubatorn.
- Täck arbetsytan med en pappershandduk och sterilisera bänken genom besprutning med 70% etanol. Sterilisera 2 par pincett, dissektion sax, ett rakblad och en plastsked med 70% etanol på ett liknande sätt.
- Plats 12 steril 100 mm petriskålar och 24 steril 35 mm petriskålar på bänken för användning. Säkerställa rätterna kvarstå i en steril påse till användning.
3. embryot förberedelse
Obs: Från denna punkt framåt, bära en skyddande damm ansiktsmask för att undvika kontaminering kulturerna. En bakterie- eller svampinfektioner infektion kommer att förstöra kulturen och det finns en risk att den sprider sig snabbt till alla kulturer i inkubatorn.
- Spricka öppna ägget och överföra embryot till en 100 mm petriskål innehållande 0,85% chick saltlösning. Skede embryot efter de anatomiska funktionerna beskrivs i hamburgare och Hamilton mellanstationer riktlinjer12 och bekräfta embryot är på HH34.
- Skär halsen och sedan Tudela huvudet av embryot vid mittlinjen med en steriliserad rakblad. Använd steril pincett, ta bort hjärnan. Lämna näbben intakt.
4. kultur Setup
- Plats 2 av de 35 mm Petriskålarna inuti en 100 mm petriskål.
- Placera en ståltråd mesh inuti varje 35 mm petriskål.
- Använda pincett, överföra 1 tudelas huvuden till en bit av 2,5 x 2,5 cm semi porösa filterpapper med ögat uppåt. Se till att vävnaden är säkert och inte glider av genom att luta den lite.
- Med pincett, noggrant placera ögat vävnad och pappersfiltret ovanpå ståltråd maskstorleken i 1 av de 35 mm petriskålar, skapa en upphöjd scen med ögat vävnad på toppen.
- Upprepa steg 4.3 och 4.4 med andra halva huvudet.
- Med steril glas pipett, tillsätt försiktigt näringsmedium direkt i varje 35 mm petriskål tills det når samma nivå av pappersfiltret. Sänk inte halva huvudet i näringsmedium.
- Tillsätt 50 µL av 10.000 U/mL penicillin-streptomycin till näringsämnen medium i varje petriskål.
- Vik en bit vävnad papper till ett litet torg och placera den inuti 100 mm petriskål. Fukta det med Ånghärdad destillerat vatten.
- Placera skålen kultur i steril, mörka inkubatorn vid 37 ° C ± 1 ° C och ~ 40% luftfuktighet i upp till 4 dagar.
- Upprepa steg 3 och 4 för varje embryo.
Anmärkning: Antalet embryon behövs beror på det specifika experimentet; Här beskriver vi protokollet för 12 embryon.
5. kultur underhåll
- En gång per dag, fyll upp plast behållarna i inkubatorn med färska, lättbetong och autoklaverad destillerat vatten.
- Dagligen kontrollera alla kulturer för bakterie-eller svampinfektioner. Kulturer som har desintegrerade eller där mediet har ändrat färg är infekterade. Kassera alla kulturer som är infekterade.
6. fixering
- Efter odling, ta bort alla rätter från inkubatorn.
- Använder ett par pincett, ta försiktigt bort ögat från pappersfiltret, noga med att inte riva vävnaden.
- Fixa ögonvävnaden i 4% PARAFORMALDEHYD i 1 x fosfatbuffrad saltlösning övernattning på 4 ° C eller i 10% neutral buffrad formalin över natten i rumstemperatur.
- Lagra vävnaden vid 4 ° C i 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med den här metoden kan embryonala kyckling öga vara odlade från dag 8 i dess utveckling (HH34) in vitro- 4 dagar. Fyra dagar i ovo utveckling motsvarar HH38.
Den här culturing metoden stöder utvecklingen av fjäder knoppar kring ögonen och på ögonlocken (figur 1B). Dessa fjäder knoppar är inte närvarande i ovo på HH34 före odling (figur 1A), vilket indikerar att fjäder knopp utveckling inleds under den culturing perioden, eftersom det är i ovo13 (figur 1 c). Ögonlock och nictitating membran växa att täcka ögat under det culturing (figur 1B). Ögonlocken visas mer mogen efter in vitro- odling än i början av odling på HH34 (figur 1A) men är mindre utvecklad än på HH38 (figur 1 c). Dessa data visar att de viktigaste aspekterna av embryonal utveckling stöds, om än med vissa liten fördröjning.
Efter odling, dissekerade vi den främre delen av ögat för att visa den konjunktivala papiller (en övergående ring av 13-14 epitelial utskjutande delar), som fungerar som ännu ett landmärke som anger att de utvecklande händelserna stöds i kultur. Dessa papiller bildas normalt, fullt av HH34 (figur 1 d), och degenererade över tid eftersom de inducerar skeletogenic condensations i den underliggande mesenchyme; de försvinner genom HH381 (figur 1F). Våra data visar att denna degeneration uppstår i vitro (figur 1E) och föregås av en utplaning av den papiller efter det i ovo utvecklingsmönstret. Ofärgade condensations, dock är inte synliga i in vitro- proven, till skillnad från vid HH38 (figur 1F). Vi använde alkaliskt fosfatas färgning, som upptäcker tidig osteoblast verksamhet för att ytterligare bedöma induktion av dessa condensations14; Detta sker parallellt med degeneration av konjunktival papiller i ovo. Induktion av de skeletogenic condensations, som börjar vid HH34 (figur 1 g), ägnar sig åt in vitro- vilket framgår av den alkaliska fosfataser färgning (figur 1 H). Dessa condensations, dock indikerar inte så stora som de är HH3814 (figur 1I), igen att det finns en liten fördröjning i utvecklingen. Vi uppskattar att de 4 dagarna odlingsskålar representerar cirka 2 dagar av embryonal utveckling; därav en fördröjning på cirka 50%. Sammantaget dessa resultat visar att de induktion och utveckling av intramembranous ben, de skleral condensations, är stöds in vitro- och att utvecklingsprocesser som ögonlocket tillväxt och fjäder knopp bildandet fortsätta i vitro.
Figur 1 . Morfologiska kännetecken av in vitro- odlade ögon, HH34 ögon och HH38 ögon. A - F är ofärgade och G - jag färgas för enzymet alkaliskt fosfatas (AP) att skilja aktiv osteoblaster inom de skleral condensations. A, Doch G Visa ögon i början av perioden culturing på HH34. B, Eoch H Visa ögon efter 4 dagar av in vitro- odling. C, Foch jag Visa ögon efter 4 dagars i ovo odling, på HH38. Alla ögon är tittade på sido. (A) den konjunktival papiller är synlig i en ring runt hornhinnan. En asterisk anger papilla #12, den första en till formuläret. Pilen anger kanten av ögonlocket i regionen nasal i ögat. (B) den konjunktivala papiller har tillplattade och börjat urarta. Pilen anger en växande fjäder knopp. (C) den konjunktival papiller degenererade helt och omfattas av ögonlock och nictitating membran. Öppna pilen anger kanten av ögonlocket i regionen nasal i ögat. Fast pilen anger en växande fjäder knopp. (D) ett dissekerade främre delen av HH34 ögat. Asterisken indikerar papilla #12. (E) A dissekerade främre delen av en HH34 + 4 i vitro ögat visar tillplattad papiller. Papiller i den temporala regionen (heldragen pil) har börjat urarta; Detta är den äldsta papiller i ringen. (F), A dissekerade främre delen av ett HH38 öga med ögonlock och nictitating membran bort, visar att alla papiller har urartat. De streckade linjerna kontur positionen för två intilliggande ofärgade condensations. (G) A HH34 öga målat för AP visar mycket liten skeletogenic condensations vägledande för början av induktion. (H) A HH34 + 4 öga målat för AP visar utvidgade, växande skeletogenic condensations. (jag) A HH38 öga målat för AP visar stora skeletogenic condensations. Alla skala barer är 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll använder sig av etablerade vävnad odling tekniker för att uppnå tillväxt av en kyckling öga från embryonala dag 8 (HH34) in vitro- 4 dagar. Grid-odling metoden beskrevs ursprungligen av Trowell15. Vi har optimerat ett protokoll från Pinto och Halls 1991 studie16 utnyttja en semi porösa membran med nätet för att studera induktiva signaler mellan separerade vävnad skikt av embryonala kyckling ögat15. Med den här metoden odlade mört 14 - dag-gammal kyckling lårben6. Denna metod har också visat sig effektiv i odling mus vävnader6,17. Användning av pappersfiltret är avgörande för framgång i protokollet eftersom det hjälper vävnaden att ta upp näringsämnen från medlet effektivt utan mättar eller submersing vävnaden.
Näringsmedium vid rätt pH är avgörande för optimal tillväxt. Mediet bör vid eller nära fysiologiska pH-värdet och användningen av fenolrött medium som en indikator ger en fördel i att pH förändringar kan upptäckas lätt. Serum-fria medier kan användas, och ändra media dagligen är inte nödvändigt och påverkar inte resultatet. Protokollet har utvecklats med ett kommersiellt tillgängligt medium (se Tabell för material), som innehåller höga halter av aminosyror och glukos; det behövs ingen ytterligare tillskott av media. De flesta förekomster av dålig vävnadstillväxt använder det här protokollet uppstod när näringssubstrat var antingen vid en felaktig pH eller förorenade.
Ögat kan överleva och växa för upp till 4 dagar i vitro, börjar på embryonala dag 8, när protokollet utförs under optimala förhållanden. En begränsning i detta protokoll är att överlevnadsförmåga påverkas mer än 4 dagar av odling. Således kommer att de utvecklingsprocesser som sträcker sig över en längre tidsram kräva ändringar i protokollet. En annan begränsning i protokollet är frånvaron av en aktiv blodflödet och vaskularisering. Blodkärl är viktiga för många utvecklingsprocesser, inte bara för leverans av näringsämnen till den vävnad9, vilket är uppnått in vitro-via kapillärkraft genom pappersfiltret som vävnaden vilar.
Detta protokoll kan användas för att studera utvecklingen av hela organ eller stora bitar av vävnad i vitro. Ryggradsdjur organ är mycket komplexa och deras utveckling är reglerad av många distinkta spatiotemporal mönster. Studien av dessa utvecklingsmässiga vägar är beroende av förmågan att manipulera de signaler som reglerar dem. Nuvarande metoder begränsa denna manipulation att relativt små, lokaliserade områden och tillräckligt låga koncentrationer att undvika embryonal dödlighet. Till exempel metoden ex ovo för odling hela kyckling embryot i kultur18 eller metoden till fönster ägg19 att genomföra manipulationer är begränsade i att antingen hela embryot måste behandlas, vilket kan orsaka dödlighet, eller bara en litet lokalt område behandlas. Fördelen med det protokoll som presenteras här är att effekten av dessa signaler kan studeras på hela organ eller stora mängder vävnad, utan att påverka embryonala livskraft. Detta protokoll kräver inte någon komplettering med koldioxid som tidigare protokoll15. Förseningen i utvecklingen som vi observerat är en fördel i att snabba utvecklingsprocesser kan studeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Gregory Haller (Mount Saint Vincent universitet) för hans förarbete i utvecklingen av protokollet. Författarna vill även tacka Nicholas Jones (Mount Saint Vincent universitet) för sin tekniska expertis och hjälp med filmning och produktion av audiovisuellt portion av manuskriptet. Daniel Andrews stöddes av finansiering från MSVU och naturvetenskaplig och teknisk forskning rådet av Kanada (NSERC) via en Undergraduate Student Research Award. Tamara A. Franz-Odendaal stöds av en NSERC Discovery Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
References
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).
