Summary
在这里, 我们提出了一个脊髓培养协议, 培育胚胎鸡器官体外.利用这种方法, 可以对胚胎鸡组织的发育进行研究, 同时保持对培养环境的高度控制。
Abstract
胚胎鸡通常被用作脊椎动物发育的可靠模型有机体。它的可达性和短潜伏期使其成为实验的理想选择。目前, 对鸡胚中这些发育途径的研究是通过在局部部位应用抑制剂和药物, 在低浓度下使用多种方法进行的。体外培养是一种技术, 它能够研究与宿主生物体分离的组织, 同时绕过与整个胚胎工作时存在的许多物理限制, 如胚胎的易感性高剂量的潜在致命化学物质。在这里, 我们提出了一个脊髓培养的方法, 以培养胚胎鸡半头的体外, 这为检查发展过程的新的机会, 超越目前建立的办法。
Introduction
胚胎鸡肉 (鸡鸡) 是生物学领域中常用的一种优良的模型生物。其潜伏期约为21天, 许多卵可以同时孵化, 使实验快速、高效。也许最重要的是 , 胚胎也很容易控 , 从而能够对关键的发育过程以及驱动这些过程的基因和蛋白质进行广泛的研究。
胚胎鸡眼是一个复杂的器官,通过与许多其他身体系统相似的不同组织的相互作用而发展。这种方法使研究这些组织的发展, 特别是在发展的先进阶段。例如, 多层视网膜可能对那些研究神经系统发育的人特别感兴趣。其他的方法, 使研究其他眼睛组织, 如角膜, vitreal 体, 晶状体, 巩膜, 和眼睑是有益的研究人员。鸡胚眼还含有一系列扁平骨, 即巩膜听骨, 可作为研究脊椎动物1膜内骨诱导和骨化的模型。
目前, 有许多方法用于研究胚胎发育。Microinjections 抑制性抗体或其他抑制分子2,3, 手术植入微球浸泡在抑制剂4, 和电穿孔5是所有的方法, 可用于 downregulate 基因或者是胚胎中感兴趣的蛋白质。类似的方法用于 upregulate 蛋白质。这些方法不是没有限制的。例如, 当使用化学物质来改变胚胎发育时, 必须对胚胎的致命影响进行评估, 这就限制了使用上述方法在足够低的剂量下对应用地点进行本地化, 以确保胚胎。
体外组织培养已被广泛应用于各种生物体中, 用于研究发展, 可用于绕过上述一些限制。例如, 股骨6、羽毛芽7、8和四肢9的鸡都用组织培养方法进行了研究, 如老鼠10的睾丸和植物的根和茎11。这些方法给予科学家高度的控制组织发展, 例如有能力波动的温度和改变养分的可用性。从整个胚胎中分离出的组织也使得它更不易受到化学物质的致命影响, 从而使得在全球范围内进行更高浓度的操纵研究。体外培养的另一个显著优点是保存组织的细胞环境;组织的排列保持相对不变, 从而可以研究不同组织类型9之间的相互作用。因此,在体外培养打开门的其他实验方法没有在体内或蛋模型。
目前, 使用化学物质研究胚胎鸡眼的发展尤其具有挑战性。许多胚外膜覆盖胚胎, 使其难以应用微球或化学物质;胚胎在卵子中也非常活跃, 因为它变老了, 使已经很难的方法复杂化了。该协议能够方便地接触眼睛及其周围组织, 消除这些障碍, 同时也为检查眼睛内的发育过程提供了新的机会。本协议的建立是为了研究在胚胎眼中的巩膜听骨的诱导。
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Protocol
注: 对于胚胎阶段, 利用汉堡包和哈密尔顿12 (HH) 分期表。
1. 胚胎孵化
- 在37°c 1 °c 和40% 湿度的无菌、温度控制的孵化器中孵化受精的鸡卵。
- 每天把鸡蛋 1x, 让它们孵化到 HH34 (受精后8天)。
2. 材料的制备和灭菌
- 12胚, 高压釜2升蒸馏水, 1 升0.85% 鸡盐水, 12 玻璃吸管, 1 盒纸组织, 24 2.5 厘米 x 2.5 厘米的半多孔滤纸的正方形, 和 24 2.5 厘米 x 2.5 厘米正方形的钢丝网, 边缘弯曲向下。要消毒的材料, 蒸压他们在121摄氏度至少15分钟。
注: 材料的热处理可以提前完成。 - 通过擦拭两侧、货架和门, 用70% 乙醇消毒孵化器。在孵化箱内放置2塑料容器, 其中含有蒸压蒸馏水, 以保持湿度。Prewarm 培养孵化器到37°c 1 °c 和 ~ 40% 湿气。确保孵化器完全黑暗;如果门是透明的, 用锡纸盖住它。
- Prewarm 100 毫升的营养培养基和1毫升的青霉素放置在培养皿中。
- 用纸巾盖住工作区, 用70% 乙醇喷洒在工作台上消毒。消毒2对镊子, 解剖剪刀, 剃刀刀片, 和一个塑料勺子与70% 乙醇的类似方式。
- 放置12无菌100毫米培养皿和24无菌35毫米培养皿在板凳上使用。确保餐具在使用前保持在无菌袋中。
3. 胚胎准备
注意: 从这一点起, 戴上防护防尘面罩, 避免污染文化。细菌或真菌感染将破坏文化, 并有风险迅速蔓延到所有文化的孵化器。
- 打开鸡蛋, 将胚胎移植到含有0.85% 只生理盐水的100毫米培养皿中。根据汉堡和汉密尔顿分期指南12中描述的解剖特征, 分期胚胎, 并确认胚胎在 HH34。
- 切开颈部, 然后用消毒剃刀刀片在中线对开胚胎的头部。使用无菌钳, 取出大脑。保持喙完好。
4. 文化设置
- 放置 2 35 毫米培养皿内100毫米培养皿。
- 在每35毫米培养皿内放置一个钢丝网。
- 使用镊子, 转移1的一分为二头到一块2.5 厘米 x 2.5 厘米半孔滤纸与眼睛朝上。确保组织是安全的, 并不会滑倒轻微倾斜。
- 使用镊子, 小心地将眼睛组织和滤纸放在钢丝网的顶部, 在35毫米培养皿中的 1, 形成一个凸起的阶段与眼睛组织在顶部。
- 重复步骤4.3 和4.4 与另一半头。
- 使用无菌的玻璃吸管, 小心地添加营养介质到每35毫米培养皿, 直到它达到过滤纸的水平。不要将半头浸入营养培养基中。
- 在每个培养皿中加入50µL 1万毫升青霉素-链霉素到营养培养基中。
- 将一张纸巾折叠成一个小正方形, 放入100毫米培养皿内。用蒸压蒸馏水滋润它。
- 将培养皿放入无菌, 深色孵化器, 在37°c 1 °c 和40% 湿度4天。
- 对每个胚胎重复步骤3和4。
注: 需要的胚胎数量将取决于具体的实验;在这里, 我们描述了12胚胎的协议。
5. 文化维护
- 每天一次, 顶部的塑料容器在孵化器与新鲜, 蒸压蒸馏水。
- 每日检查所有的细菌或真菌感染的文化。已解体或介质更改颜色的区域性被感染。丢弃所有受感染的区域性。
6. 固定
- 培养后, 从孵化器中取出所有菜肴。
- 使用一对镊子, 轻轻地从滤纸上取出眼睛, 注意不要撕掉纸巾。
- 将4% 多聚甲醛中的眼部组织固定在4摄氏度或10% 中性缓冲的福尔马林中过夜, 室温下在1x 磷酸盐缓冲盐水中。
- 在1x 磷酸盐缓冲盐水中储存4摄氏度的组织。
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Representative Results
采用这种方法, 可以在体外培养8天的胚胎鸡眼 (HH34), 4 天。四天的蛋发展对应于 HH38。
这种培养方法支持发展的羽毛芽周围的眼睛和眼睑 (图 1B)。这些羽毛芽不存在于蛋在 HH34 之前的培养 (图 1A), 表明羽毛芽发育是在培养期间开始, 因为它是在蛋13 (图 1C)。在培养过程中, 眼睑和瞬膜生长以遮盖眼睛 (图 1B).在体外培养后, 眼睑看起来比在 HH34 培养开始时更成熟 (图 1A), 但较 HH38 (图 1C) 低。这些数据表明, 胚胎发育的关键方面得到支持, 尽管有些小的延迟。
培养后, 我们解剖的眼睛前部, 以显示结膜乳突 (13-14 上皮突起的瞬态环), 这是另一个标志, 表明发展事件是支持的文化。通常, 这些乳突是由 HH34 (图 1D) 完全形成的, 随着时间的推移退化, 导致 skeletogenic 冷若冰霜在底层间质;他们消失的 HH381 (图 1F)。我们的数据表明, 这种退化发生在体外(图 1E), 并在前面是扁平的乳突后,蛋模式的发展。然而, 无瑕冷若冰霜在体外样本中不可见, 不同于 HH38 (图 1F)。我们使用碱性磷酸酶染色, 检测早期成骨细胞活动, 进一步评估诱导这些冷若冰霜14;这一过程发生在蛋结膜乳突变性的同时。从 HH34 (图 1G) 开始的 skeletogenic 冷若冰霜的诱导在体外进行, 如碱性磷酸酶染色 (图 1H) 所证明的那样。然而, 这些冷若冰霜的规模并不像 HH3814 (图 1I) 那么大, 这再次表明开发中有一个小的延迟。我们估计, 4 天的培养代表了大约2天的胚胎发育;因此, 延迟约50%。这些结果表明, 膜内骨的诱导和发展, 巩膜冷若冰霜, 是支持的体外和发展过程, 如眼睑生长和羽毛芽形成进行体外。
图 1.体外培养的眼睛、HH34 的眼睛和 HH38的眼睛的形态学特征。A F是无瑕和G I染色的碱性磷酸酶 (AP) 酶, 以区分活性成骨细胞在巩膜冷若冰霜。在 HH34 的培养期开始时, A、 D和G显示出眼睛。4天的体外培养后, B、 E和H显示眼睛。在 HH38 的蛋培养4天后,我的眼睛显示出来。所有的眼睛都是侧面看的。(a) 结膜状的乳突在角膜周围的环中可见。星号表示 #12, 第一个要形成的。箭头表示眼睛鼻腔区域的眼睑边缘。(B) 结膜的乳突已扁平化, 并开始退化。箭头表示生长的羽毛芽。(C) 结膜乳突已完全退化, 并由眼睑和瞬膜覆盖。打开箭头表示眼睛鼻腔区域的眼睑边缘。实心箭头表示生长的羽毛芽。(D) HH34 眼的前部解剖。星号表示 #12 的乳突。(E) HH34+4体外眼的解剖前部, 显示扁平的乳突。颞区的乳突 (实心箭) 开始退化;这些是环中最古老的乳突。(F) HH38 眼的解剖前部与眼睑和瞬膜分离, 表明所有的乳突都已退化。虚线勾勒出两个相邻无瑕冷若冰霜的位置。 (G) 一 HH34 的眼睛被染色, 显示非常小的 skeletogenic 冷若冰霜指示开始诱导。(H) HH34+4 眼染色, 显示扩大, 生长 skeletogenic 冷若冰霜。(I) 一 HH38 的眼睛染色的 AP 显示大 skeletogenic 冷若冰霜。所有刻度条均为1毫米.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本协议利用已建立的组织培养技术, 从体外培养8 (HH34) 的胚胎4天, 实现鸡眼的生长。这种网格培养方法最初是由 Trowell15描述的。我们优化了一个协议, 从托比和霍尔的1991研究16利用半孔膜与网格, 研究诱导信号之间的分离组织层的胚胎鸡眼15。用这种方法, 蟑螂培养了14天的老鸡股骨6。这种方法也证明了有效的培养小鼠组织6,17。过滤纸的使用对该协议的成功至关重要, 因为它有助于组织有效地从培养基中吸收养分而不使组织饱和或 submersing。
营养培养基在适当的 pH 值对最佳的成长是关键的。培养基应处于或接近生理 pH 值, 在培养基中使用苯酚红色作为指示器, 可以很容易地检测出 pH 值的变化。可以使用无血清媒体, 每天改变媒体是不必要的, 不会影响结果。该议定书是利用商业上可用的媒介 (见材料表) 开发的, 含有高水平的氨基酸和葡萄糖;不需要进一步补充媒体。大多数出现的不良组织生长使用此协议发生时, 营养媒介是在一个不正确的 pH 值或污染。
在最佳条件下, 从胚胎日8开始, 眼睛可以在体外存活和生长4天。这个协议的一个限制是, 生存能力受到影响超过4天的培养。因此, 跨越较长时间范围的发展进程将需要对该议定书进行修改。该议定书的另一个限制是缺乏活跃的血液流动和血管化。血管是重要的许多发展过程, 不仅是为提供营养的组织9, 这是通过毛细管作用, 通过过滤纸的组织休息。
本协议可用于研究体外全器官或大片组织的发育。脊椎动物器官高度复杂, 其发育受许多不同时空模式的制约。对这些发展路径的研究依赖于操纵控制它们的信号的能力。目前的方法将这种操作限制在相对较小的局部区域, 并以足够低的浓度来避免胚胎致死。例如, 在养殖18中培养整个鸡胚的前蛋方法, 或者将卵19进行操作的方法是有限的, 因为必须对整个胚胎进行治疗, 这可能会造成杀伤力, 或者只有一个小局部区域被对待。在这里提出的协议的好处是, 这些信号的影响可以研究在整个器官或大量的组织, 而不影响胚胎的生存能力。本议定书不要求任何补充二氧化碳, 如在早先的议定书15。我们观察到的延迟发展是一个优势, 在快速发展过程中可以研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢格雷戈里 Haller (圣文森特大学) 在发展《议定书》方面的初步工作。作者还要感谢尼古拉斯. 琼斯 (圣文森特大学) 的技术专长和协助, 拍摄和制作手稿的视听部分。丹尼尔安德鲁斯得到了来自 MSVU 和加拿大自然科学和工程研究委员会 (NSERC) 的资助,通过了一项本科生研究奖。塔玛拉. Odendaal 是 NSERC 发现补助金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
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