Summary
Smut svampe forårsager mange ødelæggende landbrugs sygdomme. De er spredt som hvilende teliospores, at spirer i reaktion på miljømæssige stikord. Vi redegøre for to metoder til at undersøge molekylære ændringer under spiring: måling respiration stigning for at opdage metabolisk aktivering og vurdering af skiftende molekylære begivenheder ved at isolere teliospores på forskellige morfologiske stadier.
Abstract
Smut svampe er de ætiologiske agenter af flere ødelæggende landbrugs sygdomme. De er kendetegnet ved produktion af teliospores, som er tykvæggede spredning agenter. Teliospores kan forblive sovende i årtier. Vækstdvale er kendetegnet ved lavt stofskifte, standsede makromolekylære biosyntese og stærkt reduceret niveau af respiration. Når vi modtager den nødvendige miljømæssige signaler, spire teliospores til at producere haploide celler, som kan indlede nye runder af infektion. Teliospore spiring er karakteriseret ved genoptagelsen af makromolekylære biosyntesen, øget respiration og dramatiske morfologiske ændringer. For at netop måle ændringer i cellulære respiration i de tidlige stadier af spiring, har vi udviklet en enkel protokol beskæftiger en Clark-type respirometer. De senere faser af spireevnen er kendetegnet ved bestemte morfologiske ændringer, men spireevnen er asynkron. Vi udviklede en microdissection teknik, der gør det muligt for os at samle teliospores på forskellige spiring stadier.
Introduction
Smut svampe (Ustilaginales) består af mere end 1.600 arter, der inficerer græsser herunder vigtige kornafgrøder af majs, byg, hvede, forårsager milliarder af dollars i afgrøde tab årligt1. Disse svampe er karakteriseret ved produktion af teliospores, der har mørkt pigmenterede cellevægge og spredning agenter. Teliospores funktion til at beskytte genetisk materiale under belastninger af spredning mellem værtsplanter, og kan vare ved i en sovende tilstand for år2. Teliospores er en væsentlig bestanddel af sygdom spredes.
For at studere teliospore biologi, udnytter vores laboratorium model sjofelheder svamp Ustilago maydis (U. maydis), som er den kausale sygdomsagensen 'fælles sjofelheder majs'. Modne U. maydis teliospores er kendetegnet ved vækst anholdelse, reduceret cellulære metabolisme og lave niveauer af cellulære respiration3. Under gunstige forhold (fx., tilstedeværelsen af specifikke sukker), U. maydis teliospores spire og komplet meiose, producerer basidiospores, som kan indlede nye runder af infektion. Spireevnen er karakteriseret ved øget respiration, den tilbagevenden til metaboliske aktivitet og progression gennem observerbare morfologiske stadier af spiring4.
Den indledende fase af spiring omfatter øget respiration og metabolisk funktion, men der er ingen morfologiske angivelser af ændringen. De oprindelige målinger af respiratoriske ændring i U. maydis blev foretaget over 50 år siden, måle iltforbruget manometrically med en Warburg kolbe apparat5. Vi har udviklet en ny og enkel metode til at studere præcise ændringer i respiration under teliospore spiring ved at måle iltforbruget over et tidsforløb af spiring ved hjælp af en Clark-type microrespirometer. Vi har tidligere brugt denne metode til at studere ændringer i respirationsfrekvens mellem vildtype U. maydis haploide celler og mutanter med defekte mitokondrier6, og har tilpasset protokol her for at studere ændringer i teliospore åndedræt under spiring. Dette giver mulighed for præcist at identificere timingen af respiration ændring, således at vi kan målrette teliospores på et passende tidspunkt efter indledningen af spiring at undersøge tidlig molekylære begivenheder. Progression af spiring kan følges mikroskopisk, når promycelia fremgår af teliospore, men den asynkrone natur hæmmede isolation af nok teliospores på et givet tidspunkt for undersøgelsen. Vi udviklede en microdissection teknik svarende til dem, der anvendes til in vitro- befrugtning til fysisk indsamle teliospores på forskellige morfologiske stadier af spireevnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. majs Cob infektion
- Dyrke Zea mays (cv. Golden Bantam) indtil kolber er dannet og er begyndt at silke (ca. 60 dage).
- Kultur kompatibel haploide U. maydis stammer bruger standardprotokoller som tidligere beskrevet7.
- Inficere majs kolber bruger standardprotokoller som tidligere beskrevet7.
2. teliospore høst
- Autoklave udstyr (Büchner tragte, Büchner kolber, blendere, 250 mL centrifugeres flasker, flad spatler og vand) ved hjælp af en standard tør cyklus med mindst 30 min. sterilisation ved 121 ° C (standard flydende cyklus for vand).
- Fjern inficerede kolber fra planter (ca 28-35 dage efter infektion) ved hjælp af en barberkniv og indstille kolber på en bakke dækket i bænk protector.
- Fjern tumorer fra kolber med et barberblad og indsamle i et bægerglas.
- Fylde en 250 mL laboratorium blenderen kop med tumorer indtil ca 1/3 fuldt opladet og tilføje autoklaveres dH2O indtil blender cup er ca 3/4 fuld. Forstyrre tumorer af pulserende blender på lavt, indtil homogeniseret.
- Tilslut vakuumpumpen til en vandlås og derefter til en 1 L Büchner kolbe.
- Indsætter stor Büchner tragt i kolben og linje i bunden af Büchner tragten med fire lag af ostelærred.
- Tænd vakuumpumpen.
- Hæld en del af de homogeniserede tumorer gennem ostelærred og Skrab med en spatel.
- Hæld nogle dH2O i ostelærred for at skylle teliospores igennem.
- Gentag indtil dH2O kommer gennem ostelærred er klar.
- Vride ud ostelærred indeholdende homogeniseret tumor materiale ind i filteret for at sikre maksimal teliospore opsving.
- Når 1 L Büchner kolbe er at komme tæt på fuld, tømme det i en stor Erlenmeyerkolbe og sæt den til side.
- Lagt et nyt stykke ostelærred i filteret og gentage trin (2,7 – 2.12) indtil alle tumorer har været forstyrret og filtreret.
- Hæld de filtrerede teliospores i autoklaveres 250 mL centrifugeres flasker og centrifugeres ved 1.000 x g i 5 min, og den dekanteres.
- Gentag trin 2.14 indtil alle de filtrerede teliospores er i pelleted ved centrifugering.
- Suspendere piller i en lille mængde af vand og overførsel til 50 mL centrifugeglas.
- Centrifugeres rør på 1.000 x g i 5 min, og den dekanteres.
- Suspendere pellet i ca. 50 mL dH2O, centrifugeres rør på 1.000 x g i 5 min, og den dekanteres. Forsigtigt skrabe ud den grå top lag med en spatel og bortskaffe det. Gentag indtil der ikke længere er en grå lag på toppen.
- Tør prøverne natten over i et vakuum ekssikkator.
- Store tørrede teliospores ved 4 ° C indtil brug.
-
Hvis det ønskes, behandle teliospores med kobbersulfat8 før overtalelse at spire. Hvis de ikke behandles, derefter udføre grundig mikroskopisk analyse af teliospores at bekræfte stikprøven repræsenterer ren teliospores og er blottet for bakteriel eller anden kontaminering.
- Der afvejes ca. 50 mg teliospores i 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Tilføje ca. 1,0 mL 0,75% CuSO4 til 1,5 mL microcentrifuge rør indeholdende teliospores. Pipetteres op og ned for at suspendere teliospores i opløsningen CuSO4 efterfulgt af agiterer prøve for 3 h.
- Centrifugeres prøve på 2.500 x g i 5 min og Fjern supernatanten. Teliospore resuspenderes med sterilt vand, gentage centrifugeringen, og Fjern supernatanten.
- Gentag trin 2.21.3 to gange mere.
3. teliospore levedygtighed og spiring Test
- Afvejes ca. 10 mg U. maydis teliospores i 1,5 mL microcentrifuge rør til at vurdere deres levedygtighed og timingen af spireevnen.
- I en biosikkerhed kabinet, forberede kartoffel dextrose bouillon (FBF, 24 g/L) suppleret med streptomycin sulfat (160 µg/mL).
- Suspendere teliospores i 500 µL af FBF. Tilsæt forsigtigt for at blande og opløse alle klumper af teliospores.
- Overfør teliospore suspension til en autoklaveres 250 mL Erlenmeyer-kolbe, som indeholder 10 mL af det foreløbige budgetforslag.
- Inkuber i kolben ved 28 ° C rystelser ved 90 rpm for 12-16 h.
- I en biosikkerhed kabinet, fjerne en 20 µL udsnit af teliospores induceret at spire og forberede et objektglas.
-
Ved hjælp af et mikroskop, visuelt vurdere stadier af spireevnen, der er til stede og tilstedeværelsen af bakteriel forurening.
- Tæl antallet af teliospores på stadier jeg gennem V ved hjælp af en hemocytometer og bestemme den procent, der har spiret.
- Hvis eneste trin I teliospores er til stede, fortsat at udruge kolbe for i alt 24 timer før vurderingen af teliospore spiring. Fortsætte inkubation i højst 48 h før anse prøven ikke-levedygtige.
- Hvis bakteriel forurening er til stede, supplerer det foreløbige budgetforslag med kanamycin sulfat (50 µg/mL) og streptomycin sulfat (160 µg/mL) og Gentag derefter trin 3.1 til 3,7. Hvis bakteriel forurening fortsætter, behandle teliospores med kobber sulfat og Gentag trin 3.1 til 3.7.
4. induktion af spireevnen for Respiration overvågning
- Vejer lige mængde (fx., 50 mg) af teliospores for hvert åndedræt eksperiment.
- I en biosikkerhed kabinet, skal du føje teliospores til en autoklaveres respiration kammer.
- Fyld salen med FBF (24 g/L) suppleret med streptomycin sulfat (160 µg/mL) og kanamycin sulfat (50 µg/mL).
- Pipetteres op og ned for at oprette en teliospore suspension.
- Låget kammer i salen til at skabe luft stramme forsegling.
5. at indhente målinger af ilt forbrug sats (OCR)
- Sted i salen i salen rack inde i et vandbad (forvarmet til 28 ° C).
- Sted O2 sonden inde i åbningen af salen.
- Overvåge datapunkter vises i realtid på programmet "SensorTrace kurs", og lade sonden stabilisere (~ 3 min efter sonden er placeret i salen).
- Klik på "Foranstaltning" for at måle O2 niveauer uafbrudt i 6 h med målinger registreres med 2 s intervaller.
- Stop måling, og Gentag trin 4.1 – 5.4 for hver prøve analyseres.
- Eksportere data til Microsoft Excel ved at klikke på "fil | Eksportere | Gem som .xls".
6. dataanalyse
-
Beregne OCR
- I den eksporterede Excel-fil under fanen "Within_Rates" optage "Sats" for hver afdeling måling (nmol/h).
- For hver eksperimentel prøve, subtrahere "Sats" det tomme kammer fra "Sats" eksperimentel prøve kammer til at få en korrigeret OCR værdi, og tage den absolutte værdi af dette tal.
- Beregne den samlede OCR pr. mg af teliospores ved at dividere den korrigerede absolutte OCR værdi af cellulære masse anvendes.
- Gennemsnit replikere "OCR pr. mg af teliospores" værdier for hver stamme.
- Analysere data ved hjælp af passende statistiske metode (fx., student's t-test, variansanalyse) ved hjælp af Microsoft Excel af andre statistiske software.
- Graf rådata, beregne procentdelen af ilt resterende for hvert tidspunkt, du vil afbilde. Opdele førstebehandlingen af sig selv og ganger med 100 (100% ilt resterende), derefter opdele hver efterfølgende læsning ved førstebehandlingen og multipliceres med 100 for at få procent af ilt tilbage i salen.
7. induktion af Teliospore spiring at isolere Teliospores på forskellige stadier af spiring
- Udarbejde FBF (24 g/L) suppleret med streptomycin sulfat (160 µg/mL) i et kabinet biosikkerhed.
- Læg ca. 10 mg U. maydis teliospores i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Suspendere teliospores i 500 µL af FBF. Forsigtigt pipette til bland indtil der er ingen klumper af teliospores på mellemlang.
- Overfør teliospore suspension til en autoklaveres 250 mL Erlenmeyer-kolbe indeholdende FBF suppleret med streptomycin sulfat.
- Inkuber kolbe overnatning på 28 ° C rystelser ved 90 rpm.
8. forberedelse af petriskål og Micromanipulator
-
Forberede en petriskål (57 cm2) af pipettering rækker af droplets til microcapillary forberedelse og prøvetagning.
- Med pipette overfoeres 5 µL (x 4) dH2O dråber på tværs af toppen af petriskålen.
- Der afpipetteres 2 µL (x3) af RNA stabilisering løsning på petriskål skal bruges til stikprøve samling.
- Der afpipetteres 5 µL (x 30) dråber af spire teliospores på petriskålen.
- Tilsættes 15 mL af mineralsk olie til petriskålen. Sikre, at alle dråber er dækket af olie, før du fortsætter.
- Forberede en microcapillary med en 15 µm indre diameter, 1 mm flange, 55 mm længde og en 20° spids vinkel ved at placere det i microcapillary indehaveren og nedsænkning det i mineralsk olie hvor kapillaritet vil tillade mineralsk olie ind i microcapillary. Frigivelse af trykket i microcapillary før at bringe det til vanddråbe. Aspirat at forberede microcapillary med vand.
9. isolering af fase-specifikke spire Teliospores
- Ved hjælp af kontrolelementerne i micromanipulator, flytte den forberedte microcapillary til en af spiring dråber. Trænge slipværktøjet, sænke microcapillary og bringe mundingen af microcapillary op til en germinating teliospore på stadiet af spiring af interesse.
- Langsomt Aspirér for at fange den germinating teliospore. Stop sugning når teliospore har indtastet microcapillary. Gentag, indtil der er cirka fem teliospores i microcapillary.
- Hæv microcapillary med micromanipulator og bringe det til samling dråbe af RNA stabilisering løsning. Trænge dråben og tilføre slipværktøjet til teliospores.
- Gentag trin 8,1 til 8,3 indtil ca 1.000 teliospores blevet fanget.
10. inddrivelse af samling slipværktøj
- Pipetteres op samling droplet og overføre det til låget af en RNase/DNase-frit 2,0 mL microcentrifuge tube. Fjern forsigtigt mineralsk olie med en pipette uden at forstyrre samling slipværktøjet.
- Brug teliospores til downstream applikationer såsom RNA isolering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af Clark-type microrespirometer-baseret metode til måling af ændringer i respiration under teliospore vækstdvale og spiring, bekræftede vi, at hvilende teliospores udviser en lav grad af respiration (~ 1,075 µmol/h/mg) i forhold til at spire teliospores (~ 2,614 µmol/h/mg; Figur 1A). Dette repræsenterer en ~2.4-fold ændring i gennemsnitlige sats for respiration mellem hvilende teliospores og teliospores, der har været tilskyndet til at spire. Derudover har vi identificeret, teliospores, der har været tilskyndet til at spire har en ~ 45 min. forsinkelse i iltoptagelse (figur 1B). Dette angives af ~ 30 min. forsinkelse i iltoptagelse (figur 1B) ud over ~ 15 min forsinkelse mellem induktion af spiring og start af ilt målinger. Denne identificerer et tidspunkt for at begynde at vurdere molekylære ændringer i de germinating teliospores, der ikke ændrer sig synligt.
Efterfølgende ændringer under spiring kan observeres mikroskopisk. Fem stadier af spiring blev fastsat. Første fase af spiring repræsenterer teliospores, der har været tilskyndet til at spire, men stadig ikke kan skelnes fra sovende teliospores. Fase II teliospores har en nye promycelium med en længde, der er mindre end eller lig med diameter på teliospore. Fase III teliospores har promycelia, der er større end teliospore diameter. Fase IV af spireevnen er de første spirende af basidiospores fra promycelia, og fase V er de resulterende haploide basidiospores, der inddeler af spirende (figur 2). Ved hjælp af microdissection teknik, som vi har udviklet, har vi med succes isoleret 500 til 1.000 spirende teliospores til downstream applikationer såsom RNA isolering for RT-PCR eller RNA-Seq (tabel 1). Figur 3 viser den generelle sæt af Petri dish for microdissection og trin for microdissection ved hjælp af en micromanipulator.
Figur 1: tidsforløb for iltforbrug under teliospore spiring. Hvilende teliospores blev tilskyndet til at spire, og ilt niveauer blev registreret løbende i 6 timer ved hjælp af en Clark-type microrespirometer. Un-induceret hvilende teliospores blev brugt som en kontrol, og alle målingerne er normaliseret til en blindprøve. (A) Data repræsenteret som gennemsnitlige OCR. (B) rå data afbildes at opnå respiration kurver, tillader registrering af ændringer i OCR under tidsforløb. Teliospores, der har været tilskyndet til at spire forbruger ilt på gennemsnitligt 2.4-fold hurtigere end un-induceret hvilende teliospores (p < 0,01; Student's t-test). SVIN: efter induktion af spireevnen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: faser af teliospore spiring. Faser jeg gennem V af teliospore spiring er illustreret (A-E). Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Microdissection til at isolere særskilte morfologiske stadier af spirende teliospores. Den generelle nedsat en Petri dish for microdissection og foranstaltninger til isolering af teliospore i fase III af spireevnen er illustreret. (A) Illustration af en petriskål oprettet med rækker af dråber indeholdende enten sterilt vand, RNA stabilisering løsning, eller spirende teliospores. Efter spiring induktion blev teliospores isoleret på bestemte stadier i spiring ved hjælp af microdissection. (B) en spiring droplet indeholdende induceret for at spire teliospores i stadier jeg gennem III. (C) en rede microcapillary blev bragt til en fase III teliospore for indsamling gennem aspiration. (D) den fase III teliospore i et glas microcapillary er fjernet fra spiring droplet og flyttede til en samling slipværktøj. (E) microcapillary blev indsat i samling droplet indeholdende RNA stabilisering løsning og fase III teliospore blev sprøjtet ind i slipværktøjet. (F) en samling af fase III teliospores i RNA stabilisering løsning. Skalalinjen = 20 µm (A-D, F) og 50 µm (E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Spiring fase | Antallet af spire teliospores isoleret |
| Første fase | 1.000 |
| Fase II | 500 |
| Fase III | 650 |
Tabel 1: antallet af spire teliospores held isoleret for hver spiring i en standard isolation eksperiment. Tabellen viser gennemsnitlige antal teliospores, der er blevet isoleret ved hjælp af microdissection for faser jeg gennem III før samling for efterfølgende ansøgninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Basidiomycete biotrophic plante patogener forårsage milliarder af dollars i afgrøde tab årligt. Langt størstedelen af disse patogener producere teliospores, der er integreret til svampe spredning og seksuel reproduktion. At få viden om udviklingen og spiring af teliospores er afgørende for at forstå udbredelsen af de ødelæggende sygdomme forårsaget af disse svampe. For at identificere molekylære ændringer på vigtige kontrolpunkter har vi udtænkt en metode til at identificere timingen af fysiologiske ændringer og en anden til at isolere teliospores på forskellige stadier af spireevnen. Seto et al. (upubliceret) noterede fem stadier af teliospore spiring ved lysmikroskopi (figur 2). For at undersøge fysiologiske aktivering under første fase og for at vurdere åndedræt sats under spiring, vi brugte en Clark-type microrespirometer til præcis måling af ændringer i forbrug af ilt. Vores prøve data viser, at vores metode er præcis og yderst reproducerbare. Vores resultater bekræfter, at spire U. maydis teliospores udviser en drastisk stigning i cellulær respiration i forhold til un-induceret hvilende teliospores. For første gang har vi identificeret, at U. maydis teliospores, der har været tilskyndet til at spire udviser en ~ 45 min. forsinkelse i iltoptagelsen. Dette tyder på, at U. maydis teliospores kan kræve lidt tid til at behandle spiring signaler (fx., tilstedeværelsen af sukker) inden besvarelsen, at øget iltoptagelse er ikke blandt de meget umiddelbare svar til spiring signaler eller at vores analyse ikke var følsomme nok til at opdage minimal ændringen i indledende iltoptagelsen.
Tidligere studier undersøger respiration satser af sjofelheder teliospores3 påberåbt sig en Warburg kolbe apparat til at måle ilt niveauer manometrically5. Kort, denne metode måler forbrug af ilt og CO2 produktion ved at opdage ændringer i tryk i en lukket kolbe gennem direkte observation af væske niveau ændringer i manometer arm. Eksperimenter kan være svært at sætte op, og målinger kan være upræcise. Apparatet skal være deltog i hele perioden, måling, og omfattende beregninger er forpligtet til at vurdere OCR. Vores protokol gør brug af teknologiske fremskridt, eliminerer kravet for brugeren at forblive ved apparatet for varigheden af forsøget, tage målinger af øjet og bruge omfattende matematiske formler. Andre har brugt tidligt Clark-type respirometers til foranstaltning OCR Neurospora crassa9 og Botryodpilodia theobromae10 sporer, men disse tidlige instrumenter tilladt kontinuerlige målinger i en periode på højst 20 min. Denne begrænsning ville ikke have tilladt identifikation af ~ 45 min. forsinkelse i iltoptagelse vi observeret med den nyere model respirometer. Vores protokol har gjort data fortolkning enklere, som udlæsningen er koncentrationen af ilt tilbage i salen, som kan være direkte grafen uden beregninger eller data manipulation. Det er derudover muligt at tage kontinuerlige målinger (hver 2 s) for et ubestemt tidsrum indtil tilgængelig ilt er helt opbrugt. Dette tillader identifikation af små ændringer i respiration over en lang periode. Derfor har vi forbedret tidligere teknikker og udviklet en enkel, præcis og reproducerbar metode til at måle iltforbrug af svampesporer. Til vores viden er dette den første undersøgelse at bruge et moderne Clark-type respirometer til at studere respiration af hvilende versus spire teliospores af sjofelheder svampe.
Trods den lethed og enkelhed af denne protokol, optimering er nødvendig og der er biologiske realiteter, der begrænsede analysen. Første, passende stikprøver skal identificeres for at opnå en rimelig OCRs. For meget prøve kan føre til for tidlig bryder sammen af ilt niveauer, og for lidt prøven kan resultere i manglende evne til at observere meningsfulde forandringer i forbrug af ilt. For det andet er det bydende nødvendigt at give sonde tid til at stabilisere (~ 3 min) for at give nøjagtige indledende data. Endelig er det vigtigt at supplere spiring medium med antibakterielle midler (fx., streptomycin sulfat) for at sikre bakteriel forurening ikke ændrer OCR aflæsninger. De biologiske begrænsninger, vi står over for var en lav spiring sats over tidsforløb målemetoder, (~ 1%), som bestemmes ved at observere visuelle morfologiske ændringer. Bestemmelse af spore levedygtighed ville muliggøre denne sats bestemmelse skal konverteres til en sats pr. spore antallet og isolere teliospores med højere satser for spiring ville føre til højere OCRs. Asynkron spiring af U. maydis teliospores11 er en realitet, der skal gøres rede for og kan have bidraget til en manglende evne til at detektere iltforbrug tidligere i spiring.
For at forbedre nøjagtighed og præcision af måle ændringer i teliospore respiration, kunne fremtidige tilpasninger af denne metode omfatte måling OCR på en enkelt celle-basis. Micromanipulation teknikker kunne bruges til at isolere et enkelt teliospore, som derefter kan blive tilskyndet til at spire, og dets åndedræt sats kan overvåges. Dette kunne forbedre opløsning, give oplysninger om OCR under vækstdvale-spiring Skift pr. teliospore, ikke pr. mg af teliospores. Desuden ville dette løse konfunderende spørgsmålet om asynkron spiring.
I senere faser af spiring udviklede vi en micromanipulation metode til at isolere teliospores i fælles faser af spireevnen. Dette tillod oprettelsen af relativt synkron teliospore befolkninger til analyse. Forskellige metoder til isolering af enkelt mikroorganismer er blevet beskrevet og har blevet forbedret over år12. Disse metoder omfatter fortynding af spore suspensioner at få enkelt mikroorganismer, semi-mekaniske metoder med brug af microcapillaries at opnå sporer, der er overført til medium til dyrkning og mekaniske metoder, der bruger micromanipulators . Tidligere metoder, som vi brugte til at få teliospores på den samme fase af spiring omfatter counterflow centrifugal elutriation og filtrering spire teliospores gennem en nylon membran med en specifik porestørrelse. Ved hjælp af disse metoder, gav os mulighed for at berige for spirende teliospores, men indeholdt vores prøver stadig teliospores i forskellige stadier af spiring13. Nuværende teknologi til micromanipulation af enkelt mikroorganismer er forbedret med indførelsen af højere forstørrelse og instrumenter for fine kontrol kapillær nåle, aspiration og overførsel af mikroorganismer. Tidligere micromanipulation teknikker har fokuseret på isolering af enkelt celler til dyrkning eller anvendelse i enkelt celle PCR programmer14. Brugen af micromanipulators til at isolere enkelt svampesporer ikke tidligere er blevet etableret. En tidligere metode til isolering af enkelt svampesporer involveret brugen af fine pincet eller nåle plukker små stykker af solid medium indeholdende spire sporer15. Micromanipulation med brug af micromanipulators er meget udbredt i gær undersøgelser hvor klynger af Ascosporerne kan være adskilt følgende sporulering i kultur på agarsubstratet for meiotiske genetisk analyse16. Vi har udviklet en metode, som kombinerer micromanipulation teknik for bakterieceller14 og in vitro- befrugtning metoder til isolering af spirende teliospores. Vi har vist, at hundredvis af fælles spiring fase teliospores kan opnås med denne teknik. Disse prøver kan bruges til downstream udtryk undersøgelser ved hjælp af teknikker som RT-qPCR eller RNA-FF. at opnå en befolkning på teliospores, hvor spiringen er synkroniseret tillader analyse af specifikke ændringer i genekspression, der opstår under tidligt, midten og senere faser af teliospore spiring.
Microdissection af scenen specifikke spire teliospores kan kræve erfaring i sæt op og anerkende de forskellige stadier af spiring, dog denne erfaring kan opnås hurtigt gennem praksis. Der er flere trin, der skal følges for vellykket microdissection efterfulgt af RNA isolering. Først, spiring medium skal suppleres med antibiotika (fx., streptomycin sulfat) til at undertrykke væksten af bakteriel forurening når spiring initieres og under samling af spirende teliospores. Anden, det er vigtigt at bruge en stabilisering løsning til at stabilisere og beskytte RNA til isolation. RNA stabilisering løsning forhindrer også indsamlet teliospores fra går videre til den næste spiring fase samtidig med at indsamle yderligere teliospores. For det tredje er det vigtigt at fjerne mineralsk olie når samling droplet er blevet inddrevet for at sikre vellykket RNA udvinding. Endelig, vi har bemærket nogle tab af RNA kvalitet hvis isolerede teliospores gemmes i RNA stabilisering løsning for en længere periode; Det anbefales derfor, at RNA er isoleret umiddelbart efter samling af spiring fase specifikke teliospores. En begrænsning af metoden er, at fase jeg teliospores indsamlet kunne indeholde hvilende, døde og induceret at spire teliospores, som disse tre faser er morfologisk skelnes. Derudover når at indsamle fase III teliospores, en blanding af teliospores i meiose jeg eller meiose II kunne opnås. En måde at støtte i at skelne mellem virkelig hvilende og døde teliospores kunne være at fastlægge levedygtigheden af prøven. En metode til vurdering af svampe spore levedygtighed ved hjælp af live/døde celle levedygtighed assays muligvis at vurdere andelen af levedygtige teliospores hvorfra mere informativ spiring priser kunne være beslutsom17. Derudover kan kernen farvning med DAPI, for eksempel, bruges til at visualisere begivenhederne i meiose, der finder sted i løbet af fase III og overgangen til stadie IV for at yderligere karakterisere teliospores morfologisk i fase III. Dette vil støtte i samlingen af teliospores i kun en etape af spiring ved hjælp af vores microdissection metode.
Afslutningsvis har vi udviklet en enkel, præcis og reproducerbar metode til måling af ændringer i cellulære respiration, der opstår under vækstdvale-spiring skift af Ustilago maydis teliospores. Derudover har vi udviklet en metode til indsamling af bestemte faser af spirende teliospores, der kunne bruges til downstream applikationer, såsom RNA-FF. Vores metoder kan tilpasses til at rumme forskellige celletyper og arter. Vi forventer, at forbedringer af vores teknikker vil lette påvisning af respiratorisk ændringer på en enkelt spore niveau samt yderligere definition af de begivenheder, der forekommer i de senere stadier af spireevnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser eller andre interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Paul Frost for brugen af hans microrespirometer, og Nicole Wagner og Alex Bell for teknisk bistand. Dette arbejde blev finansieret af et NSERC tilskud til B.J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
- Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. Swan, A. , InTech. 411-460 (2012).
- Christensen, J. J. Monograph Number 2. , The American Phytopathological Society. Worcester, MA. (1963).
- Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
- Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
- Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
- Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).
- Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).
- Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
- Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).
- Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).
- Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).
- Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).
- Seto, A. M. Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , Trent University. M.Sc. thesis (2013).
- Fröhlich, J., König, H. Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. König, H., Varma, A. , Springer. 425-437 (2006).
- Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
- Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).
