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Biology

Microrespiration 분석 및 기정을 사용 하 여 Teliospore 발 아 조사

doi: 10.3791/57628 Published: May 13, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Smut 버섯 많은 파괴적인 농업 질병을 일으킬. 그들은 환경 큐에 응답에 발 아 휴 teliospores로 분산 됩니다. 우리는 발 아 동안에 분자 변화를 조사 하기 위해 두 방법 개요: 호흡 증가 대사 활성화를 감지 측정 하 고 평가 고유한 형태소 단계에서 teliospores를 분리 하 여 분자 이벤트를 변경.

Abstract

흑 수병 균은 여러 가지 파괴적인 농업 질병의 etiological 대리인. 그들은 두꺼운 분산 에이전트는 teliospores의 생산에 의해 특징은. Teliospores는 수십 년 동안 휴면 유지 수 있습니다. 휴면 낮은 신진 대사 속도 의해 특징 이다, 생 합성 고분자를 일시 중지 하 고 호흡의 레벨을 크게 감소. 필요한 환경 신호를 받으면 teliospores 감염의 새로운 라운드를 시작할 수 있는 단일 셀을 생산 하는 출 아 할. Teliospore 발 아 생 합성 고분자, 증가 한 호흡 및 극적인 형태 변화의 재개에 의해 특징입니다. 발 아의 초기 단계에서 세포 호흡에 변화를 정확 하 게 측정 하기 위해 간단한 프로토콜 클라크-유형 respirometer 고용 개발 했습니다. 발 아의 나중 단계 특정 형태학 상 변화에 의해 구별 된다 하지만 발은 비동기. 우리는 뚜렷한 발 아 단계에서 teliospores를 수집 수 서 기술 개발.

Introduction

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Smut 버섯 (Ustilaginales) 잔디, 옥수수, 보 리, 밀의 중요 한 곡물을 포함 한 작물 손실에 수십억 달러를 일으키는 감염 1600 이상의 종 이루어져 매년1. 이 균 류는 세포 벽을 착 음울는 분산 에이전트는 teliospores의 생산 특징입니다. Teliospores는 호스트 식물 사이의 분산의 스트레스 중 유전 물질을 방패로 작동 하 고 년2에 대 한 휴면 상태에 유지할 수 있습니다. 따라서, teliospores는 질병 확산의 필수적인 구성 요소.

Teliospore 생물학을 공부 하기 위하여 우리의 실험실 모델 smut 균을 Ustilago maydis (미국 maydis)은 '옥수수의 일반적인 검 댕' 질병의 인과 대리인을 이용 한다. 성숙한 미국 maydis teliospores 성장 검거, 감소 된 세포 물질 대사, 세포 호흡3의 낮은 수준에 의해 특징입니다. 유리한 환경 조건에서 (., 특정 설탕의 존재), 미국 maydis teliospores 발 아 하 고 감염의 새로운 라운드를 시작할 수 있는 감수 분열, 생산 basidiospores 완료. 발은 증가 한 호흡, 대사를 반환 활동 및 발 아4의 현저한 형태학 단계를 통해 진행이 특징 이다.

그러나 증가 한 호흡 및 대사 기능을 포함 하는 발 아 초기 단계,, 변화의 형태학 표시가 없습니다. 원래 미국 maydis 에 호흡 변화 측정 50 년 전, 바르 부르 크 플라스 크 장치5와 manometrically 산소 소비량 측정 실행 되었다. 클라크-유형 microrespirometer을 사용 하 여 발 아의 시간 과정을 통해 산소 소비량을 측정 하 여 호흡 teliospore 발 아 동안에 정확한 변화를 공부 하 고 새로운, 간단한 방법을 개발 했습니다. 우리는 이전 야생-타입 사이의 호흡 속도에 변화를 공부 하이 메서드를 사용 미국 maydis 단일 세포 및 결함이 있는 미토 콘 드리 아6, 돌연변이가지고 여기에 프로토콜 teliospore 호흡 동안에 변화를 공부 하 발 아입니다. 이 우리가 발 아 초기 분자 이벤트 조사 개시 후 적절 한 시기에 teliospores을 타겟팅 할 수 있도록 호흡의 타이밍을 정확 하 게 식별 하는 수단을 제공 합니다. 일단은 promycelia, teliospore에서 나온다 하지만 비동기 자연 조사에 대 한 특정된 단계에서 충분 한 teliospores의 절연을 저해 발 아의 진행을 현미경으로 다음 수 있습니다. 우리는 비슷한 물리적으로 발 아의 고유한 형태소 단계에서 teliospores 수집을 체 외에서 수정에 사용 되는 기정 기법 개발.

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Protocol

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1. 옥수수 옥수수 속 감염

  1. 지 시 메이 스 (cv. 골든 자그마한) 성장까지 cobs 형성 되 고 실크 (약 60 일)를 시작 했습니다.
  2. 호환 단일 미국 maydis 문화 긴장 이전 표준 프로토콜을 사용 하 여 설명7.
  3. 앞에서 설명한7표준 프로토콜을 사용 하 여 옥수수 cobs 감염.

2. teliospore 수확

  1. 고압 장비 (Büchner 퍼 널, Büchner 플라스 크, blenders, 250 mL 원심 분리기, 편평한 주걱, 병과 물) 표준 건조를 사용 하 여 적어도 30 분 살 균 121 ° C (물에 대 한 표준 액체 주기)에 주기.
  2. 감염 된 속 식물 (약 28 ~ 35 일 게시 감염)에서 면도칼을 사용 하 여 제거 하 고 벤치 보호자에 덮여 쟁반에는 속 설정.
  3. 면도날으로 속에서 있는 종양을 제거 하 고 비 커에서 수집.
  4. 250 mL 실험실 믹서 기 컵 종양으로 약 1/3 전체 때까지 믹서 컵은 약 3/4까지 압력가 dH2O 추가 전체. 무 균 때까지 낮은, 믹서 기를 펄스는 종양을 방해.
  5. 물 함정 그리고 1 L Büchner 플라스 크 진공 펌프를 연결 합니다.
  6. 플라스 크에 큰 Büchner 퍼 널을 삽입 하 고 투박한 무명의 4 개의 층을 가진 Büchner 퍼 널의 바닥을 일렬로 세우십시오.
  7. 진공 펌프를 켭니다.
  8. 주걱으로 투박한 부스러기를 통해 무 균된 종양의 일부를 부 어.
  9. 일부 dH2O을 통해 teliospores를 플러시 순서는 투박한 무명에 붓으십시오.
  10. DH2까지 반복 O는 투박한 무명을 통해 분명 하다.
  11. 최대 teliospore 복구 되도록 필터에 무 균된 종양 물자를 포함 하는 투박한 아웃 찰 짜 십시오.
  12. 1 L Büchner 플라스 크에 가까운 지 고 완전 한, 큰 삼각 플라스 크에 빈 고 따로 설정.
  13. 투박한 무명의 새로운 조각을 필터에 넣고를 반복 (2.7-2.12) 단계는 종양의 모든 중단 하 고 필터링.
  14. 압력가 250 mL 원심 병 및 5 분, 1000 x g에서 원심 분리기로 필터링 된 teliospores를 부 어 하 고는 상쾌한 가만히 따르다.
  15. 모든 필터링 된 teliospores는 수송과 원심 분리에 의해 때까지 2.14 단계를 반복 합니다.
  16. 적은 양의 물과 전송 50 mL 원심 분리기 튜브에 펠 릿을 일시 중단 합니다.
  17. 5 분, 1000 x g에서 튜브 원심 고는 상쾌한 가만히 따르다.
  18. DH2O의 약 50 mL에 펠 릿을 일시 중단 하 고, 5 분, 1000 x g에서 튜브 원심는 상쾌한 가만히 따르다. 부드럽게 주걱와 그것의 dispose 회색 상위 레이어를 다쳤어요. 위에 회색 레이어는 더 이상 때까지 반복 합니다.
  19. 건조는 샘플 진공 desiccator에서 하룻밤.
  20. 사용 될 때까지 4 ° C에서 건조 teliospores를 저장 합니다.
  21. 원하는 경우, 발 아를 유도 하기 전에 구리 황산 염8 teliospores을 취급 합니다. 치료 하지 않으면 다음 샘플 순수 teliospores 나타내고 박테리아 또는 다른 오염 없는 것인지 teliospores의 철저 한 현미경 분석을 수행 합니다.
    1. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 teliospores의 대략 50 밀리 그램을 무게.
    2. 포함 하는 teliospores 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 0.75% CuSO4 의 약 1.0 mL를 추가 합니다. 위쪽 및 아래쪽 3 h에 대 한 샘플 교 반 이어서 CuSO4 솔루션에는 teliospores를 일시 중단 하는 플라스틱.
    3. 5 분 동안 2500 x g에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. Resuspend 살 균 물 teliospore 펠 릿, 원심 분리, 반복 하 고는 상쾌한 제거.
    4. 단계 2.21.3 두 번 더 반복 합니다.

3. teliospore 생존 능력 및 발 아 시험

  1. 그들의 생존 능력을 평가 하는 1.5 mL microcentrifuge 관에서 미국 maydis teliospores의 약 10 mg을 발 아의 타이밍 무게.
  2. Biosafety 내각에 스 황산 (160 µ g/mL)와 보충 감자 포도 당 국물 (PDB, 24 g/L)를 준비 합니다.
  3. PDB의 500 µ L에는 teliospores를 일시 중단 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 teliospores의 모든 덩어리 헤어 플라스틱.
  4. Teliospore 정지 압력가 250 mL 삼각 플라스 크는 PDB의 10 mL를 포함 전송.
  5. 28 ° c 12-16 h 90 rpm 동요 플라스 크를 품 어.
  6. Biosafety 내각에서 발 아 하 고 현미경 슬라이드를 준비 하도록 유도 하는 teliospores의 20 µ L 샘플을 제거 합니다.
  7. 존재 하는 발 아의 단계 및 세균 오염 물질의 존재를 평가 시각적으로 현미경을 사용 하 여.
    1. teliospores의 수를 계산 하는 hemocytometer를 사용 하 여 V를 통해 나의 단계와 출 아 했다가지고 % 결정.
    2. 경우에 단계 I teliospores는, teliospore 발 아를 평가 하기 전에 24 시간 총 플라스 크를 품 어 계속. 샘플을 실행 가능한 비 deeming 전에 최대 48 h에 대 한 보육을 계속 합니다.
    3. 세균성 오염 있으면 스 황산 (160 µ g/mL) 뿐만 아니라 대 황산 (50 µ g/mL)와 PDB를 보충 하 고 단계 3.1 3.7 반복. 세균 오염 계속 되 면 황산 구리와 teliospores를 치료 하 고 단계 3.1 3.7를 반복 합니다.

4입니다. 호흡 모니터링에 대 한 발 아의 유도

  1. 동일한 금액을 무게 (., 50 mg) 각 호흡 실험에 대 한 teliospores의.
  2. Biosafety 내각에 압력가 호흡 약 실에 teliospores을 추가 합니다.
  3. 채우기 PDB (24 g/L)와 챔버 스 황산 (160 µ g/mL)과 대 (50 µ g/mL)와 보충.
  4. 아래로 teliospore 정지를 만드는 플라스틱.
  5. 공기가 꽉 인감을 만들려고 챔버 챔버 뚜껑을 놓습니다.

5. 산소 소비 속도 (OCR) 측정을 얻기

  1. 물 목욕 (28 ° C에 미리 데워) 내부 챔버 선반에 챔버를 놓습니다.
  2. O2 프로브는 챔버의 개통 안에 놓습니다.
  3. "SensorTrace 속도" 프로그램에 실시간으로에서 표시 하는 데이터 요소를 모니터링 하 고 프로브 (~ 3 분 후 프로브는 챔버에 배치 됩니다)을 안정화 하자.
  4. O2 수준을 지속적으로 6 h 2 s 간격 기록 측정 측정을 "측정"을 클릭 합니다.
  5. 측정을 중지 하 고 각 샘플 분석을 위해 단계 4.1-5.4 반복 합니다.
  6. 클릭 하 여 Microsoft Excel로 데이터를 내보내기 "파일 | 수출 | .Xls로 저장 "합니다.

6. 데이터 분석

  1. OCR을 계산
    1. "Within_Rates" 탭에서 내보낸된 Excel 파일에서 각 챔버 측정 (nmol/h)에 대 한 "속도"를 기록 합니다.
    2. 각 실험 샘플에 대 한 수정 된 OCR 값을 얻기 위해 실험 시료 챔버의 "속도"에서 빈 챔버의 "속도"를 빼기 고이 숫자의 절대 값.
    3. Teliospores의 밀리 그램 당 총 OCR 대량 사용 하는 휴대 하 여 수정 된 절대 OCR 값을 나누어 계산 합니다.
    4. 평균 각 변형에 대 한 "teliospores의 밀리 그램 당 OCR" 값을 복제 합니다.
  2. 적절 한 통계적 방법을 사용 하 여 데이터를 분석 (., 스튜던트 t-검정, 분산 분석) 다른 통계 소프트웨어의 Microsoft Excel을 사용 하 여.
  3. 원시 데이터를 그래프, 그래프 하고자 하는 각 시간 점에 대 한 남아 있는 산소의 비율을 계산. 자체에 나누어 첫 번째 읽기 (100% 산소 남은) 100을 곱하면, 다음 첫 번째 독서에 나누어 각 후속 읽기 그리고 산소 챔버에 남아 %를 100을 곱하십시오.

7. Teliospore 발 아 발 아의 다른 단계에서 Teliospores을 유도

  1. PDB (24 g/L) biosafety 캐비닛에 스 황산 (160 µ g/mL)와 보완을 준비 합니다.
  2. 1.5 mL microcentrifuge 관으로 미국 maydis teliospores의 약 10 mg을 놓습니다.
  3. PDB의 500 µ L에는 teliospores를 일시 중단 합니다. 부드럽게 혼합 매체에 teliospores의 아무 덩어리까지 피 펫.
  4. Teliospore 서 스 펜 션 스 황산으로 보충 하는 PDB를 포함 하는 압력가 250 mL 삼각 플라스 크에 전송.
  5. 90 rpm에서 떨고 28 ° C에서 하룻밤 플라스 크를 품 어.

8입니다. 페 트리 접시 및 Micromanipulator 준비

  1. Microcapillary 준비 및 샘플 컬렉션에 대 한 방울의 pipetting 행 페 트리 접시 (57 c m2)를 준비 합니다.
    1. 페 트리 접시의 위쪽에 5 µ L (x 4) dH2O 방울 플라스틱.
    2. 샘플 컬렉션에 사용할 페 트리 접시에 RNA 안정화 솔루션의 2 µ L (x3) 플라스틱
    3. 페 트리 접시에 teliospores 출의 5 µ L (x 30) 물방울 플라스틱
  2. 페 트리 접시에 미네랄 오일 15 mL를 추가 합니다. 모든 방울 진행 하기 전에 기름에 의해 보호 됩니다 확인 하십시오.
  3. 15 µ m 내부 직경, 1 mm 플랜지, 55 m m 길이와 각도 20 ° 팁 microcapillary microcapillary 홀더에 그것을 배치 하 고 미네랄 오일에 모 세관 작용 광 유는 microcapillary를 입력 하면 그것을 물속으로 준비 합니다. 물 방울을 가져오기 전에 microcapillary에서 압력을 릴리스 합니다. 준비 물으로 microcapillary 발음.

9. 단계-특정 출 Teliospores의 격리

  1. micromanipulator의 컨트롤을 사용 하 여 이동 준비 microcapillary 발 아 방울 중 하나. 작은 물방울을 관통 하 고 microcapillary, 낮은 관심의 발 아 단계에서 germinating teliospore까지 microcapillary의 입을 가져다.
  2. 천천히 발음 germinating teliospore 캡처. 발음은 teliospore에서 microcapillary를 입력 했습니다 일단 중지 합니다. 약 5 teliospores는 microcapillary에 도착할 때까지 반복 합니다.
  3. micromanipulator와 microcapillary를 RNA 안정화 솔루션의 컬렉션 방울을가지고. 드롭릿에 관통 하 고는 작은 물방울에는 teliospores를 주입.
  4. 8.1 8.3 단계를 반복 하 여 약 1000 teliospores 체포 되었습니다.

10입니다. 컬렉션 물방울의 복구

  1. 컬렉션 물방울을 pipette 고는 RNase/DNase 무료 2.0 mL microcentrifuge 튜브의 뚜껑을 전송. 조심 스럽게 컬렉션 물방울을 방해 하지 않고 한 피 펫과 미네랄 오일 제거.
  2. teliospores를 사용 하 여 RNA 격리 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한.

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Representative Results

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우리는 휴면 teliospores 전시 호흡 (~ 1075 µ / h/mg) 출에 비해 낮은 수준 확인 teliospore 휴면 및 발 아 동안 호흡에 변화를 측정의 클라크-유형 microrespirometer 기반 방법을 사용 하 여, teliospores (~ 2,614 µ / h/mg; 그림 1A)입니다. 이 휴면 teliospores와 teliospores 발 아를 유도 하는 호흡의 평균 속도 ~2.4-fold 변화를 나타냅니다. 또한, 우리는 발 아를 유도 하는 teliospores 있는 ~ 45 분 지연 산소 통풍 관 (그림 1B)을 확인 했습니다. 이 뿐만 아니라 발 아의 유도 및 산소 측정의 시작 ~ 15 분 간격 ~ 30 분 지연 산소 통풍 관 (그림 1B)에 의해 표시 됩니다. 이 눈에 띄게 변화 germinating teliospores 분자 변화를 평가 하려면 시간 점을 나타냅니다.

발 아 동안 변경 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 발 아의 다섯 단계를 결정 했다. 발 아만 남아 휴면 teliospores 구별할 유도 발 아 대표 teliospores의 무대. 단계 II teliospores 신흥 promycelium는 teliospore의 직경 보다 작거나 길이 있다. 단계 III teliospores promycelia teliospore 직경 보다 큰 있다. 발 아의 단계 IV basidiospores promycelia에서 초기 신진 이며 무대 V 신진 나누어 결과 단일 basidiospores (그림 2). 우리가 개발한 서 기술을 사용 하 여, 우리는 성공적으로 고립 된 500 1000 출 teliospores RT-PCR 또는 RNA-Seq (표 1)에 대 한 RNA 격리 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한. 그림 3 의 서에 대 한 Petri dish와 서는 micromanipulator를 사용 하 여에 대 한 단계 일반적인 집합을 보여 줍니다.

Figure 1
그림 1: teliospore 발 아 중 산소 소비량의 시간 과정. 휴면 teliospores, 발 아를 유도 했다 고 산소 레벨 6 h 클라크-유형 microrespirometer을 사용 하 여 지속적으로 기록 되었다. 취소 유도 휴면 teliospores 컨트롤을 사용 하 고 모든 측정 빈 샘플으로 표준화 되었다. (A) 데이터 평균 OCR로 표현. (B) 원시 데이터 시간 과정 OCR에 변경의 탐지를 허용 하는 호흡 곡선을 꾸몄다. 발 아를 유도 teliospores 유엔 유도 휴면 teliospores 보다 2.4-fold 평균 속도로 산소 소비 (p < 0.01; 학생의 t-테스트). 돼지: 사후 감 응 작용 발 아의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: teliospore 발 아 단계. Teliospore 발 아의 V를 통해 나는 설명 하는 단계 (A-E). 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 기정 teliospores 출의 형태학 단계로 분리. 서에 대 한 Petri dish 및 teliospore 단계 III의 발 아에서 격리 하기 위한 단계를 일반 설정 설명 됩니다. (A) 페 트리 접시의 그림 방울 중 살 균 물, RNA 안정화 솔루션을 포함 하거나 teliospores 출 행으로 설정 합니다. 발 아 유도, 다음 teliospores 기정을 사용 하 여 발 아의 특정 단계에서 분리 했다. (B) 단계에서 teliospores을 발 아를 유도 포함 하는 발 아 물방울 III를 통해 나. (C) 준비 microcapillary 포부를 통해 컬렉션에 대 한 단계 III teliospore에 오게 됐다. (D)는 단계 III teliospore 유리 microcapillary에는 발 아 물방울에서 제거 하 고 컬렉션 물방울으로 이동. (E)는 microcapillary 컬렉션 물방울 포함 RNA 안정화 솔루션에 삽입 된 하 고 단계 III teliospore는 작은 물방울에 주입 했다. (F) RNA 안정화 솔루션에서 단계 III teliospores의 컬렉션입니다. 눈금 막대 = 20 µ m (A D, F)와 50 µ m (E). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

발 아 단계 수 출 teliospores 절연의
단계 I 1000
단계 II 500
단계 III 650

표 1: 출 teliospores 성공적으로 각 발 아 단계는 표준 격리 실험에 대 한 격리 수. 테이블 설명 단계에 대 한 서를 사용 하 여 격리 된 teliospores의 평균 숫자 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 수집 전에 III를 통해 나.

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Discussion

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담 biotrophic 식물 병원 균을 일으킬 작물 손실에 수십억 달러의 매년. 이러한 병원 균의 대부분 곰 팡이 분산 및 유성 생식에 통합 되는 teliospores 생산. 개발의 지식과 teliospores의 발 아를 확보 하는 것이 이러한 곰 팡이로 인 한 치명적인 질병의 확산을 이해 중요 합니다. 주요 제어 지점에서 분자 변화를 파악 하기 위해 우리 생리 적 변화와 발 아의 다른 단계에서 teliospores을 다른의 타이밍을 식별 하는 방법을 고안 했다. 세토 외. 가벼운 현미경 검사 법 (그림 2)에 의해 발 아 teliospore의 (미 발표) 지적된 5 단계. 동안 생리 활성화를 조사 하기 위하여 단계 I 고 발 아 동안 호흡 속도 평가, 우리 사용 클라크-유형 microrespirometer 산소 소비량에서 변화를 정확 하 게 측정. 샘플 데이터는 우리의 방법은 정확 하 고 재현성 높은 나타냅니다. 우리의 연구 결과 미국 maydis 출 teliospores 전시 취소 유도 휴면 teliospores에 비해 세포 호흡에 급격 한 증가 확인 합니다. 처음으로, 우리는 발 아를 유도 미 maydis teliospores ~ 45 분 지연 산소 통풍 관에 전시 확인 했습니다. 이것은 미국 maydis teliospores 발 신호를 처리 하는 데 몇 시간이 필요할 수 있습니다 (., 설탕의 존재), 전에 그 증가 산소 통풍 관은 발 신호에 대 한 매우 즉각적인 응답 중 또는 우리의 분석 결과 초기 산소에서 최소한의 변화를 검출 하기 위하여 충분히 과민 했다.

Smut teliospores의 호흡 속도 검토 하는 연구3 산소를 측정 하는 바르 부르 크 플라스 크 장치에 의존 하는 이전 수준의 manometrically5. 간단히,이 방법은 혈압 계 팔에 액체 레벨 변경의 직접 관찰을 통해 동봉 된 플라스 크에 압력에서 변화를 감지 하 여 산소 소비와 CO2 생산을 측정 합니다. 실험 수 설정, 그리고 측정 정확한 수 있습니다. 장치 측정의 기간 내내 참석 해야 하 고, 광범위 한 계산 OCR을 추정 하는 데 필요한. 우리의 프로토콜 기술 발전의 사용, 실험의 기간에 대 한 기구에 의해 유지 하는 사용자에 대 한 눈, 측정을 수행 하 고 광범위 한 수학 수식을 사용 하 여 필요 없는 게. 그러나 기타 초기 클라크-유형 respirometers Neurospora crassa9Botryodpilodia theobromae10 포자의 측정 OCR 사용한,, 이러한 초기 악기 허용 최대 20 분 연속 측정. 이 제한 것가지고 수 없습니다 ~ 45 분 지연의 식별 최신 모델 respirometer와 함께 관찰 하는 산소 통풍 관에. 우리의 프로토콜이 했다 데이터 해석을, 간단 하 게 판독은 어떤 계산 이나 데이터 조작 없이 직접 그래프로 수 챔버에 남아 있는 산소의 농도. 또한, 그것은 연속 측정 가능 (매 2 s) 시간 사용할 수 있는 산소는 완전히 소진 될 때까지 무기한 금액에 대 한. 이 시간의 오랜 기간 동안 호흡에 작은 변화의 식별을 허용합니다. 따라서, 우리 이전 기술을 향상 하 고 곰 팡이 포자의 산소 소비를 측정 하, 정확 하 게, 간단 하 고 재현할 수 방법을 개발 했다. 우리의 지식을 하려면이를 사용 하 여 현대적인 클락 형 respirometer teliospores 검 댕 버섯의 출 대 휴면의 호흡 공부 첫 번째 연구 이다.

쉽고이 프로토콜의 단순에도 불구 하 고 최적화가 필요 하 고 생물 학적 현실 분석을 제한 하는 있다. 합리적인 OCRs 달성 하기 위해 첫 번째, 적절 한 샘플 크기를 식별 합니다. 너무 많은 샘플 조 산소 수준의 충돌 이어질 수 있으며 너무 작은 샘플 산소 소비에 의미 있는 변화를 관찰 하는 무 능력에서 발생할 수 있습니다. 둘째, 정확한 초기 데이터를 제공 (3 분)를 안정 시키기 위해 조사 시간을 허용 하는 것이 필수적 이다. 마지막으로, 그것은 항균 작용 발 아 매체를 보충 하는 것이 중요 (., 스 황산) 세균 오염 OCR 판독을 변경 하지 않습니다 있도록. 우리가 직면 하는 생물학적 한계 측정, (~ 1%)으로 시각적인 형태학 상 변화를 관찰 하 여 결정의 시간에 걸쳐 낮은 발 아 비율을 했다. 포자 수 당 속도으로 변환 되도록이 율 결정 허용 포자의 생존 능력을 결정 하 고 높은 OCRs 이어질 것 이라고 teliospores의 발 아와 분리. 미국 maydis teliospores11 의 비동기 발 아에 대 한 설명 되어야 하 고 발 아 앞부분에서 산소 소비를 감지 하는 무 능력에 기여 할 수 있습니다 하는 현실 이다.

개선 하기 위해 정확도 정밀도의 teliospore 호흡 측정 변화, 미래 적응이이 메서드를 단일 셀 단위로 OCR을 측정을 포함할 수 있습니다. Micromanipulation 기술은 다음, 발 아를 유도 될 수 있다 그리고 그것의 호흡 속도 모니터링할 수 있는 단일 teliospore을 사용할 수 있습니다. 이 teliospore, 당 보다는 teliospores의 밀리 그램 당 휴면 발 교대 동안에 OCR에 대 한 정보를 제공 하는 해상도 향상 시킬 수 있습니다. 또한,이 비동기 발 아의 혼란 문제를 해결할 것 이다.

발 아의 나중의 단계에 대 한 우리는 발 아의 일반적인 단계에서 teliospores를 분리 하는 micromanipulation 방법을 개발 했다. 이 분석에 대 한 상대적으로 동기 teliospore 인구의 창조 허용. 단일 미생물 분리를 위한 다양 한 방법을 설명 되 고12년 동안에 향상 되었습니다. 이러한 방법은 단일 미생물, 자란, 및 기계적 방법 micromanipulators을 사용 하는 매체에 전송 되는 포자를 microcapillaries의 사용과 반 기계적인 방법의 얻을 포자 현 탁 액의 희석을 포함 . 우리는 발 아의 동일한 단계에서 teliospores를 사용 하는 이전 방법을 특히 원심 elutriation 등 특정 기 공 크기와 나일론 막 통해 출 teliospores 필터링. 그러나 우리가이 방법을 사용 하 여 teliospores 출에 대 한 풍부 하 게,, 우리의 샘플 여전히 포함 teliospores 발 아13의 다양 한 단계에서. 단일 미생물의 micromanipulation에 대 한 현재 기술 높은 배율 및 모 세관 바늘, 포부, 및 미생물의 전송의 정밀한 제어를 위한 계기의 소개와 함께 향상 되었습니다. 이전 micromanipulation 기술은 단일 세포 배양 또는 단일 셀 PCR 응용 프로그램14에 사용 하기 위해 격리에 집중 했다. 하나의 곰 팡이 포자를 분리 하는 micromanipulators 사용 하 여 이전 설립 하지 않았습니다. 하나의 곰 팡이 포자를 고립 시키기를 위한 이전 방법 좋은 집게 또는 출 아 포자15를 포함 하는 고체 매체의 작은 조각을 선택 하는 바늘의 사용을 참여. Micromanipulators의 사용과 micromanipulation은 ascospores의 클러스터 meiotic 유전자 분석16한 천 매체에 문화에서 분리 된 다음 포자 형성 될 수 있는 하는 효 모 연구에 널리 사용 됩니다. 세균성 세포14 micromanipulation 기법을 결합 하는 방법 및 출 teliospores를 고립 시키기를 위한 수정 방법을 생체 외에서 개발 했습니다. 우리는이 기법으로 일반적인 발 아 단계 teliospores의 수백을 얻을 수 있습니다 나타났습니다. 이러한 샘플 실시간 정량 Pcr과 같은 기술을 사용 하 여 다운스트림 식 연구에 사용할 수 있습니다 또는 RNA-이 발 아를 동기화 하는 teliospores의 인구를 얻는 동안 발생 하는 유전자 발현에서 특정 변화의 분석 허용 초기, 중간 및 저장 단계 teliospore 발 아의.

그러나 출 teliospores 특정 단계의 기정을 세트에서 경험 해야 하 고 발 아의 다른 단계를 인식,,이 경험을 통해 얻을 수 있습니다 신속 하 게 연습. 뒤에 RNA 격리 하는 성공적인 서 따라 해야 합니다 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 발 아 중 항생제로 보충 해야 합니다 (., 스 황산) teliospores 출의 수집 하는 동안 뿐만 아니라 발 아 시작 되 면 세균 오염의 성장을 억제를. 둘째, 그것은 절연에 대 한 RNA를 안정화 안정화 솔루션을 사용 하는 것이 중요입니다. RNA 안정화 솔루션 또한 추가 teliospores를 수집 하는 동안 다음 발 아 단계로 진행에서 수집 된 teliospores를 방지 합니다. 셋째, 그것은 컬렉션 드롭릿 RNA 추출 되도록 복구 되었습니다 일단 광 유를 제거 하는 것이 중요입니다. 마지막으로, 우리가 나타났습니다 RNA 품질의 일부 손실 고립 된 teliospores; 시간의 연장된 기간에 대 한 RNA 안정화 솔루션에 저장 된 경우 따라서, RNA는 즉시 발 아 단계 특정 teliospores의 컬렉션 다음 격리 하는 것이 좋습니다. 방법의 한계는 무대 나 teliospores 수집 휴면, 죽은, 및이 3 개의 단계 형태학 상으로 구별 되지 않는 teliospores 발 아를 유도 하는 포함 될 수 있습니다. 또한, 단계 III teliospores를 수집 하는 때 감수 분열에서 teliospores의 혼합물 나 감수 분열 II 수 있습니다. 얻을 수 있습니다. 한 가지 방법은 진정으로 휴면 하 고 죽은 teliospores를 구별에 도움이 샘플의 생존 능력 결정 수 있습니다. 라이브/죽은 세포 생존 능력 분석 실험을 사용 하 여 곰 팡이 포자 생존 능력을 평가 하는 방법 가능한 teliospores는 더 유익한 발 아 율 결정된17수의 비율을 평가 하기 위해 수 있습니다. 또한, 핵 DAPI로 얼룩 예 수 사용할 단계 III와 단계 IV에 전환 하는 동안 발생 하는 추가 teliospores 단계 III에 형태학 상으로 성격을 나타내기 위하여 감수 분열의 이벤트 시각화 하. 우리의 서 메서드를 사용할 때이 것이 발 아의 한 단계에 있는 teliospores의 컬렉션에 도움이 됩니다.

결론적으로, Ustilago maydis teliospores의 휴면 발 아 변화 하는 동안 발생 하는 세포 호흡의 변화를 측정의 간단 하 고 정확 하 게 재현 방법을 개발 했습니다. 또한, RNA이 같은 다운스트림 응용 프로그램 사용할 수 있는 teliospores 출의 특정 단계를 수집 하는 방법을 개발 했습니다. 우리의 방법을 다양 한 세포 유형 및 종에 맞게 적용할 수 있습니다. 우리는 우리의 기술에 향상 호흡 변화 수준 뿐만 아니라 발 아의 나중 단계에서 발생 하는 이벤트를 정의 하는 추가 단일 포자의 탐지를 촉진 한다 예상.

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Disclosures

저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌 공개할 수 있다.

Acknowledgments

우리는 그의 microrespirometer의 사용을 위한 닥터 폴 리와 니콜 바그너와 기술 지원에 대 한 알렉스 벨에 게 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 투자는 NSERC 그랜트 B.J.S.에 의해

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptomycin Sulfate BioShop STP101
Kanamycin Sulfate BioShop KAN201
Potato Dextrose Broth BD Difco 254920
1 L Waring Laboratory blender Waring 7011S
Cheesecloth VWR 470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock ThermoFisher Scientific 5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2) Unisense OX10
MicroOptode Meter Amplifier Unisense N/A
MR-Ch Small Unisense MR-Ch
SensorTrace Rate Software Unisense N/A
MicroRespiration Rack Unisense MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer Unisense MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope Zeiss
Coarse Manipulator Narishige MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator Narishige MMO-202ND
Pneumatic Microinjector Narishige IM-11-2
TransferTip (ES) Eppendorf 5175107004

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References

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Microrespiration 분석 및 기정을 사용 하 여 Teliospore 발 아 조사
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Ostrowski, L. A., Seto, A. M., Saville, B. Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection. J. Vis. Exp. (135), e57628, doi:10.3791/57628 (2018).More

Ostrowski, L. A., Seto, A. M., Saville, B. Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection. J. Vis. Exp. (135), e57628, doi:10.3791/57628 (2018).

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