Summary
Her presenterer vi en organotypic dyrking protokollen å vokse embryonale kylling organer i vitro. Bruker denne metoden, kan utviklingen av embryonale kylling vev studeres, samtidig opprettholde en høy grad av kontroll over kultur miljøet.
Abstract
Embryonale kylling er ofte brukt som en pålitelig modell organisme for virveldyrenes utvikling. Sin tilgjengelighet og kort inkubering gjør periode det ideelt for eksperimentering. Foreløpig er studiet av disse utviklingsmessige stier i kylling embryoet utført ved å bruke hemmere og narkotika lokaliserte områder og lave konsentrasjoner bruker en rekke metoder. In vitro vev dyrking er en teknikk som muliggjør studiet av vev atskilt fra verten organisme, mens samtidig omgåelsen mange av fysiske begrensninger når arbeider med hele embryoer, som mottakelighet av embryo til høye doser av potensielt dødelig kjemikalier. Her presenterer vi en organotypic dyrking protokoll for dyrking av embryonale chicken halv hodet i vitro, som presenterer nye muligheter for undersøkelse av utviklingsprosesser utover metodene er etablert.
Introduction
Embryonale kylling (Gallus gallus) er en utmerket modell organisme brukte innen biologi. Inkubasjonstiden er omtrent 21 dager og mange egg kan være inkubert samtidig gjør eksperimentering raskt og effektivt. Kanskje viktigst, embryoet også enkelt endres, slik at den omfattende undersøkelsen av viktige utviklingsprosesser og gener og proteiner som driver disse prosessene.
Embryonale kylling øyet er en komplisert organ som utvikler via samspillet av en rekke forskjellige vev lik for mange andre kroppens systemer. Denne metoden muliggjør studiet av utviklingen av disse vev, særlig i avanserte stadier av utviklingen. For eksempel kan flerlags netthinnen være av spesiell interesse for de som studerer utvikling av nervesystemet. Alternative metoder som muliggjør studiet av andre øye vev som hornhinnen, vitreal kroppen, linsen, sclera og øyelokkene er til nytte for forskere. Kylling embryonale øyet inneholder også en rekke flate bein, Innbukking ossicles, som kan brukes som modell for studiet av intramembranous bein induksjon og forbening i virveldyr1.
Foreløpig er det en rekke metoder for å studere embryonale utvikling. Microinjections hemmende antistoffer eller andre hemmende molekyler2,3, implantert kirurgisk microbeads dynket i hemmer4og electroporation5 er alle metoder som kan brukes til å downregulate gener eller proteiner av interesse i et embryo. Lignende metoder brukes upregulate proteiner. Disse metodene er ikke uten sine begrensninger. For eksempel når du bruker kjemikalier endre embryonale utviklingen, dødelige effekten på fosteret må vurderes, og dette begrenser bruken av de nevnte metodene lokaliserte områder av programmet ved doser lav nok til å sikre survivability av den fosteret.
In vitro vev dyrking er brukt i en rekke organismer for å studere utviklingen og kan brukes til å omgå noen av nevnte begrensningene. For eksempel har i femora6, fjær knopper7,8og lemmer9 av kylling alle blitt studert ved hjelp av vev dyrking metoder, som har prøvene av musen10 og røtter og stengler planter11. Disse metodene gi forskerne en høy grad av kontroll over den vev utviklingen, svinger temperaturen og endre næringsstoffer tilgjengeligheten. Isolasjon av vev fra hele fosteret gjør det også langt mindre utsatt for dødelige virkningen av kjemikalier, dermed muliggjør manipulasjon studier på en global skala på høyere konsentrasjoner. En annen betydelig fordel av i vitro dyrking er bevaring av vevets mobilnettet miljø; ordningen av vev forblir relativt uendret, gjør det mulig å studere interaksjonen mellom ulike vev typer9. Dermed tilnærminger i vitro dyrking åpner dørene til flere eksperimentelle ikke tilgjengelig i vivo eller ovo modeller.
For tiden er studerer utviklingen av embryonale kylling øyet bruker kjemikalier spesielt utfordrende. En rekke extraembryonic membraner dekke embryoet, gjør det vanskelig å bruke microbeads eller kjemikalier; fosteret er også svært aktiv i egg som det blir eldre, ytterligere kompliserende en allerede vanskelig metode. Denne protokollen gir enkel tilgang til øyet og dens omkringliggende vev, eliminere disse barrierene, gir nye muligheter til å undersøke utviklingsprosesser i øyet. Denne protokollen ble etablert for å studere induksjon av Innbukking ossicles i embryonale øyet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: For fosteret stadier, benytte de Hamburger og Hamilton12 (HH) avholder tabell.
1. embryo inkubasjon
- Ruge befruktet kylling egg i en steril, temperaturkontrollert inkubator på 37 ° C ± 1 ° C og ~ 40% fuktighet.
- Slå egg 1 x per dag og tillate dem å ruge til HH34 (8 dager etter befruktning).
2. forberedelse og sterilisering av materialet
- For 12 embryoer, autoklav 2 L destillert vann, 1 L 0,85% chick saltvann, 12 glass Pipetter, 1 eske med papir vev, 24 2,5 cm x 2,5 cm kvadratene av delvis porøse filter papir og 24 2,5 cm x 2,5 cm kvadrater av ståltråd mesh med kantene buet nedover. Å sterilisere materialer, autoklav dem ved 121 ° C i minst 15 minutter.
Merk: Autoklavering av materialene kan gjøres på forhånd. - Sterilisere inkubator med 70% etanol ved å tørke den sider, hyller, og dør. Sted 2 plastbeholdere som inneholder autoklaveres destillert vann inni inkubator å opprettholde fuktighet. Prewarm kultur inkubator til 37 ° C ± 1 ° C og ~ 40% fuktighet. Inkubatoren er helt mørkt; Hvis døren er gjennomsiktig, dekke det med tinfoil.
- Prewarm 100 mL av næringsstoffer medium og 1 mL av penicillin ved å plassere dem i kultur inkubator.
- Dekke arbeidsområdet med et papirhåndkle og sterilisere benken ved å spraye den med 70% etanol. Sterilisere tang, disseksjon saks, et barberblad og en plast skje med 70% etanol 2 par på en lignende måte.
- Sted 12 sterilt 100 mm Petri retter og 24 sterilt 35 mm Petri retter på benken for bruk. Sikre rettene forblir i et sterilt bag før bruk.
3. embryo forberedelse
Merk: Fra dette punktet og fremover, bære en beskyttende støv ansiktsmaske for å unngå forurensende kulturer. En bakterier og sopp infeksjon vil ødelegge kultur og det er en risiko for det sprer seg raskt til alle kulturer i inkubator.
- Sprekk åpen egg og overføre embryoet til et 100 mm Petriskål inneholder 0,85% chick saltvann. Fosteret i henhold til anatomiske funksjonene beskrevet i Hamburger og Hamilton staging retningslinjer12 og bekrefte embryoet er HH34.
- Deretter halvere leder av embryoet på midtlinjen bruker et sterilisert barberblad kuttet halsen. Ved hjelp av sterile pinsett, fjerne hjernen. La nebbet intakt.
4. kultur oppsett
- Sted 2 av de 35 mm Petri rettene innenfor en 100 mm Petriskål.
- Plass en stål netting inne hver 35 mm Petriskål.
- Ved hjelp av pinsett, overføre 1 av bisected hodene til 2,5 cm x 2,5 cm semi porøse filter papir med øynene vendt oppover. Sikre vevet er sikker og ikke slip av ved å vippe den litt.
- Ved hjelp av pinsett, forsiktig plassere øye vev og filter papir på stål netting i 1 i 35 mm Petri retter, opprette en hevet scene med øyevevet på toppen.
- Gjenta trinn 4.3 og 4.4 med andre halvparten hodet.
- Bruker en steril glass pipette, nøye legge næringsstoffer medium direkte til hver 35 mm Petriskål før den når nivået av filter papir. Ikke dykke halv hodet i nærings medium.
- Legge til 50 µL av 10.000 U/mL penicillin-streptomycin næringsstoffer mediet i hver Petriskål.
- Kaste et stykke silkepapir til en liten firkant og plassere den i 100 mm Petriskål. Fukte den med autoklaveres destillert vann.
- Plass kultur rett inn i den sterile, mørk inkubatoren på 37 ° C ± 1 ° C og ~ 40% fuktighet i opptil 4 dager.
- Gjenta trinn 3 og 4 for hver fosteret.
Merk: Hvor mange embryoer nødvendig avhenger på bestemte eksperimentet. Her beskriver vi protokollen for 12 embryoer.
5. kultur vedlikehold
- En gang per dag, fylle opp plastbeholdere i inkubator med friske, autoklaveres destillert vann.
- Daglig sjekke alle kulturer for bakterier og sopp-infeksjoner. Kulturer som har oppløst eller der mediet er endret fargen er infisert. Forkaste alle kulturer som er infisert.
6. fiksering
- Etter dyrking, fjerne alle retter fra inkubator.
- Med en tang, forsiktig fjerne øyet fra filter papir, ta vare ikke for å rive vevet.
- Fikse øye vev på 4% paraformaldehyde i 1 x fosfat-bufret saline overnatting på 4 ° C eller 10% nøytrale fullbufrede formalin over natten i romtemperatur.
- Lagre vev på 4 ° C i 1 x fosfat-bufret saltvann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruker denne metoden, kan øye embryonale kylling kultivert fra dag 8 av sin utvikling (HH34) i vitro for 4 dager. Fire dager i ovo utvikling tilsvarer HH38.
Denne culturing metoden støtter utviklingen av fjær knopper rundt øyet og på øyelokkene (figur 1B). Disse fjær knopper er ikke tilstede i ovo på HH34 før dyrking (figur 1A), indikerer at fjær bud utvikling startes under culturing periode, som i ovo13 (figur 1 c). Øyelokk og nictitating membran vokse å dekke øynene under den culturing (figur 1B). Øyelokkene vises mer moden etter i vitro dyrking enn ved starten av dyrking på HH34 (figur 1A), men er mindre utviklet enn på HH38 (figur 1 c). Dataene viser at de viktigste aspektene av embryonale utvikling som støttes, men med en liten forsinkelse.
Etter dyrking, dissekert vi den fremre delen av øyet for å vise de conjunctival papillae (en forbigående ring av 13-14 epithelial utstikkende deler), som fungerer som enda en landemerke indikerer at utviklingsmessige hendelsene støttes i kultur. Vanligvis disse papillae er fullt dannet av HH34 (figur 1 d), og degenerert over tid som de induserer skeletogenic kondensasjoner i den underliggende mesenchyme; de forsvinner HH381 (figur 1F). Våre data viser at denne degenerasjon skjer i vitro (figur 1E) og innledes med en sammenslåing av papillae følgende i ovo -mønster av utvikling. Unstained kvinne kondensasjoner, men er ikke synlige i i vitro utvalgene, i motsetning til på HH38 (figur 1F). Vi brukte alkalisk fosfatase flekker, som oppdager tidlig osteoblast aktivitet for å vurdere videre induksjon av disse kondensasjoner14; Dette skjer langs degenerering av conjunctival papillae i ovo. Induksjon av skeletogenic kondensasjoner, som starter ved HH34 (figur 1G), betyr videre i vitro som gjenspeiles av isoenzymer flekker (figur 1 H). Disse kondensasjoner, men er ikke så stor som de er HH3814 (figur 1I), igjen indikerer at det er en liten forsinkelse i utviklingen. Vi anslår at 4 dager med dyrking representerer ca 2 dager av embryonale utvikling; derfor en forsinkelse på ca 50%. Samlet disse resultatene viser at den induksjon og utvikling av intramembranous bein, Innbukking kondensasjoner, er støttet i vitro og utviklingsprosesser som øyelokket vekst og fjær bud dannelse gå i vitro.
Figur 1 . Morfologiske kjennetegn av i vitro kultivert øyne, HH34 øyne og HH38 øyne. A - F er unstained kvinne og G - jeg er farget for alkalisk fosfatase (AP) enzymet skille aktiv osteoblasts i Innbukking kondensasjoner. A, Dog G Vis øyne ved starten av den culturing perioden på HH34. B, E, og H Vis øyne etter 4 dager i vitro dyrking. C, F, og jeg viser øyne etter 4 dager i ovo dyrking, på HH38. Alle øyne vises sidelengs. (A) den conjunctival papillae vises i en ring rundt hornhinnen. En stjerne angir papilla #12, den første som skjemaet. Pilen viser kanten av øyelokket i regionen nese i øyet. (B) conjunctival papillae har flatet og begynt å degenerert. Pilen viser en økende fjær bud. (C) den conjunctival papillae har helt utartet og dekkes av øyelokkene og nictitating membranen. Åpne pilen viser kanten av øyelokket i regionen nese i øyet. Solid pilen viser en økende fjær bud. (D) en dissekert fremre delen av HH34 øyet. Stjernen angir papilla #12. (E) A dissekert fremre delen av en HH34 + 4 i vitro øye viser flat papillae. Papiller i timelige regionen (solid pil) har begynt å degenerert; Dette er de eldste papillae i ringen. (F) A dissekert fremre delen av øye HH38 med øyelokkene og nictitating membraner fjernet, viser at alle papillae har utartet. De stiplede linjene skissere plasseringen av to tilstøtende unstained kvinne kondensasjoner. (G) et HH34 øye farget for AP viser svært liten skeletogenic kondensasjoner indikasjon på starten av induksjon. (H) A HH34 + 4 øye farget for AP viser forstørret, vokser skeletogenic kondensasjoner. (jeg) en HH38 øye farget for AP viser store skeletogenic kondensasjoner. Alle skala barer er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gjør bruk av etablerte vev dyrking teknikker for å oppnå vekst av en kylling øye fra embryonale dag 8 (HH34) i vitro for 4 dager. Denne rutenett-dyrking metoden ble opprinnelig beskrevet av Trowell15. Vi har optimalisert en protokoll fra Pinto og Hall 1991 studien16 utnytte en semi porøs membran med rutenett å studere induktiv signaler mellom separerte vev lag av embryonale kylling øye15. Bruker denne metoden, kultivert Roach 14 - dagers gammel kylling femur6. Denne metoden har også vist seg effektiv i dyrking musen vev6,17. Bruk av filter papir er avgjørende for suksess for protokollen som det hjelper vevet å ta opp næringsstoffer fra mediet effektivt uten mette eller submersing vev.
Næringsstoffer mediet på en lated pH er kritisk for optimal vekst. Mediet bør være på eller nær fysiologisk pH, og bruk av fenol rød i medium som en indikator gir en fordel i at pH endringer enkelt kan oppdages. Serum-ledig media kan brukes, og endre media daglig er ikke nødvendig og påvirker ikke resultatet. Protokollen ble utviklet ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig medium (se Tabell for materiale), som inneholder høye nivåer av aminosyrer og glukose; ingen ytterligere tilskudd av media er nødvendig. De fleste forekomster av dårlig vevvekst bruker denne protokollen oppstod da næringsstoffer media var enten ved en feil pH eller forurenset.
Øyet kan overleve og vokse i opptil 4 dager i vitro, starter på embryonale dag 8, når protokollen utføres under optimale forhold. En begrensning av denne protokollen er at survivability er påvirket utover 4 dager med dyrking. Dermed vil utviklingsprosesser som spenner over et lengre tidsrom kreve endringer i protokollen. En annen begrensning av protokollen er fraværet av en aktiv blodstrøm og endometrial blodkar. Blodårene er viktig for mange utviklingsprosesser, ikke bare for levering av næringsstoffer til vev9, som er oppnådd i vitro via kapillær handling gjennom filter papir som vevet hviler.
Denne protokollen kan brukes å studere utviklingen av hele organer eller store biter av vev i vitro. Virveldyr organer er svært komplekse, og deres utvikling er regulert av mange forskjellige spatiotemporal mønstre. Studiet av disse utviklingsmessige veier er avhengig av evnen til å manipulere signaler som regulerer dem. Gjeldende metoder begrense dette manipulasjon relativt små, lokaliserte områder og lav nok konsentrasjoner å unngå embryonale dødelighet. For eksempel ex ovo metoden for dyrking hele kylling embryoet i kultur18 eller metoden til vinduet egg19 å gjennomføre manipulasjoner er begrenset i at enten hele fosteret må behandles, som kan forårsake dødelighet, eller bare en små lokaliserte området behandles. Fordelen av protokollen presenteres her er at effekten av disse signalene kan studeres på hele organer eller store mengder vev, uten å påvirke embryonale levedyktighet. Denne protokollen krever ikke noen tilskudd med karbondioksid som tidligere protokoller15. Forsinkelsen i utvikling som vi observerte er en fordel i at rask utviklingsprosesser kan studeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Gregory Haller (Mount Saint Vincent University) for sitt innledende arbeid i utviklingen av protokollen. Forfatterne vil også takke Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) for sin tekniske ekspertise og assistanse med filming og produksjon av audiovisuelle delen av manuskriptet. Daniel Andrews ble støttet av finansiering fra MSVU og naturvitenskap og Engineering Research Council for Canada (NSERC) via en lavere Student forskning prisen. Tamara A. Franz-Odendaal støttes av en NSERC funn tilskudd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
References
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).
