Summary
Smut 버섯 많은 파괴적인 농업 질병을 일으킬. 그들은 환경 큐에 응답에 발 아 휴 teliospores로 분산 됩니다. 우리는 발 아 동안에 분자 변화를 조사 하기 위해 두 방법 개요: 호흡 증가 대사 활성화를 감지 측정 하 고 평가 고유한 형태소 단계에서 teliospores를 분리 하 여 분자 이벤트를 변경.
Abstract
흑 수병 균은 여러 가지 파괴적인 농업 질병의 etiological 대리인. 그들은 두꺼운 분산 에이전트는 teliospores의 생산에 의해 특징은. Teliospores는 수십 년 동안 휴면 유지 수 있습니다. 휴면 낮은 신진 대사 속도 의해 특징 이다, 생 합성 고분자를 일시 중지 하 고 호흡의 레벨을 크게 감소. 필요한 환경 신호를 받으면 teliospores 감염의 새로운 라운드를 시작할 수 있는 단일 셀을 생산 하는 출 아 할. Teliospore 발 아 생 합성 고분자, 증가 한 호흡 및 극적인 형태 변화의 재개에 의해 특징입니다. 발 아의 초기 단계에서 세포 호흡에 변화를 정확 하 게 측정 하기 위해 간단한 프로토콜 클라크-유형 respirometer 고용 개발 했습니다. 발 아의 나중 단계 특정 형태학 상 변화에 의해 구별 된다 하지만 발은 비동기. 우리는 뚜렷한 발 아 단계에서 teliospores를 수집 수 서 기술 개발.
Introduction
Smut 버섯 (Ustilaginales) 잔디, 옥수수, 보 리, 밀의 중요 한 곡물을 포함 한 작물 손실에 수십억 달러를 일으키는 감염 1600 이상의 종 이루어져 매년1. 이 균 류는 세포 벽을 착 음울는 분산 에이전트는 teliospores의 생산 특징입니다. Teliospores는 호스트 식물 사이의 분산의 스트레스 중 유전 물질을 방패로 작동 하 고 년2에 대 한 휴면 상태에 유지할 수 있습니다. 따라서, teliospores는 질병 확산의 필수적인 구성 요소.
Teliospore 생물학을 공부 하기 위하여 우리의 실험실 모델 smut 균을 Ustilago maydis (미국 maydis)은 '옥수수의 일반적인 검 댕' 질병의 인과 대리인을 이용 한다. 성숙한 미국 maydis teliospores 성장 검거, 감소 된 세포 물질 대사, 세포 호흡3의 낮은 수준에 의해 특징입니다. 유리한 환경 조건에서 (예., 특정 설탕의 존재), 미국 maydis teliospores 발 아 하 고 감염의 새로운 라운드를 시작할 수 있는 감수 분열, 생산 basidiospores 완료. 발은 증가 한 호흡, 대사를 반환 활동 및 발 아4의 현저한 형태학 단계를 통해 진행이 특징 이다.
그러나 증가 한 호흡 및 대사 기능을 포함 하는 발 아 초기 단계,, 변화의 형태학 표시가 없습니다. 원래 미국 maydis 에 호흡 변화 측정 50 년 전, 바르 부르 크 플라스 크 장치5와 manometrically 산소 소비량 측정 실행 되었다. 클라크-유형 microrespirometer을 사용 하 여 발 아의 시간 과정을 통해 산소 소비량을 측정 하 여 호흡 teliospore 발 아 동안에 정확한 변화를 공부 하 고 새로운, 간단한 방법을 개발 했습니다. 우리는 이전 야생-타입 사이의 호흡 속도에 변화를 공부 하이 메서드를 사용 미국 maydis 단일 세포 및 결함이 있는 미토 콘 드리 아6, 돌연변이가지고 여기에 프로토콜 teliospore 호흡 동안에 변화를 공부 하 발 아입니다. 이 우리가 발 아 초기 분자 이벤트 조사 개시 후 적절 한 시기에 teliospores을 타겟팅 할 수 있도록 호흡의 타이밍을 정확 하 게 식별 하는 수단을 제공 합니다. 일단은 promycelia, teliospore에서 나온다 하지만 비동기 자연 조사에 대 한 특정된 단계에서 충분 한 teliospores의 절연을 저해 발 아의 진행을 현미경으로 다음 수 있습니다. 우리는 비슷한 물리적으로 발 아의 고유한 형태소 단계에서 teliospores 수집을 체 외에서 수정에 사용 되는 기정 기법 개발.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 옥수수 옥수수 속 감염
- 지 시 메이 스 (cv. 골든 자그마한) 성장까지 cobs 형성 되 고 실크 (약 60 일)를 시작 했습니다.
- 호환 단일 미국 maydis 문화 긴장 이전 표준 프로토콜을 사용 하 여 설명7.
- 앞에서 설명한7표준 프로토콜을 사용 하 여 옥수수 cobs 감염.
2. teliospore 수확
- 고압 장비 (Büchner 퍼 널, Büchner 플라스 크, blenders, 250 mL 원심 분리기, 편평한 주걱, 병과 물) 표준 건조를 사용 하 여 적어도 30 분 살 균 121 ° C (물에 대 한 표준 액체 주기)에 주기.
- 감염 된 속 식물 (약 28 ~ 35 일 게시 감염)에서 면도칼을 사용 하 여 제거 하 고 벤치 보호자에 덮여 쟁반에는 속 설정.
- 면도날으로 속에서 있는 종양을 제거 하 고 비 커에서 수집.
- 250 mL 실험실 믹서 기 컵 종양으로 약 1/3 전체 때까지 믹서 컵은 약 3/4까지 압력가 dH2O 추가 전체. 무 균 때까지 낮은, 믹서 기를 펄스는 종양을 방해.
- 물 함정 그리고 1 L Büchner 플라스 크 진공 펌프를 연결 합니다.
- 플라스 크에 큰 Büchner 퍼 널을 삽입 하 고 투박한 무명의 4 개의 층을 가진 Büchner 퍼 널의 바닥을 일렬로 세우십시오.
- 진공 펌프를 켭니다.
- 주걱으로 투박한 부스러기를 통해 무 균된 종양의 일부를 부 어.
- 일부 dH2O을 통해 teliospores를 플러시 순서는 투박한 무명에 붓으십시오.
- DH2까지 반복 O는 투박한 무명을 통해 분명 하다.
- 최대 teliospore 복구 되도록 필터에 무 균된 종양 물자를 포함 하는 투박한 아웃 찰 짜 십시오.
- 1 L Büchner 플라스 크에 가까운 지 고 완전 한, 큰 삼각 플라스 크에 빈 고 따로 설정.
- 투박한 무명의 새로운 조각을 필터에 넣고를 반복 (2.7-2.12) 단계는 종양의 모든 중단 하 고 필터링.
- 압력가 250 mL 원심 병 및 5 분, 1000 x g에서 원심 분리기로 필터링 된 teliospores를 부 어 하 고는 상쾌한 가만히 따르다.
- 모든 필터링 된 teliospores는 수송과 원심 분리에 의해 때까지 2.14 단계를 반복 합니다.
- 적은 양의 물과 전송 50 mL 원심 분리기 튜브에 펠 릿을 일시 중단 합니다.
- 5 분, 1000 x g에서 튜브 원심 고는 상쾌한 가만히 따르다.
- DH2O의 약 50 mL에 펠 릿을 일시 중단 하 고, 5 분, 1000 x g에서 튜브 원심는 상쾌한 가만히 따르다. 부드럽게 주걱와 그것의 dispose 회색 상위 레이어를 다쳤어요. 위에 회색 레이어는 더 이상 때까지 반복 합니다.
- 건조는 샘플 진공 desiccator에서 하룻밤.
- 사용 될 때까지 4 ° C에서 건조 teliospores를 저장 합니다.
-
원하는 경우, 발 아를 유도 하기 전에 구리 황산 염8 teliospores을 취급 합니다. 치료 하지 않으면 다음 샘플 순수 teliospores 나타내고 박테리아 또는 다른 오염 없는 것인지 teliospores의 철저 한 현미경 분석을 수행 합니다.
- Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 teliospores의 대략 50 밀리 그램을 무게.
- 포함 하는 teliospores 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 0.75% CuSO4 의 약 1.0 mL를 추가 합니다. 위쪽 및 아래쪽 3 h에 대 한 샘플 교 반 이어서 CuSO4 솔루션에는 teliospores를 일시 중단 하는 플라스틱.
- 5 분 동안 2500 x g에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. Resuspend 살 균 물 teliospore 펠 릿, 원심 분리, 반복 하 고는 상쾌한 제거.
- 단계 2.21.3 두 번 더 반복 합니다.
3. teliospore 생존 능력 및 발 아 시험
- 그들의 생존 능력을 평가 하는 1.5 mL microcentrifuge 관에서 미국 maydis teliospores의 약 10 mg을 발 아의 타이밍 무게.
- Biosafety 내각에 스 황산 (160 µ g/mL)와 보충 감자 포도 당 국물 (PDB, 24 g/L)를 준비 합니다.
- PDB의 500 µ L에는 teliospores를 일시 중단 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 teliospores의 모든 덩어리 헤어 플라스틱.
- Teliospore 정지 압력가 250 mL 삼각 플라스 크는 PDB의 10 mL를 포함 전송.
- 28 ° c 12-16 h 90 rpm 동요 플라스 크를 품 어.
- Biosafety 내각에서 발 아 하 고 현미경 슬라이드를 준비 하도록 유도 하는 teliospores의 20 µ L 샘플을 제거 합니다.
-
존재 하는 발 아의 단계 및 세균 오염 물질의 존재를 평가 시각적으로 현미경을 사용 하 여.
- teliospores의 수를 계산 하는 hemocytometer를 사용 하 여 V를 통해 나의 단계와 출 아 했다가지고 % 결정.
- 경우에 단계 I teliospores는, teliospore 발 아를 평가 하기 전에 24 시간 총 플라스 크를 품 어 계속. 샘플을 실행 가능한 비 deeming 전에 최대 48 h에 대 한 보육을 계속 합니다.
- 세균성 오염 있으면 스 황산 (160 µ g/mL) 뿐만 아니라 대 황산 (50 µ g/mL)와 PDB를 보충 하 고 단계 3.1 3.7 반복. 세균 오염 계속 되 면 황산 구리와 teliospores를 치료 하 고 단계 3.1 3.7를 반복 합니다.
4입니다. 호흡 모니터링에 대 한 발 아의 유도
- 동일한 금액을 무게 (예., 50 mg) 각 호흡 실험에 대 한 teliospores의.
- Biosafety 내각에 압력가 호흡 약 실에 teliospores을 추가 합니다.
- 채우기 PDB (24 g/L)와 챔버 스 황산 (160 µ g/mL)과 대 (50 µ g/mL)와 보충.
- 아래로 teliospore 정지를 만드는 플라스틱.
- 공기가 꽉 인감을 만들려고 챔버 챔버 뚜껑을 놓습니다.
5. 산소 소비 속도 (OCR) 측정을 얻기
- 물 목욕 (28 ° C에 미리 데워) 내부 챔버 선반에 챔버를 놓습니다.
- O2 프로브는 챔버의 개통 안에 놓습니다.
- "SensorTrace 속도" 프로그램에 실시간으로에서 표시 하는 데이터 요소를 모니터링 하 고 프로브 (~ 3 분 후 프로브는 챔버에 배치 됩니다)을 안정화 하자.
- O2 수준을 지속적으로 6 h 2 s 간격 기록 측정 측정을 "측정"을 클릭 합니다.
- 측정을 중지 하 고 각 샘플 분석을 위해 단계 4.1-5.4 반복 합니다.
- 클릭 하 여 Microsoft Excel로 데이터를 내보내기 "파일 | 수출 | .Xls로 저장 "합니다.
6. 데이터 분석
-
OCR을 계산
- "Within_Rates" 탭에서 내보낸된 Excel 파일에서 각 챔버 측정 (nmol/h)에 대 한 "속도"를 기록 합니다.
- 각 실험 샘플에 대 한 수정 된 OCR 값을 얻기 위해 실험 시료 챔버의 "속도"에서 빈 챔버의 "속도"를 빼기 고이 숫자의 절대 값.
- Teliospores의 밀리 그램 당 총 OCR 대량 사용 하는 휴대 하 여 수정 된 절대 OCR 값을 나누어 계산 합니다.
- 평균 각 변형에 대 한 "teliospores의 밀리 그램 당 OCR" 값을 복제 합니다.
- 적절 한 통계적 방법을 사용 하 여 데이터를 분석 (예., 스튜던트 t-검정, 분산 분석) 다른 통계 소프트웨어의 Microsoft Excel을 사용 하 여.
- 원시 데이터를 그래프, 그래프 하고자 하는 각 시간 점에 대 한 남아 있는 산소의 비율을 계산. 자체에 나누어 첫 번째 읽기 (100% 산소 남은) 100을 곱하면, 다음 첫 번째 독서에 나누어 각 후속 읽기 그리고 산소 챔버에 남아 %를 100을 곱하십시오.
7. Teliospore 발 아 발 아의 다른 단계에서 Teliospores을 유도
- PDB (24 g/L) biosafety 캐비닛에 스 황산 (160 µ g/mL)와 보완을 준비 합니다.
- 1.5 mL microcentrifuge 관으로 미국 maydis teliospores의 약 10 mg을 놓습니다.
- PDB의 500 µ L에는 teliospores를 일시 중단 합니다. 부드럽게 혼합 매체에 teliospores의 아무 덩어리까지 피 펫.
- Teliospore 서 스 펜 션 스 황산으로 보충 하는 PDB를 포함 하는 압력가 250 mL 삼각 플라스 크에 전송.
- 90 rpm에서 떨고 28 ° C에서 하룻밤 플라스 크를 품 어.
8입니다. 페 트리 접시 및 Micromanipulator 준비
-
Microcapillary 준비 및 샘플 컬렉션에 대 한 방울의 pipetting 행 페 트리 접시 (57 c m2)를 준비 합니다.
- 페 트리 접시의 위쪽에 5 µ L (x 4) dH2O 방울 플라스틱.
- 샘플 컬렉션에 사용할 페 트리 접시에 RNA 안정화 솔루션의 2 µ L (x3) 플라스틱
- 페 트리 접시에 teliospores 출의 5 µ L (x 30) 물방울 플라스틱
- 페 트리 접시에 미네랄 오일 15 mL를 추가 합니다. 모든 방울 진행 하기 전에 기름에 의해 보호 됩니다 확인 하십시오.
- 15 µ m 내부 직경, 1 mm 플랜지, 55 m m 길이와 각도 20 ° 팁 microcapillary microcapillary 홀더에 그것을 배치 하 고 미네랄 오일에 모 세관 작용 광 유는 microcapillary를 입력 하면 그것을 물속으로 준비 합니다. 물 방울을 가져오기 전에 microcapillary에서 압력을 릴리스 합니다. 준비 물으로 microcapillary 발음.
9. 단계-특정 출 Teliospores의 격리
- micromanipulator의 컨트롤을 사용 하 여 이동 준비 microcapillary 발 아 방울 중 하나. 작은 물방울을 관통 하 고 microcapillary, 낮은 관심의 발 아 단계에서 germinating teliospore까지 microcapillary의 입을 가져다.
- 천천히 발음 germinating teliospore 캡처. 발음은 teliospore에서 microcapillary를 입력 했습니다 일단 중지 합니다. 약 5 teliospores는 microcapillary에 도착할 때까지 반복 합니다.
- micromanipulator와 microcapillary를 RNA 안정화 솔루션의 컬렉션 방울을가지고. 드롭릿에 관통 하 고는 작은 물방울에는 teliospores를 주입.
- 8.1 8.3 단계를 반복 하 여 약 1000 teliospores 체포 되었습니다.
10입니다. 컬렉션 물방울의 복구
- 컬렉션 물방울을 pipette 고는 RNase/DNase 무료 2.0 mL microcentrifuge 튜브의 뚜껑을 전송. 조심 스럽게 컬렉션 물방울을 방해 하지 않고 한 피 펫과 미네랄 오일 제거.
- teliospores를 사용 하 여 RNA 격리 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
우리는 휴면 teliospores 전시 호흡 (~ 1075 µ / h/mg) 출에 비해 낮은 수준 확인 teliospore 휴면 및 발 아 동안 호흡에 변화를 측정의 클라크-유형 microrespirometer 기반 방법을 사용 하 여, teliospores (~ 2,614 µ / h/mg; 그림 1A)입니다. 이 휴면 teliospores와 teliospores 발 아를 유도 하는 호흡의 평균 속도 ~2.4-fold 변화를 나타냅니다. 또한, 우리는 발 아를 유도 하는 teliospores 있는 ~ 45 분 지연 산소 통풍 관 (그림 1B)을 확인 했습니다. 이 뿐만 아니라 발 아의 유도 및 산소 측정의 시작 ~ 15 분 간격 ~ 30 분 지연 산소 통풍 관 (그림 1B)에 의해 표시 됩니다. 이 눈에 띄게 변화 germinating teliospores 분자 변화를 평가 하려면 시간 점을 나타냅니다.
발 아 동안 변경 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 발 아의 다섯 단계를 결정 했다. 발 아만 남아 휴면 teliospores 구별할 유도 발 아 대표 teliospores의 무대. 단계 II teliospores 신흥 promycelium는 teliospore의 직경 보다 작거나 길이 있다. 단계 III teliospores promycelia teliospore 직경 보다 큰 있다. 발 아의 단계 IV basidiospores promycelia에서 초기 신진 이며 무대 V 신진 나누어 결과 단일 basidiospores (그림 2). 우리가 개발한 서 기술을 사용 하 여, 우리는 성공적으로 고립 된 500 1000 출 teliospores RT-PCR 또는 RNA-Seq (표 1)에 대 한 RNA 격리 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한. 그림 3 의 서에 대 한 Petri dish와 서는 micromanipulator를 사용 하 여에 대 한 단계 일반적인 집합을 보여 줍니다.
그림 1: teliospore 발 아 중 산소 소비량의 시간 과정. 휴면 teliospores, 발 아를 유도 했다 고 산소 레벨 6 h 클라크-유형 microrespirometer을 사용 하 여 지속적으로 기록 되었다. 취소 유도 휴면 teliospores 컨트롤을 사용 하 고 모든 측정 빈 샘플으로 표준화 되었다. (A) 데이터 평균 OCR로 표현. (B) 원시 데이터 시간 과정 OCR에 변경의 탐지를 허용 하는 호흡 곡선을 꾸몄다. 발 아를 유도 teliospores 유엔 유도 휴면 teliospores 보다 2.4-fold 평균 속도로 산소 소비 (p < 0.01; 학생의 t-테스트). 돼지: 사후 감 응 작용 발 아의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: teliospore 발 아 단계. Teliospore 발 아의 V를 통해 나는 설명 하는 단계 (A-E). 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 기정 teliospores 출의 형태학 단계로 분리. 서에 대 한 Petri dish 및 teliospore 단계 III의 발 아에서 격리 하기 위한 단계를 일반 설정 설명 됩니다. (A) 페 트리 접시의 그림 방울 중 살 균 물, RNA 안정화 솔루션을 포함 하거나 teliospores 출 행으로 설정 합니다. 발 아 유도, 다음 teliospores 기정을 사용 하 여 발 아의 특정 단계에서 분리 했다. (B) 단계에서 teliospores을 발 아를 유도 포함 하는 발 아 물방울 III를 통해 나. (C) 준비 microcapillary 포부를 통해 컬렉션에 대 한 단계 III teliospore에 오게 됐다. (D)는 단계 III teliospore 유리 microcapillary에는 발 아 물방울에서 제거 하 고 컬렉션 물방울으로 이동. (E)는 microcapillary 컬렉션 물방울 포함 RNA 안정화 솔루션에 삽입 된 하 고 단계 III teliospore는 작은 물방울에 주입 했다. (F) RNA 안정화 솔루션에서 단계 III teliospores의 컬렉션입니다. 눈금 막대 = 20 µ m (A D, F)와 50 µ m (E). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 발 아 단계 | 수 출 teliospores 절연의 |
| 단계 I | 1000 |
| 단계 II | 500 |
| 단계 III | 650 |
표 1: 출 teliospores 성공적으로 각 발 아 단계는 표준 격리 실험에 대 한 격리 수. 테이블 설명 단계에 대 한 서를 사용 하 여 격리 된 teliospores의 평균 숫자 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 수집 전에 III를 통해 나.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
담 biotrophic 식물 병원 균을 일으킬 작물 손실에 수십억 달러의 매년. 이러한 병원 균의 대부분 곰 팡이 분산 및 유성 생식에 통합 되는 teliospores 생산. 개발의 지식과 teliospores의 발 아를 확보 하는 것이 이러한 곰 팡이로 인 한 치명적인 질병의 확산을 이해 중요 합니다. 주요 제어 지점에서 분자 변화를 파악 하기 위해 우리 생리 적 변화와 발 아의 다른 단계에서 teliospores을 다른의 타이밍을 식별 하는 방법을 고안 했다. 세토 외. 가벼운 현미경 검사 법 (그림 2)에 의해 발 아 teliospore의 (미 발표) 지적된 5 단계. 동안 생리 활성화를 조사 하기 위하여 단계 I 고 발 아 동안 호흡 속도 평가, 우리 사용 클라크-유형 microrespirometer 산소 소비량에서 변화를 정확 하 게 측정. 샘플 데이터는 우리의 방법은 정확 하 고 재현성 높은 나타냅니다. 우리의 연구 결과 미국 maydis 출 teliospores 전시 취소 유도 휴면 teliospores에 비해 세포 호흡에 급격 한 증가 확인 합니다. 처음으로, 우리는 발 아를 유도 미 maydis teliospores ~ 45 분 지연 산소 통풍 관에 전시 확인 했습니다. 이것은 미국 maydis teliospores 발 신호를 처리 하는 데 몇 시간이 필요할 수 있습니다 (예., 설탕의 존재), 전에 그 증가 산소 통풍 관은 발 신호에 대 한 매우 즉각적인 응답 중 또는 우리의 분석 결과 초기 산소에서 최소한의 변화를 검출 하기 위하여 충분히 과민 했다.
Smut teliospores의 호흡 속도 검토 하는 연구3 산소를 측정 하는 바르 부르 크 플라스 크 장치에 의존 하는 이전 수준의 manometrically5. 간단히,이 방법은 혈압 계 팔에 액체 레벨 변경의 직접 관찰을 통해 동봉 된 플라스 크에 압력에서 변화를 감지 하 여 산소 소비와 CO2 생산을 측정 합니다. 실험 수 설정, 그리고 측정 정확한 수 있습니다. 장치 측정의 기간 내내 참석 해야 하 고, 광범위 한 계산 OCR을 추정 하는 데 필요한. 우리의 프로토콜 기술 발전의 사용, 실험의 기간에 대 한 기구에 의해 유지 하는 사용자에 대 한 눈, 측정을 수행 하 고 광범위 한 수학 수식을 사용 하 여 필요 없는 게. 그러나 기타 초기 클라크-유형 respirometers Neurospora crassa9 와 Botryodpilodia theobromae10 포자의 측정 OCR 사용한,, 이러한 초기 악기 허용 최대 20 분 연속 측정. 이 제한 것가지고 수 없습니다 ~ 45 분 지연의 식별 최신 모델 respirometer와 함께 관찰 하는 산소 통풍 관에. 우리의 프로토콜이 했다 데이터 해석을, 간단 하 게 판독은 어떤 계산 이나 데이터 조작 없이 직접 그래프로 수 챔버에 남아 있는 산소의 농도. 또한, 그것은 연속 측정 가능 (매 2 s) 시간 사용할 수 있는 산소는 완전히 소진 될 때까지 무기한 금액에 대 한. 이 시간의 오랜 기간 동안 호흡에 작은 변화의 식별을 허용합니다. 따라서, 우리 이전 기술을 향상 하 고 곰 팡이 포자의 산소 소비를 측정 하, 정확 하 게, 간단 하 고 재현할 수 방법을 개발 했다. 우리의 지식을 하려면이를 사용 하 여 현대적인 클락 형 respirometer teliospores 검 댕 버섯의 출 대 휴면의 호흡 공부 첫 번째 연구 이다.
쉽고이 프로토콜의 단순에도 불구 하 고 최적화가 필요 하 고 생물 학적 현실 분석을 제한 하는 있다. 합리적인 OCRs 달성 하기 위해 첫 번째, 적절 한 샘플 크기를 식별 합니다. 너무 많은 샘플 조 산소 수준의 충돌 이어질 수 있으며 너무 작은 샘플 산소 소비에 의미 있는 변화를 관찰 하는 무 능력에서 발생할 수 있습니다. 둘째, 정확한 초기 데이터를 제공 (3 분)를 안정 시키기 위해 조사 시간을 허용 하는 것이 필수적 이다. 마지막으로, 그것은 항균 작용 발 아 매체를 보충 하는 것이 중요 (예., 스 황산) 세균 오염 OCR 판독을 변경 하지 않습니다 있도록. 우리가 직면 하는 생물학적 한계 측정, (~ 1%)으로 시각적인 형태학 상 변화를 관찰 하 여 결정의 시간에 걸쳐 낮은 발 아 비율을 했다. 포자 수 당 속도으로 변환 되도록이 율 결정 허용 포자의 생존 능력을 결정 하 고 높은 OCRs 이어질 것 이라고 teliospores의 발 아와 분리. 미국 maydis teliospores11 의 비동기 발 아에 대 한 설명 되어야 하 고 발 아 앞부분에서 산소 소비를 감지 하는 무 능력에 기여 할 수 있습니다 하는 현실 이다.
개선 하기 위해 정확도 정밀도의 teliospore 호흡 측정 변화, 미래 적응이이 메서드를 단일 셀 단위로 OCR을 측정을 포함할 수 있습니다. Micromanipulation 기술은 다음, 발 아를 유도 될 수 있다 그리고 그것의 호흡 속도 모니터링할 수 있는 단일 teliospore을 사용할 수 있습니다. 이 teliospore, 당 보다는 teliospores의 밀리 그램 당 휴면 발 교대 동안에 OCR에 대 한 정보를 제공 하는 해상도 향상 시킬 수 있습니다. 또한,이 비동기 발 아의 혼란 문제를 해결할 것 이다.
발 아의 나중의 단계에 대 한 우리는 발 아의 일반적인 단계에서 teliospores를 분리 하는 micromanipulation 방법을 개발 했다. 이 분석에 대 한 상대적으로 동기 teliospore 인구의 창조 허용. 단일 미생물 분리를 위한 다양 한 방법을 설명 되 고12년 동안에 향상 되었습니다. 이러한 방법은 단일 미생물, 자란, 및 기계적 방법 micromanipulators을 사용 하는 매체에 전송 되는 포자를 microcapillaries의 사용과 반 기계적인 방법의 얻을 포자 현 탁 액의 희석을 포함 . 우리는 발 아의 동일한 단계에서 teliospores를 사용 하는 이전 방법을 특히 원심 elutriation 등 특정 기 공 크기와 나일론 막 통해 출 teliospores 필터링. 그러나 우리가이 방법을 사용 하 여 teliospores 출에 대 한 풍부 하 게,, 우리의 샘플 여전히 포함 teliospores 발 아13의 다양 한 단계에서. 단일 미생물의 micromanipulation에 대 한 현재 기술 높은 배율 및 모 세관 바늘, 포부, 및 미생물의 전송의 정밀한 제어를 위한 계기의 소개와 함께 향상 되었습니다. 이전 micromanipulation 기술은 단일 세포 배양 또는 단일 셀 PCR 응용 프로그램14에 사용 하기 위해 격리에 집중 했다. 하나의 곰 팡이 포자를 분리 하는 micromanipulators 사용 하 여 이전 설립 하지 않았습니다. 하나의 곰 팡이 포자를 고립 시키기를 위한 이전 방법 좋은 집게 또는 출 아 포자15를 포함 하는 고체 매체의 작은 조각을 선택 하는 바늘의 사용을 참여. Micromanipulators의 사용과 micromanipulation은 ascospores의 클러스터 meiotic 유전자 분석16한 천 매체에 문화에서 분리 된 다음 포자 형성 될 수 있는 하는 효 모 연구에 널리 사용 됩니다. 세균성 세포14 micromanipulation 기법을 결합 하는 방법 및 출 teliospores를 고립 시키기를 위한 수정 방법을 생체 외에서 개발 했습니다. 우리는이 기법으로 일반적인 발 아 단계 teliospores의 수백을 얻을 수 있습니다 나타났습니다. 이러한 샘플 실시간 정량 Pcr과 같은 기술을 사용 하 여 다운스트림 식 연구에 사용할 수 있습니다 또는 RNA-이 발 아를 동기화 하는 teliospores의 인구를 얻는 동안 발생 하는 유전자 발현에서 특정 변화의 분석 허용 초기, 중간 및 저장 단계 teliospore 발 아의.
그러나 출 teliospores 특정 단계의 기정을 세트에서 경험 해야 하 고 발 아의 다른 단계를 인식,,이 경험을 통해 얻을 수 있습니다 신속 하 게 연습. 뒤에 RNA 격리 하는 성공적인 서 따라 해야 합니다 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 발 아 중 항생제로 보충 해야 합니다 (예., 스 황산) teliospores 출의 수집 하는 동안 뿐만 아니라 발 아 시작 되 면 세균 오염의 성장을 억제를. 둘째, 그것은 절연에 대 한 RNA를 안정화 안정화 솔루션을 사용 하는 것이 중요입니다. RNA 안정화 솔루션 또한 추가 teliospores를 수집 하는 동안 다음 발 아 단계로 진행에서 수집 된 teliospores를 방지 합니다. 셋째, 그것은 컬렉션 드롭릿 RNA 추출 되도록 복구 되었습니다 일단 광 유를 제거 하는 것이 중요입니다. 마지막으로, 우리가 나타났습니다 RNA 품질의 일부 손실 고립 된 teliospores; 시간의 연장된 기간에 대 한 RNA 안정화 솔루션에 저장 된 경우 따라서, RNA는 즉시 발 아 단계 특정 teliospores의 컬렉션 다음 격리 하는 것이 좋습니다. 방법의 한계는 무대 나 teliospores 수집 휴면, 죽은, 및이 3 개의 단계 형태학 상으로 구별 되지 않는 teliospores 발 아를 유도 하는 포함 될 수 있습니다. 또한, 단계 III teliospores를 수집 하는 때 감수 분열에서 teliospores의 혼합물 나 감수 분열 II 수 있습니다. 얻을 수 있습니다. 한 가지 방법은 진정으로 휴면 하 고 죽은 teliospores를 구별에 도움이 샘플의 생존 능력 결정 수 있습니다. 라이브/죽은 세포 생존 능력 분석 실험을 사용 하 여 곰 팡이 포자 생존 능력을 평가 하는 방법 가능한 teliospores는 더 유익한 발 아 율 결정된17수의 비율을 평가 하기 위해 수 있습니다. 또한, 핵 DAPI로 얼룩 예 수 사용할 단계 III와 단계 IV에 전환 하는 동안 발생 하는 추가 teliospores 단계 III에 형태학 상으로 성격을 나타내기 위하여 감수 분열의 이벤트 시각화 하. 우리의 서 메서드를 사용할 때이 것이 발 아의 한 단계에 있는 teliospores의 컬렉션에 도움이 됩니다.
결론적으로, Ustilago maydis teliospores의 휴면 발 아 변화 하는 동안 발생 하는 세포 호흡의 변화를 측정의 간단 하 고 정확 하 게 재현 방법을 개발 했습니다. 또한, RNA이 같은 다운스트림 응용 프로그램 사용할 수 있는 teliospores 출의 특정 단계를 수집 하는 방법을 개발 했습니다. 우리의 방법을 다양 한 세포 유형 및 종에 맞게 적용할 수 있습니다. 우리는 우리의 기술에 향상 호흡 변화 수준 뿐만 아니라 발 아의 나중 단계에서 발생 하는 이벤트를 정의 하는 추가 단일 포자의 탐지를 촉진 한다 예상.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌 공개할 수 있다.
Acknowledgments
우리는 그의 microrespirometer의 사용을 위한 닥터 폴 리와 니콜 바그너와 기술 지원에 대 한 알렉스 벨에 게 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 투자는 NSERC 그랜트 B.J.S.에 의해
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
- Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. Swan, A. , InTech. 411-460 (2012).
- Christensen, J. J. Monograph Number 2. , The American Phytopathological Society. Worcester, MA. (1963).
- Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
- Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
- Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
- Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).
- Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).
- Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
- Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).
- Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).
- Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).
- Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).
- Seto, A. M. Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , Trent University. M.Sc. thesis (2013).
- Fröhlich, J., König, H. Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. König, H., Varma, A. , Springer. 425-437 (2006).
- Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
- Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).
