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Developmental Biology

Organotypischen Kultur-Methode, die Entwicklung der embryonalen Gewebe zu studieren

doi: 10.3791/57619 Published: August 25, 2018

Summary

Hier präsentieren wir eine organotypischen Kultivierung Protokoll zur embryonalen Organe wachsen in-vitro-. Mit dieser Methode kann die Entwicklung der embryonalen Gewebe untersucht werden und gleichzeitig ein hohes Maß an Kontrolle über die Kultur Umwelt.

Abstract

Das embryonale Huhn wird häufig als zuverlässige Modellorganismus für vertebrate Entwicklung verwendet. Seine Erreichbarkeit und kurze Inkubationszeit macht Zeit es ideal für Experimente. Derzeit ist die Studie dieser Entwicklungsstörungen Wege im Huhn Embryo mittels Inhibitoren und Drogen an lokalisierten Standorten und bei niedrigen Konzentrationen mit einer Vielzahl von Methoden. In-vitro- Gewebekulturen ist eine Technik, die es die Untersuchung von Gewebe getrennt vom Wirtsorganismus ermöglicht, während gleichzeitig viele der körperlichen Einschränkungen vorhanden, bei der Arbeit mit ganzen Embryonen, wie die Anfälligkeit der Embryonen zu umgehen hohe Dosen von potenziell tödlichen Chemikalien. Hier präsentieren wir Ihnen eine organotypischen Kultivierung Protokoll für die Kultivierung der embryonalen halben Kopf in Vitro, präsentiert neue Möglichkeiten für die Prüfung von Entwicklungsprozessen über den derzeit etablierten Verfahren.

Introduction

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Das embryonale Huhn (Gallus Gallus) ist ein hervorragendes Modellorganismus häufig verwendet im Bereich der Biologie. Die Inkubationszeit beträgt etwa 21 Tage und viele Eier können inkubiert werden gleichzeitig, Experimente zu machen, schnell und effizient. Vielleicht ist vor allem der Embryo auch leicht manipuliert ermöglicht die umfassende Studie der wichtigsten Entwicklungsprozesse und der Gene und Proteine, die diese Prozesse steuern.

Das embryonale Huhn Auge ist ein komplexes Organ, das durch das Zusammenspiel einer Reihe von verschiedenen Geweben ähnlich wie viele andere Körpersysteme entwickelt. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Entwicklung dieser Gewebe, besonders in fortgeschrittenen Stadien der Entwicklung. Z. B. möglicherweise die mehrschichtige Netzhaut von besonderem Interesse für alle, die die Entwicklung des Nervensystems. Alternative Methoden, die das Studium der anderen Augengewebe zu ermöglichen, wie z. B. die Hornhaut, Glaskörperblutung Körper, der Linse, der Sklera und die Augenlider für Forscher von Nutzen sind. Das Huhn embryonalen Auge enthält auch eine Reihe von flachen Knochen, der skleralen Gehörknöchelchen, die als Modell für die Untersuchung von intramembranous Knochen Induktion und Verknöcherung in Wirbeltieren1verwendet werden können.

Derzeit gibt es eine Reihe von Methoden zur Untersuchung der embryonalen Entwicklung. Mikroinjektionen von inhibitorischen Antikörpern oder anderen hemmenden Moleküle2,3, chirurgisch implantiert Microbeads Inhibitor4trieft und Elektroporation5 sind alle Methoden, die zum Downregulate Gene verwendet werden können oder in einem Embryo interessierender Proteine. Ähnliche Methoden sind an Upregulate Proteine verwendet. Diese Methoden sind nicht ohne ihre Grenzen. Beispielsweise wenn Sie Chemikalien verwenden, um die embryonale Entwicklung zu ändern, die tödlichen Auswirkungen auf den Embryo ausgewertet werden müssen, und dies schränkt die Verwendung der oben genannten Methoden, um lokalisierte Websites Anwendung bei Dosen niedrig genug, um die Überlebensfähigkeit der gewährleisten die Embryo.

In-vitro- Gewebekulturen wurde in einer Vielzahl von Organismen verwendet, um Entwicklung zu studieren und kann verwendet werden, um einige der oben genannten Einschränkungen zu umgehen. Beispielsweise sind die Oberschenkelknochen6, Feder Knospen7,8und Gliedmaßen9 des Huhns alle untersucht worden mit Gewebe züchten Methoden, wie die Hoden der Maus10 und die Wurzeln und stengel der Pflanzen11. Diese Methoden Wissenschaftler gewähren ein hohes Maß an Kontrolle über die Gewebeentwicklung, wie z. B. die Fähigkeit, die Temperatur schwanken und verändern die nährstoffverfügbarkeit. Die Isolierung des Gewebes aus der gesamte Embryo macht es auch weit weniger anfällig gegen die tödlichen Auswirkungen von Chemikalien, wodurch es Manipulation Studien auf globaler Ebene bei höheren Konzentrationen. Ein weiterer bemerkenswerter Vorteil der in-vitro- Kultivierung ist der Erhalt der zellulären Umgebung das Gewebe; die Anordnung der Gewebe relativ unverändert bleibt, die es ermöglichen, die Interaktionen zwischen verschiedenen Gewebe Arten9zu untersuchen. In-vitro- Kultivierung öffnet Türen zu weiteren experimentellen nähert sich somit in in Vivo oder in Ovo Modelle nicht verfügbar.

Derzeit ist die Entwicklung des embryonalen Auges mit Chemikalien besonders anspruchsvoll. Eine Reihe von extraembryonic Membranen abdecken des Embryos erschwert Microbeads oder Chemikalien anzuwenden; der Embryo ist auch sehr aktiv in der Eizelle, als es älter, wird eine ohnehin schwierige Methode weiter zu erschweren. Dieses Protokoll ermöglicht einen einfachen Zugang für das Auge und seine umgebenden Gewebe, diese Hindernisse zu beseitigen, und gleichzeitig neue Möglichkeiten, die Entwicklungsprozesse im Auge zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde gegründet, um die Induktion der skleralen Gehörknöchelchen innerhalb der embryonalen Auges zu studieren.

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Protocol

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Hinweis: Für Embryo Bühnen, nutzen Sie die Hamburger und Hamilton12 (HH) Inszenierung Tabelle.

(1) Embryo Inkubation

  1. Inkubieren Sie befruchteten Hühnereiern in einem sterilen, temperaturgeführte Inkubator bei 37 ° C ± 1 ° C und ~ 40 % Luftfeuchtigkeit.
  2. Drehen Sie die Eier 1 X pro Tag und es ihnen ermöglichen, zu HH34 inkubieren (8 Tage nach Befruchtung).

2. Vorbereitung und Sterilisation von Materialien

  1. Für 12 Embryonen, Autoklaven, 2 L destilliertes Wasser, 1 L 0,85 % Küken Kochsalzlösung, 12 glaspipetten, 1 Karton Papiertaschentuch, 24 2,5 x 2,5 cm Quadrate der halbdurchlässigen Filterpapier und 24 2,5 x 2,5 cm Quadrate aus Stahldraht mesh mit den Kanten nach unten gebogen. Um die Materialien zu sterilisieren Autoklaven bei 121 ° C für mindestens 15 Minuten.
    Hinweis: Das Autoklavieren der Materialien kann im Voraus erfolgen.
  2. Den Inkubator mit 70 % Ethanol durch Abwischen der Seiten, die Regale und die Tür zu sterilisieren. Platz 2-Kunststoff-Behälter mit autoklaviert destilliertes Wasser in die brutmaschine Feuchtigkeit zu halten. Prewarm Kultur-Inkubator auf 37 ° C ± 1 ° C und ~ 40 % Luftfeuchtigkeit. Sicherzustellen Sie, dass der Inkubator ist völlig dunkel; Wenn die Tür transparent ist, mit Alufolie bedecken.
  3. Prewarm 100 mL Nährmedium und 1 mL Penicillin, indem man sie in der Kultur-Inkubator.
  4. Decken Sie den Arbeitsbereich mit einem Papiertuch und Sterilisieren der Bank durch Besprühen mit 70 % igem Ethanol. 2 Paar Zangen, Dissektion Schere, einer Rasierklinge und einem Plastiklöffel mit 70 % Ethanol in ähnlicher Weise zu sterilisieren.
  5. Platz 12 steril 100 mm Petrischalen und 24 sterile 35 mm Petrischalen auf der Bank für den Einsatz. Stellen Sie sicher, dass die Gerichte bis zum Gebrauch in einem sterilen Beutel bleiben.

(3) Embryo Vorbereitung

Hinweis: Ab diesem Zeitpunkt tragen Sie eine schützende Staub Gesichtsmaske zur Vermeidung einer Kontamination der Kulturen. Eine bakterielle oder pilzartige Infektion wird die Kultur ruinieren und besteht die Gefahr der Ausbreitung schnell auf alle Kulturen im Inkubator.

  1. Crack öffnen Sie das Ei und den Embryo zu einem 100 mm Petrischale mit 0,85 % Küken Kochsalzlösung zu übertragen. Stadium des Embryos nach den anatomischen Merkmalen in der Hamburger und Hamilton Inszenierung Leitlinien12 beschrieben und bestätigen den Embryo ist am HH34.
  2. Schneiden Sie den Hals und dann halbieren Sie den Kopf des Embryos an der Mittellinie mit einer sterilisierten Rasierklinge. Mit steriler Pinzette entfernen Sie das Gehirn. Lassen Sie den Schnabel intakt.

4. Kultur-Setup

  1. Platz 2 der 35 mm Petrischalen in einem 100 mm Petrischale.
  2. Legen Sie ein Stahl Drahtgeflecht im Inneren jedes 35 mm Petrischale.
  3. Mit Pinzette, 1 der halbierten Köpfe auf ein Stück 2,5 x 2,5 cm halbdurchlässigen Filterpapier mit dem Auge nach oben übertragen. Stellen Sie sicher, das Gewebe ist sicher und rutscht nicht von durch leicht kippen.
  4. Mit Pinzette, sorgfältig legen Sie das Augengewebe und das Filterpapier auf das Stahl Drahtgeflecht in 1 der 35 mm Petrischalen, erstellen eine erhöhte Bühne mit dem Augengewebe an der Spitze.
  5. Wiederholen Sie 4.3 und 4.4 mit der anderen Hälfte Kopf.
  6. Mit einer sterilen Glaspipette, vorsichtig hinzugeben Sie Nährmedium direkt in jede Petrischale von 35 mm bis die Stufe des Filterpapiers. Tauchen Sie der halbe Kopf im Nährmedium nicht.
  7. Das Nährmedium in jede Petrischale 50 µL von 10.000 U/mL Penicillin-Streptomycin hinzufügen.
  8. Falten Sie ein Stück Seidenpapier in ein kleines Quadrat und legen Sie sie innen 100 mm Petrischale. Mit autoklaviert destilliertes Wasser befeuchten.
  9. Legen Sie die Kulturschale in den sterilen, dunklen Brutschrank bei 37 ° C ± 1 ° C und ~ 40 % Luftfeuchtigkeit für bis zu 4 Tage.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 3 und 4 für jedes Embryo.
    Hinweis: Die Anzahl der Embryonen benötigt von der spezifischen Experiment abhängen; Hier beschreiben wir das Protokoll für 12 Embryonen.

5. Kultur-Wartung

  1. Einmal pro Tag die Kunststoff-Behälter in den Inkubator mit frischem, autoklaviert destilliertes Wasser nachfüllen.
  2. Täglich prüfen Sie alle Kulturen für bakterielle oder Pilzinfektionen. Kulturen, die aufgelöst haben oder in denen das Medium Farbe verändert hat, sind infiziert. Entsorgen Sie alle Kulturen, die infiziert sind.

6. Fixierung

  1. Nach der Kultivierung, entfernen Sie alle Gerichte aus dem Inkubator.
  2. Entfernen Sie mit einer Zange, vorsichtig das Auge aus Filterpapier, kümmert sich nicht um das Gewebe reißen.
  3. Befestigen Sie das Augengewebe 4 % Paraformaldehyd in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung über Nacht bei 4 ° C oder in 10 % Neutral gepufferte Formalin über Nacht bei Raumtemperatur.
  4. Das Gewebe bei 4 ° C in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung aufbewahren.

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Representative Results

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Mit dieser Methode kann Auge embryonalen Huhn vom 8. Tag seiner Entwicklung (HH34) in Vitro für 4 Tage kultiviert werden. Vier Tage in Ovo Entwicklungsstand entspricht HH38.

Diese Kultivierung Methode unterstützt die Entwicklung der Feder Knospen rund um das Auge und an den Augenlidern (Abbildung 1 b). Diese Feder Knospen sind nicht vorhanden in Ovo im HH34 vor der Kultivierung (Abbildung 1A), darauf hinweist, dass Feder Knospe Entwicklung zur Zeit der Kultivierung initiiert wird, wie es in Ovo13 (Abbildung 1). Die Augenlider und blinzelnde Membran wachsen, um das Auge während der Kultivierung (Abbildung 1 b). abdecken Die Augenlider erscheinen nach der in-vitro- Kultivierung als zu Jahresbeginn die Kultivierung bei HH34 reiferen (Abbildung 1A), aber sind weniger als bei HH38 entwickelt (Abbildung 1). Diese Daten zeigen, dass die wesentlichen Aspekte der embryonalen Entwicklung unterstützt werden, wenn auch mit einigen kleinen Verspätung.

Nach der Kultivierung, seziert wir den vorderen Teil des Auges, die Bindehaut Papillen (transiente Ring 13-14 epithelialen Vorsprünge), zeigen, die handeln als ein weiteres Wahrzeichen, die darauf hinweist, dass die entwicklungspolitischen Veranstaltungen in Kultur unterstützt werden. In der Regel diese Papillen sind voll von HH34 gebildet (Abbildung 1), und degenerierte im Laufe der Zeit als sie Skeletogenic Verdichtungen in der zugrunde liegenden Mesenchym induzieren; Sie verschwinden von HH381 (Abb. 1F). Unsere Daten zeigen, dass dieser Degeneration in Vitro (Abbildung 1E tritt) und wird durch eine Abflachung der Papillen, die nach dem in Ovo -Muster der Entwicklung voraus. Ungefärbten Verdichtungen, sind jedoch nicht sichtbar in den Proben in-vitro- anders als bei HH38 (Abb. 1F). Wir verwendeten alkalischen Phosphatase Färbung, der frühen Osteoblasten-Aktivität, um weiter zu beurteilen, die Induktion von diesen Verdichtungen14erkennt; Dieser Vorgang erfolgt neben der Degeneration der Bindehaut Papillen in Ovo. Die Induktion der Skeletogenic Verdichtungen, die am HH34 beginnt (Abbildung 1), verläuft in-vitro- ausweislich der alkalischen Phosphatase Färbung (Abbildung 1 H). Diese Verdichtungen, jedoch sind nicht so groß wie sie bei HH3814 (Abb. 1I), sind wieder darauf hinweist, dass gibt es eine kleine Verzögerung in der Entwicklung. Wir schätzen, dass die 4 Tage der Kultivierung repräsentieren etwa 2 Tage der embryonalen Entwicklung; daher eine Verzögerung von ca. 50 %. Gemeinsam, diese Ergebnisse zeigen, dass die Induktion und Entwicklung der intramembranous Knochen, der skleralen Verdichtungen ist unterstützt in-vitro- und, dass die Entwicklungsprozesse wie Augenlid Wachstum und Feder-Bud-Bildung Vorgehen Vitro.

Figure 1
Abbildung 1 . Morphologische Merkmale von in Vitro kultiviert, Augen, HH34 Augen und HH38 Augen. A - F sind ungefärbt und G - ich sind gebeizt für das Enzym alkalische Phosphatase (AP), aktive Osteoblasten innerhalb der skleralen Verdichtungen zu unterscheiden. A, Dund G zeigen Augen zu Beginn der Kultivierung Punkt am HH34. B, Eund H zeigen Augen nach 4 Tagen der in-vitro- Kultivierung. Cund F zeigen Augen nach 4 Tagen in Ovo Kultivierung auf HH38. Alle Augen sind seitlich betrachtet. (A) der Bindehaut Papillen sind in einem Ring um die Hornhaut sichtbar. Ein Sternchen gibt Papille #12, ersteres zu bilden. Der Pfeil zeigt die Kante des Augenlids in der nasalen Region des Auges. (B) der Bindehaut Papillen sind abgeflacht und begonnen zu degenerieren. Der Pfeil zeigt eine wachsende Feder Knospe. (C) der Bindehaut Papillen haben völlig verkommen und Augenlider und blinzelnde Membran gedeckt sind. Der offene Pfeil zeigt die Kante des Augenlids in der nasalen Region des Auges. Der solide Pfeil zeigt eine wachsende Feder Knospe. (D) A seziert vorderen Teil des Auges HH34. Das Sternchen zeigt an Papille #12. (E) A seziert vorderen Teil eine HH34 + 4 in-vitro- Auge mit abgeflachten Papillen. Die Papillen in der Schläfenregion (solide Pfeil) haben begonnen, zu degenerieren; Dies sind die ältesten Papillen in den Ring. (F) A seziert vorderen Teil des Auges HH38 mit den Augenlidern und Pflegeprodukt Membranen entfernt, wonach alle Papillen degeneriert sind. Die gestrichelten Linien zeigen die Position der zwei angrenzenden ungefärbten Verdichtungen. (G) A HH34 Auge gebeizt für AP zeigt sehr klein Skeletogenic Verdichtungen bezeichnend für den Start der Induktion. (H) A HH34 + 4 Augen gebeizt für AP zeigt vergrößerte, wachsende Skeletogenic Verdichtungen. (ich) A HH38 Auge gebeizt für AP zeigt große Skeletogenic Verdichtungen. Alle Maßstabsleisten sind 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Dieses Protokoll nutzt etablierten Gewebe züchten Techniken um ein Huhn Auge aus embryonalen Tag 8 (HH34) wachsen in Vitro für 4 Tage. Diese Raster-Kultivierung Methode wurde ursprünglich von Trowell15beschrieben. Wir optimieren ein Protokoll von Pinto und Halls 1991 Studie16 unter Verwendung einer halbdurchlässigen Membran mit dem Gitter, induktive Signalübertragung zwischen getrennten Gewebeschichten der embryonalen Auge15zu studieren. Mit dieser Methode kultiviert Roach 14 - Tage altes Huhn Femur6. Diese Methode hat auch Kultivierung Maus Gewebe6,17bewährt. Die Verwendung des Filterpapiers ist entscheidend für den Erfolg des Protokolls, da es, das Gewebe hilft zu nehmen Nährstoffe aus dem Medium effektiv ohne Sättigung oder submersing Gewebe.

Nährmedium bei einem richtigen pH-Wert ist entscheidend für ein optimales Wachstum. Das Medium sollte an oder nahe der physiologischen pH-Wert und die Verwendung von Phenol rot in das Medium als Indikator einen Vorteil sieht vor, dass pH-Änderungen leicht erkannt werden können. Serumfreie Medien können verwendet werden, und die Medien täglich wechselnden ist nicht notwendig und hat keinen Einfluss auf die Ergebnisse. Das Protokoll wurde mit einem handelsüblichen Medium entwickelt (siehe Tabelle der Materialien), die einen hohen Gehalt an Aminosäuren und Glukose; keine weitere Ergänzung der Medien ist erforderlich. Die meisten Vorkommen der Armen Gewebewachstum unter Verwendung dieses Protokolls ereignete sich, als die Nährmedien entweder an einen falschen pH-Wert war oder kontaminiert.

Das Auge kann überleben und wachsen für bis zu 4 Tage in Vitro, beginnend bei embryonalen Tag 8, wenn das Protokoll unter optimalen Bedingungen durchgeführt wird. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist, dass die Überlebensfähigkeit über 4 Tage der Kultivierung beeinträchtigt wird. Folglich werden die Entwicklungsprozesse, die einen längeren Zeitraum erstrecken Änderungen des Protokolls erfordern. Eine weitere Einschränkung des Protokolls ist das Fehlen eines aktiven Blutfluss und Vaskularisierung. Blutgefäße sind wichtig für viele Entwicklungsprozesse nicht nur für die Lieferung von Nährstoffen, die Gewebe-9, die in-vitro-über haarartige Tätigkeit durch das Filterpapier auf dem ruht das Gewebe erreicht.

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Entwicklung ganzer Organe oder große Stücke von Gewebe in Vitrozu studieren. Vertebrate Organe sind sehr komplex, und ihre Entwicklung wird durch viele verschiedene räumlich-zeitliche Muster geregelt. Die Studie dieser Entwicklungsstörungen Wege beruht auf der Fähigkeit, die Signale zu manipulieren, die sie zu regulieren. Aktuelle Methoden beschränken diese Manipulation zu relativ kleinen, lokalisierten Bereichen und genug niedrigen Konzentrationen zu embryonalen Tödlichkeit zu vermeiden. Zum Beispiel die ex Ovo -Methode der Kultivierung des gesamte Huhn Embryos im Kultur-18 oder die Methode zum Fenster Eier19 Manipulationen durchzuführen sind begrenzt, dass entweder der gesamte Embryo behandelt werden muss, die Letalität verursachen können, oder nur ein kleiner lokalisierter Bereich wird behandelt. Der Vorteil des hier vorgestellten Protokolls ist, dass die Wirkung dieser Signale auf ganzer Organe oder große Mengen von Gewebe, ohne Auswirkungen auf die embryonale Lebensfähigkeit untersucht werden kann. Dieses Protokoll ist keine Ergänzung mit Kohlendioxid wie in früheren Protokollen15erforderlich. Die Verzögerung in der Entwicklung, die wir beobachten ist von Vorteil, dass schnelle Entwicklungsprozesse untersucht werden können.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren möchte Gregory Haller (Mount Saint Vincent Universität) zu danken, für seine Vorarbeiten bei der Entwicklung des Protokolls. Die Autoren auch möchte Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) danken für seine technische Expertise und Unterstützung bei den Dreharbeiten und Produktion von Audio/visuellen Teil des Manuskripts. Daniel Andrews wurde unterstützt durch die Finanzierung von MSVU und naturwissenschaftlich-technischen Forschung Rat von Kanada (NSERC) über ein Undergraduate Student Research Award. Tamara A. Franz-Odendaal wird durch eine NSERC Discovery Grant unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm cell culture petri dishes Corning 353001 easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic
100 mm cell culture petri dishes Corning 353003 tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic
paper tissue Kimtech 34155 Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton
wire mesh n/a n/a stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm)
disposable glass pipettes VWR 14673-010 Borosilicate glass disposable 5 3/4"
nutrient medium Gibco 12591-038 Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB)
penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4458 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised
filter paper Whatman 1454 090 semi-porous filter paper 90mm
fertilized chicken eggs Dalhousie University Agricultural College n/a can be obtained from local farms
sodium chloride (NaCl) EMD SX0420-3 sodium chloride crystals, reagent grade
1 L glass bottle VWR 89000-240 1 L pyrex autoclavable glass bottle
ethanol Fisher Scientific BP82011 70% molecular biology grade
tupperware containers n/a n/a store-bought and sterilized with EtOH
disposable razor blades VWR 55411-050 single edge industrial razor blades (surgical carbon steel)
plastic spoons n/a n/a store-bought and sterilized with EtOH
dust mask 3M n/a 3M 8500 Comfort Mask
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 paraformaldehyde, reagent grade, crystalline
neutral-buffered formalin Fisher Scientific 72210 10% neutral buffered formalin
phosphate buffered saline (PBS) n/a n/a 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)
15 ml falcon tubes VWR 21008-216 presterilized centrifuge tubes
forceps FST n/a fine forceps
chick saline  n/a n/a  0.85% NaCl
tinfoil n/a n/a store-bought
paper towel n/a n/a store-bought

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References

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Andrews, D. D. T., Franz-Odendaal, T. A. Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues. J. Vis. Exp. (138), e57619, doi:10.3791/57619 (2018).More

Andrews, D. D. T., Franz-Odendaal, T. A. Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues. J. Vis. Exp. (138), e57619, doi:10.3791/57619 (2018).

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