Summary
Hier presenteren we een organotypic kweken protocol om te groeien van embryonale kip organen in vitro. Met deze methode kan de ontwikkeling van embryonale kip weefsel worden bestudeerd, met behoud van een hoge mate van controle over de omgeving van de cultuur.
Abstract
De embryonale kip wordt het meestal gebruikt als een betrouwbare modelorganisme voor gewervelde ontwikkeling. De toegankelijkheid en de korte incubatie maakt periode het ideaal voor experimenten. Op dit moment is de studie van deze ontwikkelings trajecten in het embryo van de kip is olv remmers en geneesmiddelen op gelokaliseerde sites en bij lage concentraties, met behulp van een verscheidenheid van methoden toe te passen. In vitro kweken van weefsel is een techniek waarmee de studie van weefsels gescheiden van het ontvangende organisme, terwijl gelijktijdig het omzeilen van veel van de fysieke beperkingen aanwezig bij het werken met hele embryo's, zoals de gevoeligheid van de embryo 's hoge doses van potentieel dodelijke chemische stoffen. Hier presenteren we een organotypic protocol voor het kweken van de embryonale kip een half hoofd in vitro, die nieuwe mogelijkheden voor het onderzoek van ontwikkelings processen buiten de momenteel gevestigde methoden biedt te kweken.
Introduction
De embryonale kip (Gallus gallus) is een uitstekende modelorganisme gebruikte op het gebied van biologie. De incubatietijd is ongeveer 21 dagen en veel eicellen tegelijk kunnen worden geïncubeerd experimenten maken snel en efficiënt. Misschien belangrijkst, is het embryo ook gemakkelijk gemanipuleerd, waardoor de uitgebreide studie van belangrijke ontwikkelings processen en van de genen en eiwitten die deze processen drijven.
Het oog van de embryonale kip is een complex orgaan dat via de interactie van een aantal verschillende weefsels lijkt op veel andere lichaamssystemen ontwikkelt. Deze methode kan de studie van de ontwikkeling van deze weefsels, met name in geavanceerde stadia van ontwikkeling. Het multi-gelaagde netvlies kan bijvoorbeeld worden van bijzonder belang aan die het bestuderen van de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Alternatieve methoden waarmee de studie van andere weefsels van het oog zoals het hoornvlies, het lichaam van de vitreal, de lens, de sclera en de oogleden zijn van belang aan onderzoekers. Het kip embryonale oog bevat ook een reeks van platte botten, de scleral gehoorbeentjes, die kunnen worden gebruikt als een model voor de studie van intramembranous bot inductie en ossificatie in gewervelde dieren1.
Momenteel zijn er een aantal methoden die zijn gebruikt bij het bestuderen van de embryonale ontwikkeling. Microinjections van remmende antilichamen of andere remmende molecules2,3, chirurgisch geïmplanteerde microbeads gedrenkt in remmer4, en electroporation5 zijn alle methoden die kunnen worden gebruikt om downregulate genen of eiwitten van belang in een embryo. Soortgelijke methoden worden gebruikt om upregulate eiwitten. Deze methoden zijn niet zonder hun beperkingen. Bijvoorbeeld, wanneer het gebruik van chemische stoffen te wijzigen van de embryonale ontwikkeling, de letale effecten op het embryo moeten worden geëvalueerd, en dit beperkt het gebruik van de bovengenoemde methoden om gelokaliseerde websites van toepassing bij doses laag genoeg is om ervoor te zorgen het overlevingsvermogen van de embryo.
In vitro kweken van weefsel is gebruikt in een breed scala van organismen te bestuderen van ontwikkeling en kan worden gebruikt om sommige van de bovengenoemde beperkingen te omzeilen. Bijvoorbeeld, zijn de dijbenen6,7,8van de toppen van de veren en ledematen,9 van de kip alle bestudeerd met behulp van weefsel kweken methoden, evenals de teelballen van de muis10 en de wortels en stengels van planten11. Deze methoden geven wetenschappers een hoge mate van controle over de weefsel ontwikkeling, zoals de mogelijkheid te schommelen van de temperatuur en het veranderen van de beschikbaarheid van nutriënten. Het isolement van het weefsel van het hele embryo maakt het ook veel minder gevoelig is voor de letale effecten van chemische stoffen, waardoor manipulatie studies op wereldschaal bij hogere concentraties. Een ander opmerkelijk voordeel van in vitro kweken is de instandhouding van het weefsel van cellulaire omgeving; de rangschikking van weefsels blijft relatief ongewijzigd, waardoor het mogelijk is om te studeren van de interacties tussen de verschillende weefsel typen9. Dus, in vitro kweken opent deuren extra experimentele benaderingen niet beschikbaar in een in vivo of in ovo modellen.
Op dit moment vormt een bijzondere uitdaging voor het bestuderen van de ontwikkeling van het oog van de embryonale kip met behulp van chemische stoffen. Een aantal extraembryonic membranen betrekking hebben op het embryo, waardoor het moeilijk om toe te passen microbeads of chemische stoffen; het embryo is ook zeer actief binnen het ei als het ouder, verdere complicerende een toch al moeilijke methode. Dit protocol biedt gemakkelijk toegang tot het oog en de omliggende weefsels, opheffing van deze belemmeringen, waarbij ook nieuwe mogelijkheden te onderzoeken van de ontwikkelings processen in het oog. Dit protocol werd opgericht om te bestuderen van de inductie van de scleral gehoorbeentjes in het embryonale oog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Voor embryo stadia, gebruik maken van de Hamburger en Hamilton12 (HH) tijdelijke tabel.
1. de embryo incubatie
- Incubeer bevruchte kippeneieren in een steriele, temperatuurgevoelig incubator bij 37 ° C ± 1 ° C en ~ 40% vochtigheid.
- Zet de eieren 1 x per dag en laten Incubeer tot HH34 (8 dagen na bevruchting).
2. voorbereiding en sterilisatie van de materialen
- Voor 12 embryo's autoclaaf 2 L van gedestilleerd water, 1 L van 0,85% chick saline, 12 glazen pipetten, 1 doos papier weefsel, 24 2,5 x 2,5 cm vierkantjes semi-poreuze filtreerpapier en 24 2,5 x 2,5 cm vierkantjes van staaldraad gaas met de randen gekromd naar beneden. Aan de materialen, steriliseren autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 15 minuten hen.
Opmerking: De autoclaaf van de materialen kan worden gedaan op voorhand. - De incubator met 70% ethanol steriliseren door af te vegen de kanten, de planken en de deur. Plaats 2 plastic containers met gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd water binnen de incubator om vochtigheid. Prewarm de cultuur incubator tot 37 ° C ± 1 ° C en ~ 40% vochtigheid. Zorgen dat de incubator is volledig donker; Als de deur transparant is, bedek het met zilverpapier.
- Prewarm 100 mL voedingsbodem en 1 mL penicilline door ze te plaatsen in de incubator cultuur.
- Bedek de werkruimte met een papieren handdoek en steriliseren van de Bank in het spuiten met 70% ethanol. Steriliseren 2 paar pincet, schaar van de dissectie, een scheermesje en een plastic lepel met 70% ethanol op een vergelijkbare manier.
- Petrischalen van plek 12 steriel 100 mm en 24 steriele 35 mm petrischalen op de Bank voor gebruik. Zorg ervoor dat de gerechten blijven in een steriele zak tot gebruik.
3. de embryo voorbereiding
Opmerking: Vanaf dit moment draag een gezichtsmasker beschermende stof om verontreiniging van de culturen te vermijden. Een bacteriële of schimmel infectie zal ruïneren de cultuur en er is een risico op het snel verspreiden naar alle culturen in de incubator.
- Barst het ei te openen en het embryo overbrengen in een 100 mm petrischaal met zoutoplossing van 0,85% kuiken. Fase het embryo volgens de anatomische eigenschappen beschreven in de Hamburger en Hamilton enscenering van de richtsnoeren12 en bevestigen van het embryo is op HH34.
- Snijd de nek en vervolgens bisect het hoofd van het embryo in de schouderstreek met behulp van een gesteriliseerde scheermesje. Met behulp van steriele pincet, verwijderen de hersenen. De snavel intact laten.
4. cultuur Setup
- Plaats 2 van de 35 mm petrischalen binnen een 100 mm petrischaal.
- Plaats een stalen gaas binnen elke petrischaal 35 mm.
- Met behulp van Tang, 1 van de bisected koppen overbrengen naar een stuk semi-poreuze filtreerpapier van 2,5 x 2,5 cm met het oog naar boven. Het weefsel is beveiligd en niet glijden door het kantelen van het enigszins zorgen.
- Pincet zorgvuldig plaats met het oogweefsel en het filtreerpapier op de top van de stalen gaas in 1 van de 35 mm petrischalen, het creëren van een verhoogd podium met het oogweefsel bovenop.
- Herhaal stap 4.3 en 4.4 met de andere helft hoofd.
- Met behulp van een steriele glazen pipet, voeg zorgvuldig voedingsbodem direct in elke petrischaal 35 mm totdat zij het niveau van het koffiefilter tot. Dompel niet de halve kop in de voedingsbodem.
- 50 µL van 10.000 U/mL penicilline-streptomycine toevoegen aan de voedingsbodem in elke petrischaal.
- Vouw een stukje weefsel papier in een vierkantje en plaats deze binnen de 100 mm petrischaal. Bevochtig het met gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd water.
- Zet de schotel van cultuur in de steriele, donkere incubator bij 37 ° C ± 1 ° C en ~ 40% vochtigheid voor tot 4 dagen.
- Herhaal stap 3 en 4 voor elk embryo.
Opmerking: Het aantal embryo's nodig zal afhangen van de specifieke experiment; Hier beschrijven we het protocol voor 12 embryo's.
5. cultuur onderhoud
- Eenmaal per dag, herladen de plastic containers in de incubator met verse, gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd water.
- Dagelijks controleren alle culturen voor bacteriële of schimmel infecties. Culturen die hebben gedesintegreerd of waarin het medium is veranderd van kleur zijn besmet. Gooi alle culturen die geïnfecteerd zijn.
6. fixatie
- Alle gerechten uit de incubator na kweken, verwijderen.
- Met behulp van een paar pincet, zachtjes verwijderen het oog uit het koffiefilter, verzorgen niet te scheuren van het weefsel.
- Corrigeer het oogweefsel in 4% paraformaldehyde in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing 's nachts bij 4 ° C of in 10% neutraal gebufferde formaline bij kamertemperatuur 's nachts.
- Het weefsel bij 4 ° C in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing opslaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van deze methode, kan gaten embryonale kip worden gekweekt van dag 8 van haar ontwikkeling (HH34) in vitro voor 4 dagen. Vier dagen in ovo ontwikkeling komt overeen met HH38.
Deze kweken methode ondersteunt de ontwikkeling van veer toppen rondom het oog en op de oogleden (figuur 1B). Deze veer toppen zijn niet aanwezig in ovo op HH34 voorafgaand aan het kweken (figuur 1A), die aangeeft dat de veer topontwikkeling deperiode kweken, wordt gestart omdat er in ovo13 (Figuur 1 c). De oogleden en nictitating membrane groeien ter dekking van het oog tijdens het kweken (figuur 1B). De oogleden verschijnen meer volwassen na het in vitro kweken dan aan het begin van het kweken op HH34 (figuur 1A), maar zijn minder ontwikkeld dan bij HH38 (Figuur 1 c). Deze gegevens blijkt dat de belangrijkste aspecten van de embryonale ontwikkeling worden gesteund, zij het met enkele kleine vertraging.
Na het kweken, ontleed we het voorste gedeelte van het oog om te laten zien van de conjunctivale mannetjesvissen (een voorbijgaande ring van 13-14 epitheliale uitsteeksels), die als de zoveelste landmark die aangeeft fungeren dat de ontwikkelingstoxiciteit gebeurtenissen worden ondersteund in cultuur. Meestal worden deze mannetjesvissen volledig gevormd door de HH34 (Figuur 1 d), en ontaard na verloop van tijd als ze skeletogenic condensatie in de onderliggende mesenchym induceren; ze verdwijnen door HH381 (figuur 1F). Onze gegevens blijkt dat dit degeneratie voorkomt in vitro (figuur 1E) en wordt voorafgegaan door een afvlakking van de papillen na het patroon in ovo van ontwikkeling. Onbevlekt condensatie, echter, zijn niet zichtbaar in de monsters in vitro , in tegenstelling tot bij HH38 (figuur 1F). We gebruikten alkalische fosfatase kleuring, die vroege osteoblast activiteit detecteert voor de verdere beoordeling van de inductie van deze condensatie14; Dit gebeurt naast de degeneratie van de conjunctivale mannetjesvissen in ovo. De inductie van de condensatie van skeletogenic, die bij HH34 begint (figuur 1G), in vitro gaat verder zoals blijkt uit de alkalische fosfatase kleuring (Figuur 1 H). Deze condensatie, echter zijn niet zo groot als op HH3814 (figuur 1I), nogmaals wordt gemeld dat er een kleine vertraging in de ontwikkeling is. Wij schatten dat de 4 dagen van kweken vertegenwoordigen ongeveer 2 dagen van embryonale ontwikkeling; Vandaar een vertraging van ongeveer 50%. Deze resultaten tonen aan dat de inductie en de ontwikkeling van de intramembranous botten, de scleral condensatie, collectief, is ondersteunde in vitro en dat de ontwikkelings processen zoals ooglid groei en veer bud vorming overgaan in vitro.
Figuur 1 . Morfologische kenmerken van in vitro gekweekt ogen, HH34 ogen en HH38 ogen. A - F zijn onbevlekt en G - Ik voor het enzym alkalisch fosfatase (AP) te onderscheiden van actieve botcellen binnen de scleral condensatie zijn gekleurd. A, Den G Toon ogen aan het begin van de periode van het kweken op HH34. B, Een H Toon ogen na 4 dagen van in vitro kweken. C, Fen ik Toon ogen na 4 dagen in ovo kweken, op HH38. Alle ogen bekeken lateraal. (A) de conjunctivale papillen zichtbaar zijn in een ring rondom het hoornvlies. Een asterisk geeft aan Papil #12, de eerste die vorm. De pijl geeft de rand van het ooglid nasale regio van het oog. (B) de conjunctivale mannetjesvissen hebben afgevlakt en begonnen te ontaarden. De pijl geeft een toenemende veer-knop. (C) de conjunctivale mannetjesvissen hebben volledig gedegenereerd en vallen onder de oogleden en de nictitating membrane. De open pijl geeft de rand van het ooglid nasale regio van het oog. De solide pijl geeft een toenemende veer-knop. (D) een ontleed voorste gedeelte van het oog van de HH34. Het sterretje geeft aan Papil #12. (E) A ontleed voorste deel van een HH34 + 4 in vitro oog tonen afgevlakte papillen. De papillen in de temporele regio (gevulde pijl) zijn begonnen te ontaarden; Dit zijn de oudste mannetjesvissen in de ring. (F) A ontleed voorste gedeelte van een oog van de HH38 met de oogleden en nictitating membranen verwijderd, waaruit blijkt dat alle mannetjesvissen hebben verworden. De onderbroken lijnen geven de positie van twee aangrenzende onbevlekt condensatie. (G) A HH34 oog gekleurd voor AP tonen zeer kleine skeletogenic condensatie indicatie van het begin van inductie. (H) A HH34 + 4 oog gekleurd voor AP toont uitgebreide, groeiende skeletogenic condensatie. (ik) A HH38 oog gekleurd voor AP tonen grote skeletogenic condensatie. Alle schaal bars zijn 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol maakt gebruik van gevestigde weefsel kweken van technieken om de groei van een oog van de kip van embryonale dag 8 (HH34) in vitro voor 4 dagen. Dit raster-kweken-methode werd oorspronkelijk beschreven door Trowell15. We een protocol van Pinto en Hall's 1991 studie16 met behulp van een semi-poreuze membraan met het raster om te studeren inductieve signalen tussen de lagen van de gescheiden weefsel van de embryonale kip oog15geoptimaliseerd. Met behulp van deze methode, Roach gekweekt 14 - dagen oude kip dijbeen6. Deze methode heeft ook bewezen effectief in het kweken van6,17van de weefsels van de muis. Het gebruik van het koffiefilter is cruciaal voor het succes van het protocol, aangezien het helpt het weefsel te nemen voedingsstoffen uit het medium effectief zonder verzadigen of submersing van het weefsel.
Voedingsbodem bij een goede pH is cruciaal voor optimale groei. Het medium moet op of in de buurt van de fysiologische pH, en het gebruik van fenol rood in het medium, zoals een indicator een voordeel biedt in dat pH-veranderingen kunnen gemakkelijk worden opgespoord. Serumvrij medium kan worden gebruikt, en veranderen de media dagelijks is niet nodig en heeft geen invloed op de resultaten. Het protocol werd ontwikkeld op basis van een commercieel beschikbaar medium (Zie Tabel of Materials), die bevat hoge niveaus van aminozuren en glucose; geen verdere suppletie van de media is nodig. De meeste exemplaren van arme weefsel groei met behulp van dit protocol is opgetreden toen de voedingsbodems ofwel bij een onjuiste pH was of besmet.
Het oog kan overleven en groeien voor maximaal 4 dagen in vitro, basisgewicht van embryonale dag 8, wanneer het protocol wordt uitgevoerd onder optimale omstandigheden. Een beperking van dit protocol is dat de overlevingskansen na 4 dagen van kweken wordt beïnvloed. Dus, de ontwikkelings processen die zich uitstrekken over een langere termijn vergt aangebrachte wijzigingen in het protocol. Een andere beperking van het protocol is het ontbreken van een actieve doorbloeding en vorming. Bloedvaten zijn belangrijk voor veel ontwikkelings processen, niet alleen voor de levering van voedingsstoffen aan de weefsels9, die wordt bereikt via in-vitro capillair actie door middel van het koffiefilter waarop het weefsel steunt.
Dit protocol kan worden gebruikt om de ontwikkeling van hele organen of grote stukken van het weefsel in vitrostudie. Gewervelde organen zijn zeer complex, en hun ontwikkeling wordt gereguleerd door vele verschillende Spatio patronen. De studie van deze ontwikkelings trajecten is afhankelijk van de mogelijkheid om het manipuleren van de signalen die hen regelen. Huidige methoden beperken deze manipulatie aan relatief kleine, gelokaliseerde gebieden, en laag genoeg concentraties te vermijden embryonale letaliteit. Bijvoorbeeld, de ex ovo -methode voor het kweken van het embryo van de hele kip in cultuur18 of de methode venster eieren19 te voeren manipulaties zijn beperkt in ofwel het gehele embryo moet worden behandeld, wat kan leiden tot letaliteit, of alleen een kleine gelokaliseerde gebied wordt behandeld. Het voordeel van het hier gepresenteerde protocol is dat het effect van deze signalen kan worden bestudeerd op hele organen of grote hoeveelheden weefsel, zonder gevolgen voor de embryonale levensvatbaarheid. Dit protocol is niet vereist voor elke suppletie met kooldioxide zoals in eerdere protocollen15. De vertraging in de ontwikkeling die we waargenomen is een voordeel dat snelle ontwikkelings processen kunnen bestudeerd worden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Gregory Haller (Mount Saint Vincent University) voor zijn voorbereidend werk in de ontwikkeling van het protocol. De auteurs ook bedank Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) voor zijn technische expertise en hulp bij het filmen en produceren van het audio/visuele deel van het manuscript. Daniel Andrews werd gesteund door de financiering van MSVU en de natuurlijke Sciences and Engineering Research Raad van Canada (NSERC) via een Undergraduate Student Research Award. Tamara A. Franz-Odendaal wordt gesteund door een subsidie voor de ontdekking van NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
References
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).
