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Biology

Untersuchung von Teliospore Keimen mit Microrespiration Analyse und Mikrodissektion

doi: 10.3791/57628 Published: May 13, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Brandpilze verursachen viele verheerende landwirtschaftliche Krankheiten. Sie sind als schlafenden Brandsporen zerstreut, die als Reaktion auf ökologische Hinweise zu keimen. Wir skizzieren zwei Methoden zur Untersuchung von molekularer Veränderungen während der Keimung: Atmung Erhöhung um Stoffwechselaktivierung erkennen Messung und Bewertung von molekularen Ereignisse durch die Isolierung Brandsporen in verschiedenen morphologischen Stadien ändern.

Abstract

Brandpilze sind die ätiologischen Agenten mehrere verheerende landwirtschaftliche Krankheiten. Sie zeichnen sich durch die Produktion von Brandsporen, die dickwandigen Zerstreuung Agenten sind. Brandsporen können jahrzehntelang inaktiv bleiben. Die Keimruhe zeichnet sich durch niedrige Stoffwechselrate, Makromolekulare Biosynthese angehalten und Ebenen der Atmung stark reduziert. Nach Erhalt der erforderlichen Umweltsignale, Keimen Brandsporen um haploide Zellen zu produzieren, die neue Verhandlungsrunden Infektion auslösen kann. Teliospore Keimung zeichnet sich durch die Wiederaufnahme der makromolekularen Biosynthese, erhöhte Atmung und dramatische morphologische Veränderungen. Um Veränderungen der Zellatmung in den frühen Stadien der Keimung genau zu messen, haben wir ein einfaches Protokoll mit einem Clark-Typ Respirometer entwickelt. Die späteren Stadien der Keimung zeichnen sich durch spezifische morphologische Veränderungen, aber Keimung ist asynchron. Wir entwickelten eine Mikrodissektion-Technik, die es ermöglicht uns Brandsporen auf unterschiedliche Keimung Stufen zu sammeln.

Introduction

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Die Brandpilze (Ustilaginales) bestehen aus über 1.600 Arten, die Gräser, einschließlich der wichtigen Getreide Mais, Gerste und Weizen, verursacht Milliarden von Dollar in Ernteverluste zu infizieren jährlich1. Diese Pilze sind gekennzeichnet durch die Produktion von Brandsporen, die haben Zellwände dunkel pigmentiert und sind die Agenten der Zerstreuung. Brandsporen um genetische Material bei den Belastungen der Verbreitung zwischen Wirtspflanzen Schild funktionieren und können in einem schlafenden Zustand für Jahre2bestehen. Als solche sind Brandsporen ein wesentlicher Bestandteil der Ausbreitung der Krankheit.

Um Teliospore Biologie zu studieren, nutzt unser Labor Modell Smut Pilz Ustilago Maydis (U. Maydis), die der kausalen Agent der Krankheit "gemeinsame Smut von Mais" ist. Reifen U. Maydis Brandsporen zeichnen sich durch Wachstum Verhaftung, reduzierte Zellstoffwechsel und geringe Zellatmung3. Bei günstigen Umweltbedingungen (zB., das Vorhandensein von bestimmten Zuckern), U. Maydis Brandsporen Keimen und komplette Meiose, Herstellung von forstwirtschafter die neue Verhandlungsrunden Infektion auslösen können. Keimung zeichnet sich durch erhöhte Atmung, die Rückkehr zur metabolischen Aktivität und das Fortschreiten durch erkennbare morphologische Stadien der Keimung4.

Die erste Phase der Keimung umfasst erhöhte Atmung und Stoffwechsel-Funktion, es gibt jedoch keine morphologischen Hinweise auf Veränderungen. Das original der Atemwege Änderung U. Maydis vor über 50 Jahren Messungen wurden Sauerstoffverbrauch manometrically mit einem Warburg Kolben Apparat5messen. Wir haben eine neue, einfache Methode des Studiums präziser Änderungen in der Atmung während der Keimung der Teliospore durch die Messung von Sauerstoff-Verbrauch über einen zeitlichen Verlauf der Keimung mit einem Clark-Typ-Microrespirometer entwickelt. Wir zuvor verwendet diese Methode, Veränderungen der Atemfrequenz zwischen Wildtyp studieren U. Maydis haploiden Zellen und Mutanten mit defekte Mitochondrien6, und haben das Protokoll hier angepasst, um Veränderungen in der Teliospore Atmung während zu studieren Keimung. Dadurch können das Timing der Atmung Änderung genau zu identifizieren, so dass wir zum gegebenen Zeitpunkt nach der Einleitung der Keimung zu frühen molekularen Ereignisse untersuchen Brandsporen ausrichten können. Das Fortschreiten der Keimung kann mikroskopisch verfolgt werden, sobald der Promycelia ergibt sich aus der Teliospore, aber die asynchrone Natur, die Isolation der genug Brandsporen zu einem gegebenen Zeitpunkt für die Untersuchung gehemmt. Wir entwickelten eine Mikrodissektion Technik ähnlich denen für die in-vitro- Befruchtung, um körperlich Brandsporen an verschiedene morphologische Stadien der Keimung zu sammeln.

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Protocol

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(1) Corn Cob Infektion

  1. Zea Mays (CV Golden Bantam) wachsen bis Kolben gebildet sind und damit, Seide (ca. 60 Tage begonnen haben).
  2. Kultur kompatibel haploiden U. Maydis Stämme mit Standardprotokollen wie zuvor beschrieben7.
  3. Maiskolben mit Standardprotokollen wie zuvor beschriebenen7zu infizieren.

2. Teliospore Ernte

  1. Autoklaven-Ausrüstung (Büchner Trichter, Büchner Flasks, Mixer, 250 mL Zentrifuge Flaschen, flachen Spatel und Wasser) mit einem Standard-trocken-Zyklus mit mindestens 30 min Sterilisation bei 121 ° C (flüssige Standardzyklus für Wasser).
  2. Entfernen Sie infizierten Maiskolben aus Pflanzen (ca. 28-35 Tage Post Infektion) mit einer Rasierklinge zu und setzen Sie die Maiskolben auf einem Tablett in Bank-Schutz abgedeckt.
  3. Die Tumoren von Maiskolben mit einer Rasierklinge zu entfernen und in ein Becherglas sammeln.
  4. Eine 250 mL-Labor-Mixbecher mit Tumoren bis zu ca. 1/3 voll füllen und autoklaviert dH2O hinzufügen, bis der Mixbecher etwa 3/4 ist voll. Stören Sie die Tumore durch den Mixer bei niedrigen, Pulsieren, bis homogenisiert.
  5. Verbinden Sie die Vakuumpumpe einen Wasserabscheider und dann eine Flasche 1 L Büchner.
  6. Legen Sie großen Büchner Trichter in die Flasche und Boden Sie den des Büchner-Trichter mit vier Schichten von Gaze.
  7. Schalten Sie die Vakuumpumpe.
  8. Gießen Sie einen Teil der homogenisierten Tumoren durch die Gaze und kratzen mit einem Spachtel.
  9. Gießen Sie einige dH2O in die Gaze um die Brandsporen durch spülen.
  10. Wiederholen Sie, bis die dH-2O kommen durch die Gaze ist klar.
  11. Wringen Sie die Gaze mit der homogenisierten tumormaterial in den Filter, um maximale Teliospore Erholung zu gewährleisten.
  12. Wenn die Flasche 1 L Büchner ist nah an immer voll, leeren Sie ihn in eine große Erlenmeyerkolben und legen Sie sie beiseite.
  13. Legen Sie ein neues Stück Gaze in den Filter und wiederholen Sie die Schritte (2,7 – 2,12), bis alle Tumoren gestört und gefiltert haben.
  14. Gießen Sie die gefilterten Brandsporen in autoklaviert 250 mL Zentrifuge Flaschen und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min und Dekantieren Sie des Überstandes.
  15. Wiederholen Sie Schritt 2.14, bis alle gefilterten Brandsporen durch Zentrifugation pelleted sind.
  16. Unterbrechen Sie die Pellets in einer kleinen Menge von Wasser und Übertragung auf 50 mL Zentrifuge Röhren.
  17. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1.000 x g für 5 min und Dekantieren Sie des Überstandes.
  18. Anhalten Sie das Pellet in ca. 50 mL dH2O, Zentrifugieren Sie die Rohre bei 1.000 x g für 5 min und Dekantieren Sie des Überstandes. Mit einem Spatel und entsorgen Sie es sanft die grauen Deckschicht abkratzen. Wiederholen Sie, bis eine graue Schicht gibt es nicht mehr an der Spitze.
  19. Trockenen Übernachtung die Proben in ein Vakuum Exsikkator.
  20. Getrocknete Brandsporen bei 4 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.
  21. Auf Wunsch behandeln der Brandsporen mit Kupfersulfat8 vor der Induktion zu keimen. Wenn nicht behandelt wird, führen Sie gründliche mikroskopische Analyse der Brandsporen bestätigen die Probe steht für pure Brandsporen und ist frei von Bakterien oder anderen Verunreinigungen.
    1. Etwa 50 mg Brandsporen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch abwiegen.
    2. Die 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit der Brandsporen fügen Sie etwa 1,0 mL 0,75 % CuSO4 hinzu . Pipette rauf und runter um den Brandsporen in der CuSO4 Lösung gefolgt von agitieren die Probe für 3 h zu unterbrechen.
    3. Die Probe bei 2.500 x g für 5 min zentrifugieren und den überstand zu entfernen. Aufschwemmen Sie Teliospore Pellet mit sterilem Wasser, wiederholen Sie die Zentrifugation und entfernen Sie den überstand zu.
    4. Wiederholen Sie Schritt 2.21.3 zwei weitere Male.

3. Teliospore Lebensfähigkeit und Keimung Test

  1. Wiegen Sie ca. 10 mg U. Maydis Brandsporen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch ihre Lebensfähigkeit zu beurteilen und das Timing der Keimung.
  2. Bereiten Sie in einen Schrank Biosafety Kartoffel Traubenzucker Brühe (PDB, 24 g/L) ergänzt mit Streptomycin Sulfat (160 µg/mL).
  3. Aussetzen der Brandsporen in 500 µL PDB. Leicht zu mischen und brechen alle Klumpen von Brandsporen pipette.
  4. Übertragen Sie die Teliospore Federung auf eine autoklaviert 250 mL Erlenmeyerkolben mit 10 mL der PDB.
  5. Inkubieren Sie die Flasche bei 28 ° C schütteln bei 90 u/min für 12 – 16 Uhr.
  6. Entfernen Sie in einen Schrank Biosafety eine 20 µL Probe der Brandsporen Keimen und bereiten einen Objektträger induziert.
  7. Beurteilen Sie unter Verwendung eines Mikroskops, visuell Stadien der Keimung, die vorhanden sind und das Vorhandensein der bakteriellen Kontamination.
    1. Die Anzahl der Brandsporen an inszeniert ich durch V mit einem Hemocytometer und bestimmen die Prozent, die gekeimt haben.
    2. Wenn auch nur Phase I Brandsporen vorhanden sind, weiterhin die Flasche für eine Gesamtmenge von 24 h vor der Beurteilung Teliospore Keimung inkubieren. Weiter Inkubation für maximal 48 h vor erachtend die Probe nicht lebensfähig.
    3. Wenn bakterielle Kontamination vorliegt, ergänzen Sie die PDB-Datei mit Kanamycin Sulfat (50 µg/mL) sowie Streptomycin Sulfat (160 µg/mL) und dann wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.7. Bakterielle Kontamination besteht weiterhin, behandeln Sie Brandsporen mit Kupfersulfat zu, und wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.7.

(4) die Induktion der Keimung zur Überwachung der Atmung

  1. Gleich viel wiegen (zB., 50 mg) der Brandsporen für jedes Experiment Atmung.
  2. In ein Kabinett Biosafety Brandsporen Hinzufügen einer autoklaviert Atmung Kammer.
  3. Füllung der Kammer mit PDB (24 g/L) ergänzt mit Streptomycin Sulfat (160 µg/mL) und Kanamycin-Sulfat (50 µg/mL).
  4. Pipette rauf und runter, um eine Teliospore Aussetzung zu erstellen.
  5. Deckel in der Kammer luftdichten Abdichtung Kammer.

5. Erhalt Sauerstoff Verbrauch (OCR) Messungen

  1. Legen Sie die Kammer in der Kammer-Rack in einem Wasserbad (28 ° c vorgewärmt).
  2. Legen Sie die O-2 -Sonde in der Öffnung der Kammer.
  3. Überwachen Sie der Datenpunkte erscheinen in Echtzeit auf dem "SensorTrace-Rate"-Programm, und lassen Sie die Sonde zu stabilisieren (~ 3 min nachdem die Sonde in die Kammer gebracht wird).
  4. Klicken Sie auf "Messen" O2 Ebenen kontinuierlich für 6 h mit Messungen aufgezeichnet in 2 s Abständen zu messen.
  5. Stoppen Sie die Messung zu, und wiederholen Sie die Schritte 4.1 – 5,4 für jede Probe analysiert werden.
  6. Die Daten nach Microsoft Excel exportieren, indem Sie auf "Datei | Exportieren | Als .xls speichern Sie".

(6) Datenanalyse

  1. Berechnen Sie OCR
    1. Zeichnen Sie in der exportierten Excel-Datei auf der Registerkarte "Within_Rates" auf "Rate" für jede Kammer-Messung (Nmol/h).
    2. Subtrahieren Sie für jede experimentelle Probe "Rate" der leere Kammer von der "Rate" von der experimentellen Probenraum um eine korrigierte OCR-Wert zu erhalten, und nehmen Sie der Absolute Wert dieser Zahl zu.
    3. Berechnen Sie die gesamten OCR pro mg Brandsporen durch Division den korrigierten absolute OCR-Wert durch die zelluläre Masse verwendet.
    4. Durchschnitt zu replizieren "OCR pro mg Brandsporen" Werte für jede Belastung.
  2. Analysieren Sie die Daten mit entsprechenden statistischen Methode (zB., Student t-Test, Analyse der Varianz) mithilfe von Microsoft Excel der anderen Statistiksoftware.
  3. Raw Daten grafisch darstellen, Berechnen der Sauerstoffgehalt bleibt für jeden Zeitpunkt, die Sie grafisch darstellen möchten. Ersten Lesung durch selbst teilen multiplizieren mit 100 (100 % Sauerstoff verbleibende), dann teilen Sie jede nachfolgende Messung durch die erste Lesung und multiplizieren mit 100 Prozent des Sauerstoffs, die noch in der Kammer zu erhalten.

(7) Induktion von Teliospore Keimen Brandsporen in unterschiedlichen Stadien der Keimung zu isolieren

  1. Bereiten Sie PDB (24 g/L) ergänzt mit Streptomycin Sulfat (160 µg/mL) in eine biologische Kabinett vor.
  2. Legen Sie etwa 10 mg U. Maydis Brandsporen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
  3. Aussetzen der Brandsporen in 500 µL PDB. Sanft, Pipette, mischen, bis es keine Klumpen von Brandsporen im Medium gibt.
  4. Übertragen Sie die Teliospore Federung auf eine autoklaviert 250 mL-Erlenmeyerkolben mit PDB ergänzt mit Streptomycin Sulfat.
  5. Inkubieren Sie die Flasche über Nacht bei 28 ° C bei 90 u/min schütteln.

8. Vorbereitung der Petrischale und Mikromanipulator

  1. Vorbereiten einer Petrischale (57 cm2) durch pipettieren Reihen von Tröpfchen Microcapillary Vorbereitung und Probenentnahme.
    1. Pipette 5 µL (x 4) dH2O Tröpfchen am oberen Rand der Petrischale.
    2. Pipette 2 µL (x3) RNA-Stabilisierung-Lösung auf der Petrischale für die Probenahme verwendet werden.
    3. Pipette 5 µL (x 30) Wassertropfen Keimen Brandsporen auf der Petrischale.
  2. Die Petrischale 15 mL Mineral Öl hinzufügen. Sicherstellen Sie, dass alle Tröpfchen durch Öl, bevor Sie fortfahren.
  3. Bereiten Sie einen Microcapillary mit einer 15 µm Innendurchmesser, 1 mm Flansch, 55 mm Länge und einem Winkel von 20° Tipp indem man es in der Microcapillary Inhaber und Eintauchen in das Mineralöl wo Kapillarwirkung das Mineralöl der Microcapillary eingeben können. Lassen Sie den Druck in der Microcapillary, bevor es auf den Wassertropfen. Zur Vorbereitung der Microcapillary mit Wasser abzusaugen.

9. Isolation der Bühne-spezifische Keimen Brandsporen

  1. Verwenden die Steuerelemente der Mikromanipulator, verschieben Sie die vorbereiteten Microcapillary zu einem der Keimung Tröpfchen. Dringen Sie des tröpfchens ein, senken Sie die Microcapillary und bringen Sie die Mündung des Microcapillary bis zu einer keimenden Teliospore in der Phase der Keimung von Interesse zu.
  2. Aspirieren Sie langsam um die keimenden Teliospore zu erfassen. Stoppen Sie, absaugen, sobald die Teliospore die Microcapillary getreten ist. Wiederholen Sie, bis in den Microcapillary gibt es etwa fünf Brandsporen.
  3. Heben Sie die Microcapillary mit dem Mikromanipulator und Sammlung Tröpfchen von RNA Stabilisierung Lösung bringen. Dringen die Tröpfchen und injizieren der Brandsporen in das Droplet.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 8.1, 8.3 bis ca. 1.000 Brandsporen erfasst wurden.

10. Wiederherstellung der Sammlung Droplet

  1. Pipette auf die Sammlung Tröpfchen und überträgt es auf den Deckel einer RNase/DNase-freie 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch. Entfernen Sie vorsichtig das Mineralöl mit einer Pipette ohne zu stören die Sammlung Tröpfchen.
  2. Verwenden Sie die Brandsporen für downstream-Anwendungen wie z. B. RNA-Isolierung.

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Representative Results

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Mit der Clark-Typ Microrespirometer-basierte Methode zur Messung der Veränderungen der Atmung während der Vegetationsruhe Teliospore und Keimung, bestätigt wir, dass schlafende Brandsporen ein niedriges Niveau der Atmung (~ 1.075 µmol/h/mg weisen) im Vergleich zu keimen Brandsporen (~ 2.614 µmol/h/mg; Abbildung 1A). Dies stellt eine ~2.4-fold Änderung im durchschnittlichen Rate von Atmung zwischen schlafenden Brandsporen und Brandsporen, die induziert wurde, um zu keimen. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass Brandsporen, die wurde zum Keimen induziert eine ~ 45 min Verzögerung in Sauerstoffaufnahme (Abbildung 1 b) haben. Dies wird durch die ~ 30 min Verzögerung bei der Sauerstoffaufnahme (Abbildung 1 b) neben der ~ 15 min Verzögerung zwischen der Induktion der Keimung und Beginn der Sauerstoff Messungen angezeigt. Dies kennzeichnet einen Zeitpunkt zunächst Beurteilung molekulare Veränderungen in den keimenden Brandsporen, die nicht sichtbar verändern.

Nachträgliche Änderungen während der Keimung können mikroskopisch beobachtet werden. Fünf Stadien der Keimung wurden ermittelt. Stufe I der Keimung stellt Brandsporen, die verursacht wurde, zu keimen, sondern bleiben von schlafenden Brandsporen nisht zu unterscheidend. Stufe II Brandsporen haben eine aufstrebende promycelium mit einer Länge, die kleiner oder gleich dem Durchmesser der Teliospore ist. Stadium III Brandsporen haben Promycelia, die größer sind als der Durchmesser des Teliospore. Stadium IV der Keimung ist die ersten Knospen von forstwirtschafter aus der Promycelia, und Stufe V sind die daraus resultierenden haploiden forstwirtschafter, die sich durch Knospung teilen (Abbildung 2). Mit Hilfe der Microdissection-Technik, die wir entwickelt haben, haben wir erfolgreich isoliert 500 bis 1.000 keimende Brandsporen für downstream-Anwendungen wie z. B. RNA-Isolation für RT-PCR oder RNA-Seq (Tabelle 1). Abbildung 3 zeigt den allgemeinen Satz von Petri dish für Mikrodissektion und die Schritte für Mikrodissektion mit einem Mikromanipulator.

Figure 1
Abbildung 1: zeitlicher Verlauf der Sauerstoffverbrauch während der Keimung Teliospore. Schlafende Brandsporen Keimen induziert wurden, und Sauerstoff-Niveaus für 6 h mit einem Clark-Typ Microrespirometer kontinuierlich aufgenommen wurden. UN-induzierte schlafende Brandsporen dienten als Kontrolle, und alle Messungen wurden auf einer leeren Probe normalisiert. (A) Daten als durchschnittliche OCR dargestellt. (B) Rohdaten aufgetragen, um die Atmung Kurven, erlaubt die Erkennung von Veränderungen in OCR im Laufe der Zeit zu erhalten. Brandsporen, die wurde zum Keimen induziert verbrauchen Sauerstoff mit einer durchschnittlichen Rate 2.4-fold schneller als UN-induzierte schlafenden Brandsporen (p < 0,01; Der Student t-test). Schwein: Post-Induktion der Keimung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Stadien der Keimung Teliospore. Phasen I bis V der Teliospore Keimung sind illustriert (AE). Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Mikrodissektion zu verschiedene morphologische Stadien der Brandsporen Keimen isolieren. Der allgemeine Aufbau der Petri dish für Mikrodissektion und die Schritte für das Isolieren von Teliospore in Phase III der Keimung werden dargestellt. (A) Abbildung einer Petrischale eingerichtet mit Reihen von Tröpfchen enthalten entweder Sterilwasser, RNA-Stabilisierung-Lösung oder Brandsporen Keimen. Nach Induktion der Keimung wurden in bestimmten Stadien der Keimung mit Mikrodissektion Brandsporen isoliert. (B) eine Keimung Tröpfchen mit induzierten Brandsporen keimen in Stadien I bis III. (C) eine vorbereitete Microcapillary wurde auf eine Phase-III-Teliospore zur Abholung durch Aspiration gebracht. (D) der Stufe III Teliospore in ein Glas Microcapillary ist die Keimung Tröpfchen entnommen und zog nach einer Sammlung Tröpfchen. (E) die Microcapillary in der Sammlung Tröpfchen enthaltende RNA Stabilisierung Lösung eingefügt wurde und die Phase-III-Teliospore wurde in das Tröpfchen eingespritzt. (F) eine Sammlung von Phase III Brandsporen in der RNA-Stabilisierung-Lösung. Maßstabsleiste = 20 µm (A-D, F) und 50 µm (E). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Keimung Anzahl der keimenden Brandsporen isoliert
Stufe I 1.000
Stufe II 500
Stadium III 650

Tabelle 1: Anzahl der keimenden Brandsporen erfolgreich isoliert für jede Phase der Keimung in einem standard Isolierung Experiment. Die Tabelle zeigt die durchschnittliche Zahl von Brandsporen, die mithilfe von Mikrodissektion für Stadien isoliert gewesen I bis III vor der Abholung für downstream-Anwendungen.

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Discussion

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Basidiomycete biotrophe Pflanzenpathogene verursachen jährlich Milliarden von Dollar in Ernteausfälle. Die überwiegende Mehrheit dieser Erreger produzieren Brandsporen, die integraler Bestandteil der Pilz Zerstreuung und geschlechtliche Fortpflanzung. Bei der Entwicklung und Keimung der Brandsporen zu gewinnen ist entscheidend für das Verständnis der Ausbreitung der verheerenden Krankheiten verursacht durch diese Pilze. Um molekulare Veränderungen an wichtigen Kontrollpunkten zu ermitteln haben wir eine Methode, um das Timing der physiologischen Veränderungen und anderen Brandsporen in unterschiedlichen Stadien der Keimung isolieren identifizieren entwickelt. Seto Et al. (unveröffentlichte) notierte fünf Phasen der Teliospore Keimung durch Lichtmikroskopie (Abbildung 2). Zur Untersuchung der physiologischen Aktivierung während Phase I und Atemfrequenz während der Keimung zu bewerten, wir ein Clark-Typ Microrespirometer genau Sauerstoffverbrauch gemessen. Unser Sample-Daten zeigen, dass unsere Methode präzise und hoch reproduzierbare ist. Unsere Ergebnisse bestätigen, dass Brandsporen Keimen U. Maydis eine drastische Zunahme der Zellatmung im Vergleich zu un-induzierte schlafenden Brandsporen aufweisen. Zum ersten Mal haben wir festgestellt, dass U. Maydis Brandsporen, die wurde zum Keimen induziert eine ~ 45 min Verzögerung bei der Sauerstoffaufnahme aufweisen. Dies deutet darauf hin, dass U. Maydis Brandsporen einige Zeit zur Keimung Signale verarbeiten erfordern (z. B.., die Anwesenheit von Zucker) vor der Reaktion, dass erhöhte Sauerstoffaufnahme gehört nicht ganz unmittelbaren Reaktionen auf Keimung Signale oder dass unsere Assay nicht empfindlich genug, um die minimale Änderung in anfängliche Sauerstoffaufnahme zu erkennen war.

Frühere Studien, die Atmung Raten von Schmutz Brandsporen3 auf einem Warburg Kolben Apparat zur Messung von Sauerstoff verlassen Ebenen manometrically5. Diese Methode misst kurz, Sauerstoff-Verbrauch und CO2 -Produktion durch Erkennen von Änderungen im Druck in einem geschlossenen Kolben durch die direkte Beobachtung von Fluid Pegeländerungen im Studienarm mit Manometer. Die Experimente können schwierig sein, einrichten, und Messungen können ungenau sein. Das Gerät muss während der gesamten Messung besucht werden und umfangreiche Berechnungen erforderlich, um OCR zu schätzen. Unser Protokoll macht des technischen Fortschritts, beseitigt das Erfordernis für den Benutzer durch den Apparat für die Dauer des Experiments zu bleiben, nehmen Sie Messungen von Auge und umfangreiche mathematische Formeln zu verwenden. Andere frühe Clark-Typ Respirometers nach Maß OCR von Neurospora Crassa9 und Botryodpilodia Theobromae10 Sporen verwendet haben, jedoch diesen frühen Instrumenten erlaubt Dauermessungen für maximal 20 Minuten. Diese Einschränkung hätte nicht die Identifizierung der ~ 45 min Verspätung in Sauerstoffaufnahme erlaubt, die wir mit dem neueren Modell Respirometer beobachtet. Unser Protokoll hat vereinfacht Interpretation der Daten, wie das Auslesen der Konzentration von Sauerstoff noch in die Kammer, die direkt ohne Manipulationen Berechnungen oder Daten grafisch dargestellt werden kann. Darüber hinaus ist es möglich, kontinuierliche Messungen (alle 2 s) für unbestimmte Zeit bis verfügbaren Sauerstoff vollständig aufgebraucht ist. Dies ermöglicht die Identifizierung von kleinen Veränderungen in der Atmung über einen langen Zeitraum hinweg. Wir haben daher auf frühere Techniken verbessert und entwickelte eine einfache, präzise und reproduzierbare Methode zur Messung der Sauerstoffverbrauch von Pilzsporen. Nach unserer Kenntnis ist dies die erste Studie, die eine moderne Clark-Typ Respirometer verwenden, um Atmung ruhender gegenüber Keimen Brandsporen der Brandpilze zu studieren.

Trotz der Leichtigkeit und Einfachheit dieses Protokolls Optimierung ist erforderlich und es gibt biologischen Realitäten, die die Analyse beschränkt. Erste, geeignete Stichprobengrößen müssen angemeldet sein, um angemessene OCR zu erreichen. Zuviel Probe kann zu vorzeitigen Absturz von Sauerstoff-Niveaus führen, und zu wenig Probe kann dazu führen, dass die Unfähigkeit, sinnvolle Veränderungen in Sauerstoff-Verbrauch zu beobachten. Zweitens ist es unerlässlich, damit die Sonde (~ 3 min) zu stabilisieren, um genaue Ausgangsdaten zur Verfügung stellen kann. Schließlich ist es wichtig, Keimung Medium mit antibakteriellen Mitteln zu ergänzen (z.B.., Streptomycin Sulfat) um bakterielle Kontamination ändert nichts an OCR Lesungen zu gewährleisten. Die biologischen Einschränkungen, mit denen, die wir konfrontiert, waren eine niedrige Keimrate über den zeitlichen Verlauf der Messung, (~ 1 %) ermittelt anhand visuelle morphologische Veränderungen. Bestimmung der Spore Lebensfähigkeit ließ diese tariffindung pro Spore Zahl konvertiert werden und isolieren Brandsporen mit höheren Raten der Keimung führe zu höheren OCR. Die asynchrone Keimung U. Maydis Brandsporen11 ist eine Realität, die berücksichtigt werden muss und kann haben dazu beigetragen, eine Unfähigkeit, Sauerstoffverbrauch früher in Keimen zu erkennen.

Um die Genauigkeit und Präzision der Messung Änderungen in der Teliospore Atmung zu verbessern, könnte zukünftige Anpassungen an diese Methode gehören OCR auf eine einzelne Zelle-Basis zu messen. Mikromanipulation Techniken könnte verwendet werden, um ein einzelnes Teliospore, isolieren, dann induziert werden kann, um zu keimen und die Atemfrequenz überwacht werden können. Dies könnte Auflösung, Informationen über die OCR während der Vegetationsruhe-Keimung Schicht pro Teliospore und nicht pro mg Brandsporen verbessern. Außerdem würde dies die verwirrende Frage der asynchronen Keimung lösen.

Für die späteren Stadien der Keimung entwickelten wir eine Mikromanipulation Methode um Brandsporen in gemeinsamen Stadien der Keimung zu isolieren. Dies erlaubt die Erstellung von relativ synchron Teliospore Bevölkerung für die Analyse. Verschiedene Methoden zur Isolierung von einzelnen Mikroorganismen wurden beschrieben und haben über die Jahre12verbessert worden. Diese Methoden umfassen die Verdünnung von Spore Suspensionen zu einzelnen Mikroorganismen, Semi-mechanische Methoden mit dem Einsatz von mikrokapillaren, Sporen zu erhalten, die Mittel für die Kultivierung und mechanische Methoden übergeben werden, die Mikromanipulatoren verwenden . Vorherigen Methoden, mit denen wir Brandsporen auf der gleichen Stufe der Keimung zu erhalten sind Gegenstrom zentrifugale Sammelnetzwerk und Filterung keimende Brandsporen durch eine Nylon-Membran mit einer bestimmten Porengröße. Mit diesen Methoden erlaubt uns um zu bereichern für Brandsporen Keimen enthielten jedoch unsere Proben noch Brandsporen in verschiedenen Stadien der Keimung13. Aktuelle Technik für Mikromanipulation der einzelnen Mikroorganismen hat mit der Einführung der höheren Vergrößerung und Instrumente für die Feinsteuerung der Kapillare Nadeln, Aspiration und Übertragung von Mikroorganismen verbessert. Vorherigen Mikromanipulation Techniken konzentrierten sich auf Einzelzellen für das züchten oder für den Einsatz in einzelne Zelle PCR Anwendungen14zu isolieren. Die Verwendung von Mikromanipulatoren, einzelne Pilzsporen zu isolieren hat bisher nicht etabliert. Eine vorherige Methode zur Isolierung von einzelnen Pilzsporen beteiligt die Verwendung von feinen Pinzette oder Nadeln, kleine Stücke von soliden keimenden Sporen15-haltigem Medium auszuwählen. Mikromanipulation mit dem Einsatz von Mikromanipulatoren ist in Hefe Studien verbreitet dem Cluster aus Ascosporen getrennt folgende Sporenbildung in Kultur auf Agar-Medium für die meiotische Genanalyse16sein können. Wir entwickelten eine Methode, die die Mikromanipulation Technik für Bakterienzellen14 verbindet und in-vitro- Befruchtung Methoden zur Isolierung von keimenden Brandsporen. Wir haben gezeigt, dass Hunderte von gemeinsamen Keimen Bühne Brandsporen mit dieser Technik erzielt werden können. Diese Proben eignen sich für nachgeschaltete Ausdruck Studien mit Techniken wie RT-qPCR oder RNA-FF Erlangung einer Bevölkerung von Brandsporen in denen Keimung synchronisiert ist erlaubt die Analyse der spezifischen Veränderungen in der Genexpression, die auftritt, während Anfang, Mitte und späteren Phasen der Teliospore Keimen.

Mikrodissektion Phase spezifische Brandsporen Keimen erfordern Erfahrung im Satz und in Anbetracht der verschiedenen Stadien der Keimung, aber diese Erfahrung erzielt werden schnell durch die Praxis. Es gibt mehrere Schritte, die für erfolgreiche Mikrodissektion gefolgt von RNA Isolierung befolgt werden müssen. Erstens muss Keimung Medium mit Antibiotika ergänzt werden (zB., Streptomycin Sulfat) unterdrücken das Wachstum der bakteriellen Kontamination bei der Keimung eingeleitet wird sowie bei der Entnahme der Brandsporen Keimen. Zweitens ist es wichtig, eine Stabilisierung Lösung zu stabilisieren und schützen RNA isoliert zu verwenden. Die RNA-Stabilisierung-Lösung verhindert zudem, dass gesammelte Brandsporen voran in die nächste Phase der Keimung, während das Sammeln zusätzlicher Brandsporen. Drittens ist es wichtig, das Mineralöl zu entfernen, sobald die Sammlung Tröpfchen wiederhergestellt wurde, um erfolgreiche RNA-Extraktion zu gewährleisten. Zu guter Letzt haben wir einige Qualitätsverlust RNA bemerkt, wenn isolierte Brandsporen in RNA Stabilisierung Lösung für längere Zeit gelagert werden; Daher empfiehlt es sich, dass RNA isoliert ist unmittelbar nach der Sammlung von Keimung Phase spezifische Brandsporen. Eine Einschränkung der Methode ist, dass die Bühne ich Brandsporen gesammelt enthielten, schlafend, tot und induzierte Brandsporen Keimen, wie diese drei Stadien morphologisch nicht zu unterscheiden sind. Darüber hinaus konnte beim Stadium III Brandsporen zu sammeln, eine Mischung aus Brandsporen in Meiose I oder Meiose II abgerufen werden. Ein Weg, um Hilfe bei der Unterscheidung zwischen wirklich schlafende und Tote Brandsporen könnte sein, die Lebensfähigkeit der Probe zu bestimmen. Eine Methode zur Bewertung von Pilz Sporen überleben mit lebenden/Toten Zelle Lebensfähigkeit Assays kann möglicherweise Prozentsatz der lebensfähigen Brandsporen bewerten, informativer Keimrate bestimmt17sein könnte. Darüber hinaus Kern Färbung mit DAPI, zum Beispiel ließe sich die Ereignisse der Meiose zu visualisieren, die während der Phase III und den Übergang zur Stufe IV auftreten werden, um weitere Brandsporen morphologisch im Stadium III charakterisieren. Dies würde in der Sammlung der Brandsporen in nur einer Phase der Keimung unterstützen, wenn Sie unsere Mikrodissektion-Methode verwenden.

Zusammenfassend haben wir entwickelt, eine einfache, präzise und reproduzierbare Methode zur Messung der Veränderungen in der Zellatmung, die während der Vegetationsruhe-Keimung Schicht von Ustilago Maydis Brandsporen auftreten. Darüber hinaus entwickelten wir eine Methode zum Sammeln von bestimmten Phasen des keimenden Brandsporen, die für downstream-Anwendungen, wie z. B. RNA-FF verwendet werden könnten Unsere Methoden können verschiedene Arten von Zellen und Arten beherbergen angepasst. Wir gehen davon aus, dass Verbesserungen an unseren Techniken erleichtert die Erkennung von respiratorischen Veränderungen auf eine einzige Spore sowie weitere definieren die Ereignisse, die in den späteren Stadien der Keimung auftreten.

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Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt finanzielle oder sonstige Interessenkonflikte offen zu legen.

Acknowledgments

Wir möchten danken Dr. Paul Frost für den Gebrauch von seinem Microrespirometer und Nicole Wagner und Alex Bell für technische Hilfe. Diese Arbeit wurde finanziert durch einen NSERC Grant, b.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptomycin Sulfate BioShop STP101
Kanamycin Sulfate BioShop KAN201
Potato Dextrose Broth BD Difco 254920
1 L Waring Laboratory blender Waring 7011S
Cheesecloth VWR 470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock ThermoFisher Scientific 5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2) Unisense OX10
MicroOptode Meter Amplifier Unisense N/A
MR-Ch Small Unisense MR-Ch
SensorTrace Rate Software Unisense N/A
MicroRespiration Rack Unisense MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer Unisense MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope Zeiss
Coarse Manipulator Narishige MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator Narishige MMO-202ND
Pneumatic Microinjector Narishige IM-11-2
TransferTip (ES) Eppendorf 5175107004

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References

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Untersuchung von Teliospore Keimen mit Microrespiration Analyse und Mikrodissektion
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Ostrowski, L. A., Seto, A. M., Saville, B. Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection. J. Vis. Exp. (135), e57628, doi:10.3791/57628 (2018).More

Ostrowski, L. A., Seto, A. M., Saville, B. Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection. J. Vis. Exp. (135), e57628, doi:10.3791/57628 (2018).

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