Summary
Her præsenterer vi en organotypic dyrkning protokol for at dyrke embryonale kylling organer in vitro-. Brug denne metode, kan udvikling af embryonale kylling væv studeres, samtidig opretholde en høj grad af kontrol over kultur-miljø.
Abstract
Den embryonale kylling er almindeligt anvendt som en pålidelig model organisme for hvirveldyr udvikling. Dens tilgængelighed og korte inkubation gør periode den ideel til eksperimenter. I øjeblikket, er undersøgelse af disse udviklingsmæssige veje i kylling embryo udført ved at anvende hæmmere og narkotika på lokaliserede sites og ved lave koncentrationer ved hjælp af en række forskellige metoder. In vitro dyrkning af væv er en teknik, der giver mulighed for undersøgelse af væv adskilt fra værtsorganisme, mens samtidig omgåelse mange af de fysiske begrænsninger findes, når du arbejder med hele embryoner, såsom modtagelighed af embryoner til høje doser af potentielt dødbringende kemikalier. Vi præsenterer her, en organotypic dyrkning protokol for dyrkning af de embryonale kylling halvt hoved i vitro, som præsenterer nye muligheder for undersøgelse af udviklingsmæssige processer ud over de i øjeblikket etablerede metoder.
Introduction
Den embryonale kylling (Gallus gallus) er en fremragende model organisme almindeligt anvendt inden for biologi. Dens Inkubationstiden er ca 21 dage og mange æg kan være udruget samtidigt, hvilket gør eksperimenter, hurtig og effektiv. Måske vigtigst, fosteret er også nemt at manipulere, aktivering af den omfattende undersøgelse af vigtige udviklingsprocesser og gener og proteiner, der styrer disse processer.
Embryonale kylling øjet er et komplekst organ, der udvikler sig via et samspil mellem en række forskellige væv magen til mange andre body systems. Denne metode giver mulighed for undersøgelse af udviklingen af disse væv, især i fremskredne stadier af udvikling. For eksempel, kan multi-lag nethinden være af særlig interesse for dem, der studerer udviklingen af nervesystemet. Alternative metoder, der aktiverer undersøgelse af andre øjet væv som hornhinden, vitreal krop, linsen, sclera og øjenlåg er til gavn for forskere. Kylling embryonale øjet indeholder også en række flade knogler, de scleral øreknoglerne, som kan bruges som model for studiet af intramembranous knogle induktion og ossifikation i hvirveldyr1.
I øjeblikket, er der en række metoder, der anvendes til at studere embryonale udvikling. Microinjections hæmmende antistoffer eller andre hæmmende molekyler2,3, implanteret kirurgisk microbeads gennemblødt i inhibitor4, og elektroporation5 er alle metoder, der kan bruges til at nedregulere gener eller proteiner af interesse i et foster. Lignende metoder bruges til at upregulate proteiner. Disse metoder er ikke uden deres begrænsninger. For eksempel, når du bruger kemikalier til at ændre den embryonale udvikling, de dødelige virkninger på fosteret skal evalueres, og dette begrænser brugen af de ovennævnte metoder til lokaliserede sites anvendelse ved doser lav nok til at sikre overlevelsesevne den embryo.
In vitro dyrkning af væv er blevet brugt i en lang række organismer for at studere udvikling og kan bruges til at omgå nogle af de ovennævnte begrænsninger. For eksempel, er den femora6og fjer knopper7,8, lemmer9 af kylling alle blevet studeret ved hjælp af væv dyrkning metoder, som har testiklerne af musen10 og rødder og stængler af planter11. Disse metoder giver forskerne en høj grad af kontrol over væv udvikling, såsom evnen til at svinge temperaturen og ændre den næringsstoftilgængelighed. Isolering af væv fra hele fosteret gør det også langt mindre modtagelige for de dødelige virkninger af kemikalier, således at manipulation undersøgelser på globalt plan ved højere koncentrationer. En anden bemærkelsesværdig fordel i vitro dyrkning er bevarelsen af det væv cellulære miljø; arrangement af væv forbliver relativt uændret, hvilket gør det muligt at studere samspillet mellem forskellige væv typer9. Således metoder i vitro dyrkning åbner døre til yderligere eksperimentelle ikke til rådighed i vivo eller ovo modeller.
I øjeblikket er studerer udviklingen af embryonale kylling øjet ved hjælp af kemikalier særligt udfordrende. En række af extraembryonic membraner dækker embryo, hvilket gør det vanskeligt at anvende microbeads eller kemikalier; fosteret er også meget aktive inden for æg, som det bliver ældre, yderligere komplicerer en allerede vanskelig metode. Denne protokol giver nem adgang til øjet og dens omgivende væv, at fjerne disse hindringer, og giver samtidig nye muligheder for at undersøge de udviklingsmæssige processer inden for øjet. Denne protokol blev etableret for at studere induktion af de scleral øreknoglerne i embryonale øjet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: For embryo stadier, udnytte de Hamburger og Hamilton12 (HH) iscenesættelse tabel.
1. embryo inkubation
- Inkuber befrugtede hønseæg i en steril, temperatur-kontrolleret inkubator ved 37 ° C ± 1 ° C og ~ 40% luftfugtighed.
- Slå æg 1 x om dagen og tillade dem at udruge til HH34 (8 dage efter befrugtning).
2. forberedelse og Sterilisation af materialer
- For 12 embryoner, autoklave 2 L destilleret vand, 1 L 0,85% kylling saltvand, 12 glas pipetter, 1 kasse med papir væv, 24 2,5 cm x 2,5 cm firkanter semi-porøse filtrerpapir og 24 2,5 cm x 2,5 cm firkanter af stål wire mesh med kanterne buet nedad. At sterilisere materialer, autoklave dem ved 121 ° C i mindst 15 min.
Bemærk: Autoklavering af materialer kan ske på forhånd. - Sterilisere kuvøse med 70% ethanol af aftørring af sider, hylder og dør. Sted 2 plast beholdere indeholdende autoklaveres destilleret vand inde i inkubator til at opretholde fugt. Prewarm kultur inkubator til 37 ° C ± 1 ° C og ~ 40% luftfugtighed. Sikre rugemaskine er helt mørkt; Hvis døren er gennemsigtig, dæk det med stanniol.
- Prewarm 100 mL af næringsstof medium og 1 mL af penicillin ved at placere dem i kultur inkubator.
- Dækker arbejdsområdet med et stykke køkkenrulle og sterilisere bænken ved at sprøjte det med 70% ethanol. Sterilisere 2 par pincet, dissektion saks, et barberblad og en plastikske med 70% ethanol i en lignende måde.
- Sted 12 sterile 100 mm petriskåle og 24 petriskåle med sterilt 35 mm på bænken til brug. Sikre retterne fortsat i en steril pose indtil brug.
3. embryo forberedelse
Bemærk: Fra dette punkt og fremefter, bære en beskyttende støvmaske ansigt for at undgå kontaminering af kulturer. En bakterie- eller svampeinfektion infektion vil ødelægge kulturen og der er en risiko for den breder sig hurtigt til alle kulturer i rugemaskinen.
- Knæk åbne æg og overføre embryonet til et 100 mm petriskål indeholdende 0,85% kylling saltvand. Fase embryo ifølge de anatomiske funktioner beskrevet i Hamburger og Hamilton iscenesættelse retningslinjer12 og bekræfte embryoet er på HH34.
- Skære halsen og derefter gennemskære lederen af embryoet på midterlinjen ved hjælp af en steriliseret barberblad. Brug steril pincet, fjerne hjernen. Forlade næbbet intakt.
4. kultur Setup
- Sted 2 af 35 mm petriskåle inde en 100 mm petriskål.
- Placer en stål trådnet inde hver 35 mm petriskål.
- Bruge pincet, overføre 1 af gennemskæres hoveder til et stykke af 2,5 cm x 2,5 cm semi-porøse filtrerpapir med øjet vender opad. Sikre væv er sikkert og ikke glide af ved at vippe det lidt.
- Bruge pincet, omhyggeligt placere øjet væv og filter papir oven på stål trådnet i 1 af 35 mm petriskåle, at skabe en ophøjet scene med øjet væv på toppen.
- Gentag trin 4.3 og 4.4 med de øvrige halvt hoved.
- Ved hjælp af et sterilt glas pipette, omhyggeligt tilføje næringsstoffer medium direkte i hver 35 mm petriskål, indtil det når niveauet for filtrerpapir. Ikke nedsænkes den halvt hoved i den næringsstof medium.
- Tilføje 50 µL af 10.000 U/mL penicillin-streptomycin til næringsstof medium i hver petriskål.
- Fold et stykke silkepapir i et lille torv og placere den inde i 100 mm petriskål. Fugte det med autoklaveres destilleret vand.
- Placere kultur parabol i det sterile, mørke inkubator ved 37 ° C ± 1 ° C og ~ 40% luftfugtighed i op til 4 dage.
- Gentag trin 3 og 4 for hver embryo.
Bemærk: Antallet af embryoner behov vil afhænge af den specifikke eksperiment; Her beskriver vi protokol for 12 embryoner.
5. kultur vedligeholdelse
- En gang om dagen, top op plastbeholdere i kuvøse med friske, autoklaveres destilleret vand.
- Dagligt Tjek alle kulturer for bakterier eller svampe infektioner. Kulturer der har opløst eller hvor mediet har skiftet farve er inficeret. Kassér alle kulturer, der er inficeret.
6. fiksation
- Efter dyrkning, fjerne alle retter fra rugemaskinen.
- Ved hjælp af et par pincet, forsigtigt fjerne øjet fra filtrerpapir, pas på ikke for at rive væv.
- Fix øjet væv i 4% PARAFORMALDEHYD i 1 x fosfatbufferet saltopløsning natten over ved 4 ° C eller 10% neutral-buffered formalin natten over ved stuetemperatur.
- Gemme væv ved 4 ° C i 1 x fosfatbufferet saltopløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug denne metode, kan øje embryonale kylling være kulturperler fra dag 8 i sin udvikling (HH34) in vitro- i 4 dage. Fire dage i ovo udvikling svarer til HH38.
Denne dyrkningsbaserede metode understøtter udviklingen af fjer knopper omkring øjet og øjenlågene (figur 1B). Disse fjer knopper er ikke til stede i ovo på HH34 inden den dyrkning (figur 1A), der angiver at fjer bud udvikling initieres dyrkningsbaserede periode, som det er i ovo13 (figur 1 c). Øjenlåg og nictitating membran vokse dækker øjet under de dyrkningsbaserede (figur 1B). Øjenlåg vises mere moden efter den i vitro dyrkning end ved starten af dyrkning på HH34 (figur 1A), men er mindre udviklet end i HH38 (figur 1 c). Denne data viser at understøttes nøgleaspekter af fosterudviklingen, omend med nogle små forsinkelse.
Efter dyrkning, dissekeret vi den forreste del af øjet til at vise af konjunktival papiller (en flygtig ring af 13-14 epitelial fremspring), der fungerer som endnu en milepæl med angivelse af at de udviklingsmæssige begivenheder understøttes i kultur. Typisk, disse papiller er fuldt dannet af HH34 (fig. 1 d), og degenererede over tid som de fremkalde skeletogenic fortætninger i den underliggende udkom; de forsvinder af HH381 (figur 1F). Vores data viser, at denne degeneration opstår i vitro (figur 1E) og indledes med en udfladning af papiller efter i ovo mønster af udvikling. Unstained fortætninger, men er ikke synlig i in vitro- prøver, i modsætning til på HH38 (figur 1F). Vi brugte alkalisk fosfatase farvning, som registrerer tidligt osteoblastdannelse aktivitet for at yderligere vurdere induktion af disse fortætninger14; denne proces sker sideløbende med degeneration af konjunktival papiller i ovo. Induktion af skeletogenic fortætninger, som begynder ved HH34 (figur 1 g), fortsætte in vitro- som det fremgår af den basisk fosfatase farvning (figur 1 H). Disse fortætninger, men er ikke så stort som de er på HH3814 (figur 1I), igen med angivelse af at der er en lille forsinkelse i udviklingen. Vi anslår, at 4 dage for dyrkning udgør ca. 2 dage af embryoets udvikling; dermed en forsinkelse på ca. 50%. Kollektivt, disse resultater viser, at induktion og udvikling af intramembranous knogler, de scleral fortætninger, er understøttet i vitro og at de udviklingsmæssige processer såsom øjenlåg vækst og fjer bud dannelse fortsætte i in vitro.
Figur 1 . Morfologiske karakteristika af in vitro- kulturperler øjne, HH34 øjne og HH38 øjne. A - F er unstained og G - jeg er farvet for basisk fosfatase (AP) enzym til at skelne mellem aktiv osteoblaster inden for de scleral fortætninger. A, Dog G Vis øjne i starten af perioden dyrkningsbaserede på HH34. B, Eog H Vis øjne efter 4 dage i vitro dyrkning. C, Fog jeg vise øjne efter 4 dage i ovo dyrkning på HH38. Alle øjne ses sideværts. (A) den konjunktival papiller er synlig i en ring omkring hornhinden. En asterisk angiver papilla #12, den første, der form. Pilen angiver kanten af øjenlåget i øjet-nasal regionen. (B) de konjunktival papiller har fladtrykt og begyndt at degenerere. Pilen angiver en voksende fjer bud. (C) den konjunktival papiller har fuldstændigt degenereret og er omfattet af øjenlåg og nictitating membranen. Den åbne pil angiver kanten af øjenlåget i øjet-nasal regionen. Den solide pil angiver en voksende fjer bud. (D) A dissekeret forreste del af øjet, HH34. Stjernen angiver papilla #12. (E) A dissekeret forreste del af en HH34 + 4 in vitro- øje viser fladtrykte papiller. Papiller i den tidsmæssige regionen (massiv pil) begyndt at degenerere; disse er de ældste papiller i ringen. (F) A dissekeret forreste del af et HH38 øje med øjenlåg og nictitating membraner fjernet, viser, at alle papillae har degenereret. De stiplede linjer skitsere holdning af to tilstødende unstained fortætninger. (G) A HH34 øjet farvet for AP viser meget lille skeletogenic fortætninger vejledende af start af induktion. (H) A HH34 + 4 øje farvet for AP viser udvidede, vokser skeletogenic fortætninger. (jeg) A HH38 øjet farvet for AP viser store skeletogenic fortætninger. Alle skala barer er 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol gør brug af etablerede væv dyrkning teknikker til at opnå vækst i en kylling øjet fra embryonale dag 8 (HH34) i vitro i 4 dage. Denne dyrkning af gitter metode blev oprindeligt beskrevet af Trowell15. Vi optimeret en protokol fra Pinto og Halls 1991 undersøgelse16 udnytter en semi-porøse membran med gitter til at studere induktive signaler mellem adskilte væv lag af embryonale kylling øje15. Brug denne metode, kulturperler Roach 14 - dage gamle kylling lårbenet6. Denne metode har også vist sig effektiv i dyrkning mus væv6,17. Brug filter papir er afgørende for succes i protokollen, da det hjælper væv til at optage næringsstoffer fra medium effektivt uden mætte eller submersing væv.
Næringsstof medium på en ordentlig pH er afgørende for optimal vækst. Mediet skal være på eller i nærheden af fysiologiske pH-værdien og brugen af phenol red på mellemlang som en indikator giver en fordel i at pH-ændringer kan opdages let. Serum-gratis medier kan bruges, og ændre medierne dagligt er ikke nødvendig og påvirker ikke resultaterne. Protokollen blev udviklet ved hjælp af en kommercielt tilgængelig medium (Se Tabel af materialer), som indeholder høje niveauer af aminosyrer og glukose; ingen yderligere tilskud af medierne er nødvendigt. De fleste forekomster af fattige væv vækst ved hjælp af denne protokol opstod næringsstof medierne var enten ved en forkert pH eller forurenet.
Øjet kan overleve og vokse for op til 4 dage i vitro, startende fra embryonale dag 8, når protokollen er udført under optimale betingelser. En begrænsning af denne protokol er at overlevelsesevne er påvirket mere end 4 dage for dyrkning. Således, de udviklingsmæssige processer, der strækker sig over en længere tidsramme vil kræve ændringer i protokollen. En anden begrænsning af protokollen er fraværet af en aktiv blodgennemstrømningen og vascularization. Blodkar er vigtige for mange udviklingsmæssige processer, ikke kun for levering af næringsstoffer til vævet9, som er opnået in vitro-via kapillaritet gennem filtrerpapir som vævet hviler.
Denne protokol kan bruges til at studere udviklingen af hele organer eller store stykker af væv i vitro. Hvirveldyr organer er meget komplekse, og deres udvikling er reguleret af mange forskellige spatiotemporelle mønstre. Studiet af disse udviklingsmæssige veje er afhængig af evnen til at manipulere de signaler, der regulerer dem. Nuværende metoder begrænse denne manipulation til relativt små, lokaliseret områder, og at lave nok koncentrationer at undgå embryonale dødelighed. For eksempel, ex ovo metode til dyrkning af den hele kylling embryo i kultur18 eller metoden til vinduet æg19 til at foretage manipulationer er begrænset i at enten hele fosteret skal blive behandlet, hvilket kan forårsage dødelighed eller kun en lille lokaliseret område behandles. Fordelen ved den protokol, der præsenteres her er, at effekten af disse signaler kan studeres på hele organer eller store mængder af væv, uden at det påvirker de embryonale levedygtighed. Denne protokol kræver ikke nogen tilskud med kuldioxid som i tidligere protokoller15. Forsinkelsen udvikling, som vi observerede er en fordel i den hurtige udviklingsprocesser kan studeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Gregory Haller (Mount Saint Vincent Universitet) for hans indledende arbejde i udviklingen af protokollen. Forfatterne ønsker også at takke Nicholas Jones (Mount Saint Vincent Universitet) for sine tekniske ekspertise og bistand med optagelserne og produktion af audio/visuelle del af håndskriftet. Daniel Andrews blev støttet af midler fra MSVU og naturvidenskab og teknisk forskning Rådet i Canada (NSERC) via en Undergraduate studerende Research Award. Tamara A. Franz-Odendaal understøttes af en NSERC opdagelse Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
References
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).
