Summary
Smut funghi causano molte malattie devastanti agricoli. Sono dispersi come teliospores dormienti che germinano in risposta a stimoli ambientali. Descriviamo due metodi per studiare i cambiamenti molecolari durante la germinazione: aumento di respirazione per rilevare l'attivazione metabolica di misurazione e valutazione cambiando eventi molecolari isolando teliospores alle fasi morfologiche distinte.
Abstract
Smut funghi sono gli agenti eziologici di parecchie malattie devastanti agricoli. Sono caratterizzati dalla produzione di teliospores, che sono agenti di dispersione dalle pareti spesse. Teliospores possono rimanere latenti per decenni. La dormienza è caratterizzata da tassi metabolici bassi, in pausa biosintesi macromolecolari e notevolmente ha ridotto i livelli di respirazione. Alla ricezione di segnali ambientali richiesti, teliospores germinare per produrre cellule aploidi, che possono avviare nuovi cicli di infezione. Germinazione di teliospore è caratterizzata dalla ripresa delle biosintesi macromolecolari, respiratorio aumentato e drammatici cambiamenti morfologici. Al fine di misurare con precisione i cambiamenti nella respirazione cellulare durante le prime fasi di germinazione, abbiamo sviluppato un semplice protocollo che impiegano un respirometro Clark-tipo. Le successive fasi di germinazione si distinguono per specifici cambiamenti morfologici, ma la germinazione è asincrona. Abbiamo sviluppato una tecnica di microdissezione che permetta di raccogliere teliospores in fasi distinte di germinazione.
Introduction
I funghi di fuliggine (Ustilaginales) consistono di oltre 1.600 specie che infettano erbe tra cui l'importante cereali di mais, orzo e grano, causando miliardi di dollari in perdite di raccolto ogni anno1. Questi funghi sono caratterizzati dalla produzione di teliospores, che hanno la pelle scura delle pareti cellulari e sono gli agenti di dispersione. Teliospores funzione per proteggere il materiale genetico durante le sollecitazioni di dispersione tra piante ospiti e può persistere in uno stato dormiente per anni2. Come tale, teliospores sono una componente essenziale della diffusione della malattia.
Al fine di studiare biologia teliospore, il nostro laboratorio utilizza il fungo di oscenità modello Ustilago maydis (U. maydis), che è l'agente causale della malattia 'comune oscenità di mais'. Maturo U. maydis teliospores sono caratterizzati da arresto della crescita, il metabolismo cellulare ridotto e bassi livelli di respirazione cellulare3. In condizioni ambientali favorevoli (ad es., la presenza di specifici zuccheri), U. maydis teliospores germinano e completare le basidiospore di meiosi, producendo che possono avviare nuovi cicli di infezione. Germinazione è caratterizzata da respiratorio aumentato, il ritorno ad metabolico attività e la progressione attraverso stadi morfologici osservabile di germinazione4.
La fase iniziale di germinazione include respiratorio aumentato e funzione metabolica, tuttavia, non esistono indicazioni morfologiche del cambiamento. Le misure originali del cambiamento respiratorio in U. maydis sono state effettuate da oltre 50 anni fa, misurare il consumo di ossigeno manometrico con un apparato di boccetta Warburg5. Abbiamo sviluppato un metodo nuovo e semplice di studio precisi cambiamenti nella respirazione durante la germinazione teliospore misurando il consumo di ossigeno sopra un corso di tempo di germinazione utilizzando un microrespirometer Clark-tipo. Abbiamo precedentemente utilizzato questo metodo per studiare i cambiamenti nella frequenza respiratoria tra selvaggio-tipo cellule aploidi U. maydis e mutanti con i mitocondri difettosi6ed hanno adattato il protocollo qui per studiare i cambiamenti nella respirazione teliospore durante germinazione. Questo consente di identificare con precisione i tempi del cambiamento di respirazione in modo che noi possiamo target teliospores al momento opportuno dopo l'inizio della germinazione di indagare gli eventi molecolari iniziali. La progressione di germinazione può essere seguita microscopicamente una volta emerge il promycelia dalla teliospore, ma la natura asincrona ha inibito l'isolamento di abbastanza teliospores in una fase determinata per le indagini. Abbiamo sviluppato una tecnica di microdissezione simile a quelli utilizzati per la fecondazione in vitro per raccogliere fisicamente teliospores presso morfologiche distinte fasi di germinazione.
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Protocol
1. corn Cob infezione
- Zea mays (c.v. Golden Bantam) di crescere fino a quando le pannocchie sono formate e hanno iniziato a seta (circa 60 giorni).
- Cultura compatibile aploide U. maydis ceppi utilizzando protocolli standard come precedentemente descritto7.
- Infettare le pannocchie di mais utilizzando protocolli standard come descritto in precedenza7.
2. teliospore raccolta
- Impianti di autoclave (Büchner imbuti, boccette di Büchner, frullatori, bottiglie da 250 mL centrifuga, spatole piatte e acqua) utilizzando uno standard secco ciclo con almeno 30 min sterilizzazione a 121 ° C (ciclo standard di liquido per l'acqua).
- Rimuovere infetti pannocchie da piante (circa 28 – 35 giorni post infezione) utilizzando un rasoio e pannocchie su un vassoio coperto di protettore di panca.
- Rimuovere i tumori da pannocchie con una lama di rasoio e raccogliere in un becher.
- Riempire una tazza da 250ml laboratorio frullatore con tumori fino a circa 1/3 pieno e aggiungere autoclavato dH2O fino a quando la Coppa del frullatore è circa 3/4 pieno. Interferire con i tumori di pulsare il frullatore a bassa, fino a quando non omogeneizzato.
- Collegare la pompa del vuoto in una trappola d'acqua e poi in una boccetta di Büchner 1L.
- Inserire il grande filtro Büchner nel pallone e il fondo dell'imbuto Büchner con quattro strati di garza.
- Accendere la pompa del vuoto.
- Versare una parte dei tumori omogeneizzati attraverso la garza e raschiare con una spatola.
- Versare alcuni dH2O la garza per lavare il teliospores attraverso.
- Ripetere fino a quando il dH2O venendo attraverso la Garza è chiaro.
- Strizzare la garza contenente il materiale omogeneizzato tumore nel filtro per garantire massima teliospore recupero.
- Quando la beuta Büchner 1L è sempre vicino a pieno, svuotarlo in una beuta e grande e metterlo da parte.
- Mettere un nuovo pezzo di garza nel filtro e ripetere i passaggi (2.7-2.12) fino a quando tutti i tumori sono stati interrotti e filtrati.
- Versare il filtrato teliospores in bottiglie di centrifuga in autoclave da 250 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min e decantare il supernatante.
- Ripetere il passaggio 2.14 fino a quando tutti i teliospores filtrati sono pellettati mediante centrifugazione.
- Sospendere il pellet in una piccola quantità di acqua e trasferimento a provette centrifuga da 50 mL.
- Centrifugare le provette a 1.000 x g per 5 min e decantare il supernatante.
- Sospendere il pellet in circa 50 mL di dH2O, centrifugare le provette a 1.000 x g per 5 min e decantare il supernatante. Raschiare delicatamente lo strato superiore grigio con una spatola e smaltirla. Ripetere fino a quando non c'è più uno strato grigio sulla parte superiore.
- Secca dei campioni durante la notte in un essiccatore sotto vuoto.
- Conservare secchi teliospores a 4 ° C fino all'utilizzo.
-
Se lo si desidera, è possibile trattare il teliospores con solfato di rame8 prima di indurre a germinare. Se non trattata, quindi eseguire approfondita analisi microscopica di teliospores per confermare il campione rappresenta teliospores puro ed è privo di contaminazioni batteriche o altri.
- Pesare circa 50 mg di teliospores in una microcentrifuga da 1,5 mL.
- Aggiungere 1,0 mL circa di 0,75% CuSO4 nella provetta di microcentrifuga da 1,5 mL contenente il teliospores. Pipettare su e giù per sospendere il teliospores della soluzione di CuSO4 seguita da agitare il campione per 3 h.
- Centrifugare il campione a 2.500 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet di teliospore con acqua sterile, ripetere la centrifugazione e rimuovere il surnatante.
- Ripetere il passaggio 2.21.3 altre due volte.
3. teliospore vitalità e Test di germinazione
- Pesare circa 10 mg di U. maydis teliospores in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per valutare la solidità finanziaria e i tempi di germinazione.
- In una cappa di biosicurezza, preparare il brodo patata destrosio (PDB, 24 g/L) completato con solfato di streptomicina (160 µ g/mL).
- Sospendere il teliospores in 500 µ l di PDB. Pipettare delicatamente per mescolare e rompere tutti i ciuffi di teliospores.
- Trasferire la sospensione di teliospore a un autoclavato 250 mL flacone erlenmeyer contenente 10 mL del PDB.
- Incubare la beuta a 28 ° C in agitazione a 90 rpm per 12 – 16 h.
- In una cappa di biosicurezza, rimuovere un campione di 20 µ l di teliospores indotto a germinare e preparare un vetrino da microscopio.
-
Utilizzando un microscopio, valutare visivamente fasi di germinazione che sono presenti e la presenza di contaminazione batterica.
- Contare il numero di teliospores presso stadi da I attraverso V utilizzando un emocitometro e determinare la percentuale che hanno germinato.
- Se solo fase I teliospores sono presenti, continuare a incubare la beuta per un totale di 24 h prima di valutare la germinazione teliospore. Continuare l'incubazione per un massimo di 48 h prima ritenendo il campione non vitali.
- Se la contaminazione batterica è presente, completare il PDB con solfato di kanamicina (50 µ g/mL) e solfato di streptomicina (160 µ g/mL) e quindi ripetere i passaggi da 3.1 a 3.7. Se persiste la contaminazione batterica, trattare teliospores con solfato di rame e ripetere i passaggi da 3.1 a 3.7.
4. induzione di germinazione per il monitoraggio della respirazione
- Pesano uguale quantità (ad es., 50 mg) di teliospores per ogni esperimento di respirazione.
- In una cappa di biosicurezza, aggiungere teliospores in un'aula di respirazione in autoclave.
- Pimento della camera con PDB (24 g/L) completati con streptomicina solfato (160 µ g/mL) e kanamicina solfato (50 µ g/mL).
- Pipettare su e giù per creare una sospensione di teliospore.
- Porre il coperchio della camera nella camera per creare aria tenuta stagna.
5. ottenere misure di tasso (OCR) del consumo di ossigeno
- Posizionare la camera nel rack alloggiamento all'interno di un bagno di acqua (preriscaldato a 28 ° C).
- Posizionare la sonda2 O all'interno dell'apertura della camera.
- Monitorare i punti dati che appaiono in tempo reale sul programma "Tasso di SensorTrace" e lasciare che la sonda stabilizzare (~ 3 min dopo che la sonda va posizionata nella camera).
- Fare clic su "Misura" per misurare i livelli di2 O continuamente per 6 h con misurazioni registrate a intervalli di 2 s.
- Interrompere la misurazione e ripetere i passaggi 4.1 – 5,4 per ciascun campione da analizzare.
- Esportare i dati in Microsoft Excel facendo clic su "File | Esportare | Salvare come. xls".
6. analisi dei dati
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Calcolare OCR
- Nel file di Excel esportato sotto la scheda "Within_Rates", è necessario registrare il "tasso" per ogni misura di camera (nmol/h).
- Per ogni campione sperimentale, sottrarre il "tasso" della camera del vuoto dal "Prezzo" della camera del campione sperimentale per ottenere un corretto valore di OCR e prendere il valore assoluto di questo numero.
- Calcolare il totale OCR per mg di teliospores dividendo il valore corretto di OCR assoluto per il cellulare di massa utilizzato.
- Media di replicare i valori "OCR per mg di teliospores" per ogni ceppo.
- Analizzare i dati utilizzando il metodo statistico appropriato (ad es., di student t-test, analisi della varianza) utilizzando Microsoft Excel altri software statistici.
- Per rappresentare graficamente i dati grezzi, calcolare la percentuale di ossigeno rimanente per ogni punto di tempo che si desidera grafico. Dividere la prima lettura di per sé e moltiplicare per 100 (100% ossigeno restante), poi dividere ogni successiva lettura dalla prima lettura e moltiplicare per 100 per ottenere la percentuale di ossigeno residuo nella camera.
7. induzione di Teliospore germinazione per isolare Teliospores alle distinte fasi di germinazione
- Preparare file PDB (24 g/L) completati con solfato di streptomicina (160 µ g/mL) in una cappa di biosicurezza.
- Posto a circa 10 mg di U. maydis teliospores in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
- Sospendere il teliospores in 500 µ l di PDB. Delicatamente la pipetta a mescolare fino a quando non ci sono nessun ciuffi di teliospores nel mezzo.
- Trasferire la sospensione di teliospore un matraccio di Erlenmeyer autoclavato 250 mL contenente PDB completati con solfato di streptomicina.
- Incubare la beuta durante la notte a 28 ° C in agitazione a 90 giri/min.
8. preparazione della capsula di Petri e micromanipolatore
-
Preparare un piatto di Petri (57 cm2) di pipettaggio righe di goccioline per microcapillary preparazione e raccolta del campione.
- Pipettare 5 µ l (x 4) dH2O gocce nella parte superiore della capsula di Petri.
- Pipettare 2 µ l (x3) di soluzione di stabilizzazione di RNA su di Petri da utilizzare per la raccolta del campione.
- Pipettare 5 µ l (X30) gocce di germinazione teliospores sul piatto Petri.
- Aggiungere 15 mL di olio minerale per la capsula di Petri. Garantire che tutte le goccioline sono coperti di olio prima di procedere.
- Preparare un microcapillary con un diametro interno di 15 µm, 1 mm flangia, lunghezza 55 mm e un angolo di 20° Suggerimento inserendola nel supporto microcapillary e immergendo nell'olio minerale dove azione capillare permetterà l'olio minerale entrare il microcapillary. Rilasciare la pressione nel microcapillary prima di portarla alla gocciolina di acqua. Aspirato per preparare il microcapillary con acqua.
9. isolamento di Teliospores fase-specifici di germinazione
- Utilizzando i controlli del micromanipolatore, spostare il preparato microcapillary ad uno delle goccioline di germinazione. Penetrare la gocciolina, abbassare il microcapillary e portare alla bocca di microcapillary fino a una germinazione teliospore nella fase di germinazione di interesse.
- Aspirare lentamente per catturare la germinazione teliospore. Smettere di aspirare una volta il teliospore entrato il microcapillary. Ripetere fino a quando ci sono circa cinque teliospores nella microcapillary.
- Alza il microcapillary con il micromanipolatore e portarlo per la goccia di raccolta della soluzione di stabilizzazione di RNA. Penetrare la goccia e iniettare il teliospores la goccia.
- Ripetere i passaggi da 8.1 a 8.3 teliospores circa 1.000 sono stati catturati.
10. il recupero della collezione goccia
- Pipettare fino la goccia di collezione e trasferirlo al coperchio di un tubo del microcentrifuge di 2,0 mL privo di RNAsi e dnasi. Rimuovere con cura l'olio minerale con una pipetta senza disturbare la goccia di raccolta.
- Utilizzare il teliospores per applicazioni a valle come isolamento del RNA.
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Representative Results
Usando il metodo di base di microrespirometer di Clark-tipo misurare i cambiamenti nella respirazione durante teliospore dormienza e germinazione, abbiamo confermato che dormiente teliospores presentano un basso livello di respirazione (~ 1.075 µmol/h/mg) rispetto alla germinazione teliospores (~ 2.614 µmol/h/mg; Figura 1A). Questo rappresenta un cambiamento di ~2.4-fold in media tasso di respirazione tra teliospores dormienti e teliospores che sono stati spinti a germinare. Inoltre, abbiamo identificato che teliospores che sono stati spinti a germinare hanno un ritardo di ~ 45 min nel consumo di ossigeno (Figura 1B). Questo è indicato dai ~ 30 min di ritardo nell'assorbimento di ossigeno (Figura 1B) oltre al ritardo di ~ 15 min tra l'induzione di germinazione e inizio delle misurazioni di ossigeno. Questo identifica un punto di tempo per iniziare a valutare i cambiamenti molecolari nella germinazione teliospores che visibilmente non stanno cambiando.
Successivi cambiamenti durante la germinazione possono essere osservati microscopicamente. Cinque fasi di germinazione sono state determinate. Stadio di germinazione rappresenta teliospores che sono stati spinti a germinare, ma rimangono indistinguibile da teliospores dormienti. Teliospores di fase II hanno un promycelium con una lunghezza che è minore o uguale al diametro della teliospore emergenti. Teliospores di fase III hanno promycelia che sono maggiore del diametro di teliospore. Stadio IV di germinazione è il germe di basidiospore dalla promycelia, e V fase sono la risultante basidiospore aploidi che dividono per gemmazione (Figura 2). Utilizzando la tecnica di microdissezione che abbiamo sviluppato, abbiamo isolato con successo 500 a 1.000 teliospores germinare per applicazioni a valle come l'isolamento di RNA per RT-PCR o RNA-Seq (tabella 1). Figura 3 presenta l'insieme generale di Petri dish per microdissection e i passaggi per la microdissezione utilizzando un micromanipolatore.
Figura 1: corso di tempo del consumo di ossigeno durante la germinazione teliospore. Teliospores dormienti sono stati indotti a germinare, e livelli di ossigeno sono stati registrati continuamente per 6 h utilizzando un microrespirometer Clark-tipo. ONU-indotto teliospores dormienti sono stati usati come controllo, e tutte le misurazioni sono state normalizzate per un campione in bianco. (A) dati rappresentati come media OCR. (B) dati grezzi complottò per ottenere curve di respirazione, permettendo la rilevazione dei cambiamenti in OCR durante il corso di tempo. Teliospores che sono stati spinti a germinare consumano ossigeno ad un tasso medio 2,4 più veloce di ONU-indotto teliospores dormiente (p < 0.01; Di Student t-test). MAIALE: post-induzione della germinazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: fasi di germinazione teliospore. Fasi di I a V della germinazione teliospore sono illustrate (A–E). Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Microdissection per isolare morfologiche distinte fasi di germinazione teliospores. L'allestimento generale di un Petri dish per microdissection e le misure per isolare teliospore allo stadio III di germinazione sono illustrati. (A) illustrazione di una capsula di Petri è impostato con righe di goccioline contenenti o acqua sterile, soluzione di stabilizzazione del RNA, o teliospores di germinazione. A seguito di induzione di germinazione, teliospores sono stati isolati in specifiche fasi di germinazione utilizzando microdissection. (B) una gocciolina di germinazione che contiene ha indotto per germinare teliospores nelle fasi I a III. (C) un preparato microcapillary è stata portata a un teliospore di fase III per raccolta tramite aspirazione. (D) teliospore The Stage III in un microcapillary di vetro viene rimosso dal droplet germinazione e spostato in una gocciolina di raccolta. (E) la microcapillary è stata inserita la soluzione di stabilizzazione collezione goccia contenente RNA e la teliospore di fase III è stato iniettato nella goccia. (F) una raccolta di teliospores di fase III nella soluzione di stabilizzazione di RNA. Barra della scala = 20 µm (A-D, F) e 50 µm (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Fase di germinazione | Numero di germinazione teliospores isolato |
| Fase I | 1.000 |
| Fase II | 500 |
| Stadio III | 650 |
Tabella 1: numero di teliospores germinazione con successo isolato per ogni fase di germinazione in un esperimento di isolamento standard. La tabella illustra i numeri medii di teliospores che sono stati isolati mediante microdissezione per fasi che attraverso III prima collezione per applicazioni a valle.
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Discussion
Fitopatogeni basidiomicete biotrophic causano ogni anno miliardi di dollari in perdite di raccolto. La stragrande maggioranza di questi patogeni produce teliospores che sono parte integrante della dispersione fungine e riproduzione sessuale. Acquisire conoscenze dello sviluppo e germinazione di teliospores è fondamentale per comprendere la diffusione delle malattie devastanti causati da questi funghi. Al fine di identificare alterazioni molecolari nei punti chiave di controllo abbiamo messo a punto un metodo per identificare i tempi di cambiamenti fisiologici e un altro per isolare teliospores alle distinte fasi di germinazione. Seto et al. (inediti) noti cinque fasi di germinazione teliospore da microscopia chiara (Figura 2). Al fine di indagare l'attivazione fisiologica durante la fase I e per valutare il tasso di respirazione durante la germinazione, abbiamo usato un microrespirometer Clark-tipo per misurare con precisione i cambiamenti nel consumo di ossigeno. I nostri dati campione indicano che il nostro metodo è preciso e altamente riproducibili. I nostri risultati confermano che germinazione U. maydis teliospores esibiscono un aumento drastico nella respirazione cellulare rispetto a ONU-indotto teliospores dormienti. Per la prima volta, abbiamo identificato che U. maydis teliospores che sono stati spinti a germinare esibiscono un ~ 45 min di ritardo nell'assorbimento di ossigeno. Ciò suggerisce che U. maydis teliospores può richiedere tempo per elaborare i segnali di germinazione (ad es., la presenza di zuccheri) prima di rispondere, che l'assorbimento di ossigeno aumentata non è fra le risposte molto immediate ai segnali di germinazione o che la nostra analisi non era abbastanza sensibile per rilevare il minimo cambiamento nell'assorbimento iniziale di ossigeno.
Precedenti studi hanno esaminato i tassi di respirazione di teliospores smut3 invocata da un apparato di boccetta di Warburg per misurare l'ossigeno livelli manometrico5. Brevemente, questo metodo misura il consumo di ossigeno e la produzione di CO2 di rilevamento delle modifiche in una boccetta chiusa attraverso l'osservazione diretta delle variazioni dei livelli fluidi nel braccio manometro della pressione. Gli esperimenti possono essere difficili da impostare, e le misure possono essere imprecisione. L'apparato deve essere assistito durante tutto il periodo di misura e calcoli necessari per stimare OCR. Il nostro protocollo si avvale dei progressi tecnologici, eliminando l'obbligo per l'utente a rimanere dall'apparato per tutta la durata dell'esperimento, prendere le misure ad occhio e utilizzare formule matematiche vaste. Altri hanno usato precoce respirometers Clark-tipo su misura OCR di Neurospora crassa9 e Botryodpilodia della botriodiplodia10 spore, tuttavia, questi primi strumenti consentiti misurazioni in continuo per un massimo di 20 min. Questa limitazione non avrebbe consentito l'identificazione del ~ 45 min ritardo nell'assorbimento di ossigeno che abbiamo osservato con il respirometro di modello più recente. Il nostro protocollo ha fatto interpretazione dei dati più semplici, come la lettura è la concentrazione di ossigeno residuo nella camera, che può essere direttamente rappresentati graficamente senza alcuna manipolazione dati o calcoli. Inoltre, è possibile prendere misurazioni continue (ogni 2 s) per un periodo indefinito di tempo fino a quando l'ossigeno disponibile è completamente esaurita. Questo consente l'identificazione di piccoli cambiamenti nella respirazione per un lungo periodo di tempo. Di conseguenza, abbiamo migliorato le tecniche precedenti e sviluppato un metodo semplice, preciso e riproducibile per misurare il consumo di ossigeno delle spore fungine. A nostra conoscenza, questo è il primo studio di utilizzare un respirometro Clark-tipo moderno per studiare la respirazione di dormienti contro teliospores di funghi oscenità di germinazione.
Nonostante la facilità e la semplicità del presente protocollo, ottimizzazione è necessario e ci sono realtà biologica che limitato l'analisi. Dimensioni del campione in primo luogo, appropriati devono essere identificati per raggiungere OCRs ragionevole. Troppo campione può portare a danneggiamento prematuro dei livelli di ossigeno, e troppo poco campione può comportare l'impossibilità di osservare i cambiamenti significativi nel consumo di ossigeno. In secondo luogo, è indispensabile per permettere alla sonda di stabilizzare (~ 3 min) per fornire dati accurati iniziali. Infine, è importante integrare medio di germinazione con agenti antibatterici (ad es., solfato di streptomicina) al fine di garantire la contaminazione batterica non altera letture OCR. Le limitazioni biologiche che abbiamo affrontato erano un tasso di germinazione basso sopra il corso di tempo di misura, (~ 1%) come determinato osservando i cambiamenti morfologici visual. Determinare la vitalità spora consentirebbe questa determinazione di tasso essere convertito in un tasso per ogni numero di spore e isolando teliospores con più alti tassi di germinazione porterebbe a OCRs superiore. La germinazione asincrona di U. maydis teliospores11 è una realtà che deve essere contabilizzata e può aver contribuito ad un'incapacità di rilevare il consumo di ossigeno in germinazione.
Al fine di migliorare l'accuratezza e la precisione di misurazione dei cambiamenti nella respirazione teliospore, futuri adattamenti a questo metodo potrebbero includere OCR di misurazione su base singola cella. Tecniche di micromanipolazione possono essere usate per isolare un singolo teliospore, che possono quindi essere indotti a germinare e il suo tasso di respirazione possono essere monitorati. Questo potrebbe migliorare la risoluzione, fornendo informazioni per quanto riguarda l'OCR durante il turno di dormienza-germinazione per teliospore, anziché per mg di teliospores. Inoltre, questo risolverebbe il problema di confusione di germinazione asincrona.
Per le successive fasi di germinazione, abbiamo sviluppato un metodo di micromanipolazione per isolare teliospores in comune fasi di germinazione. Questo ha permesso la creazione delle popolazioni relativamente sincrono teliospore per l'analisi. Vari metodi per isolare singoli microrganismi sono state descritte e sono stati migliorati negli anni12. Questi metodi includono la diluizione delle sospensioni di spore per ottenere singoli microrganismi, metodi semi-meccanici con l'uso di microcapillari per ottenere le spore che sono trasferite al medium per i metodi di coltura e meccanici che utilizzano micromanipolatori . Metodi precedenti che abbiamo usato per ottenere teliospores nella stessa fase di germinazione sono elutriazione centrifugo controcorrente e filtraggio germinazione teliospores attraverso una membrana di nylon con un diametro dei pori specifici. Utilizzando questi metodi ci ha permessi di arricchire per germinare teliospores, tuttavia, i nostri campioni ancora contenevano teliospores in varie fasi di germinazione13. La tecnologia attuale per micromanipolazione dei singoli microrganismi è migliorata con l'introduzione di più alto ingrandimento e strumenti per un controllo accurato del capillari aghi, aspirazione e trasferimento di microrganismi. Tecniche di micromanipolazione precedenti si sono concentrati su isolamento di singole cellule per coltura o uso singola cella PCR applicazioni14. L'uso di micromanipolatori per isolare singole spore fungine precedentemente non è stata stabilita. Un precedente metodo per isolare singole spore fungine comportava l'uso di una pinzetta o aghi per prendere piccoli pezzi di mezzo solido contenente germinazione spore15. Micromanipolazione con l'uso di micromanipolatori è ampiamente usato negli studi di lievito dove grappoli di ascospore possono essere separati sporulazione seguente in coltura su agar per analisi genetiche meiotic16. Abbiamo sviluppato un metodo che unisce la tecnica di micromanipolazione per cellule batteriche14 e metodi in vitro fertilizzazione per isolare teliospores germinazione. Abbiamo dimostrato che centinaia di comuni teliospores fase di germinazione possa essere ottenuti con questa tecnica. Questi campioni possono essere usati per studi di espressione a valle utilizzando tecniche quali la RT-qPCR o RNA-seq. ottenere una popolazione di teliospores in cui germinazione è sincronizzato permette l'analisi dei cambiamenti specifici nell'espressione genica che si verifica durante all'inizio, metà e successive fasi di germinazione teliospore.
Microdissezione della fase specifica teliospores di germinazione può richiedere esperienza nel set up e riconoscendo le diverse fasi di germinazione, tuttavia, questa esperienza può essere ottenuta rapidamente attraverso la pratica. Ci sono diversi passaggi che devono essere seguite per successo microdissection seguita da isolamento del RNA. In primo luogo, medio di germinazione deve essere integrato con antibiotici (ad es., solfato di streptomicina) per sopprimere la crescita di contaminazione batterica, quando è iniziata la germinazione, così come durante la raccolta di teliospores di germinazione. In secondo luogo, è importante utilizzare una soluzione di stabilizzazione per stabilizzare e proteggere RNA per l'isolamento. La soluzione di stabilizzazione di RNA impedisce inoltre la progressione alla fase successiva germinazione durante la raccolta di ulteriori teliospores teliospores raccolti. In terzo luogo, è importante rimuovere l'olio minerale, una volta che la goccia di raccolta è stata recuperata per garantire successo estrazione del RNA. Infine, abbiamo notato una perdita di qualità di RNA se isolato teliospores sono memorizzate in soluzione di stabilizzazione di RNA per un lungo periodo di tempo; Pertanto, si raccomanda che il RNA è isolato immediatamente dopo il prelievo di teliospores specifica fase di germinazione. Una limitazione del metodo è che la fase ho teliospores raccolti potrebbero contenere dormienti, morto e indotti a germinare teliospores come queste tre fasi sono morfologicamente indistinguibili. Inoltre, durante la raccolta teliospores di fase III, una miscela di teliospores in meiosi I o meiosi II potrei essere ottenuti. Per determinare la fattibilità del campione potrebbe essere un modo per aiutare a distinguere tra teliospores veramente dormienti e morto. Un metodo per valutare la vitalità spora fungina utilizzando saggi di vitalità delle cellule vive/morte potrebbe essere in grado di valutare la percentuale di teliospores vitali da cui maggiori tassi di germinazione potrebbero essere determinato17. Inoltre, nucleo colorazione con DAPI, ad esempio, potrebbe essere utilizzato per visualizzare gli eventi della meiosi che si verificano durante la fase III e la transizione di fase IV per più ulteriormente caratterizzare teliospores morfologicamente alla fase III. Questo aiuterebbe nella collezione del teliospores nella sola fase di germinazione, quando si utilizza il nostro metodo di microdissection.
In conclusione, abbiamo sviluppato un metodo semplice, preciso e riproducibile di misurare i cambiamenti nella respirazione cellulare che si verificano durante il turno di dormienza-germinazione di Ustilago maydis teliospores. Inoltre, abbiamo sviluppato un metodo per la raccolta di specifiche fasi di germinazione teliospores che potrebbero essere utilizzati per applicazioni a valle, come RNA-seq. I nostri metodi possono essere adattati per ospitare vari tipi di cellule e specie. Anticipiamo che miglioramenti alle nostre tecniche faciliterà la rilevazione dei cambiamenti respiratori su una singola spora livello così come ulteriore definizione di eventi che si verificano nelle fasi successive di germinazione.
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Disclosures
Gli autori hanno nessun concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse di rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dr. Paul Frost per uso di sua microrespirometer e Nicole Wagner e Alex Bell per assistenza tecnica. Quest'opera è stata finanziata da una sovvenzione NSERC a B.J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
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