Summary
Fungos causam muitas doenças agrícolas devastadores. Eles estão dispersos como teliospores latentes que germinam em resposta aos sinais ambientais. Nós esboçamos dois métodos para investigar mudanças moleculares durante a germinação: aumento da respiração para detectar ativação metabólica de medição e avaliar alterar eventos moleculares isolando teliospores em fases morfológicas distintas.
Abstract
Fungos são os agentes etiológicos de várias doenças agrícolas devastadores. Eles são caracterizados pela produção de teliospores, que são agentes de dispersão de paredes grossas. Teliospores podem permanecer dormentes por décadas. A dormência é caracterizada por baixas taxas metabólicas, pausado biossíntese macromolecular e reduzido os níveis de respiração. Ao receber sinais ambientais necessários, teliospores germinam para produzir células haploides, que podem iniciar novas rodadas de infecção. Germinação de teliospore caracteriza-se pela retomada de biossíntese macromolecular, aumento da respiração e dramáticas mudanças morfológicas. Para medir precisamente as alterações na respiração celular durante os estágios iniciais de germinação, nós desenvolvemos um protocolo simples, empregando um respirometer Clark-tipo. Os estagios de germinação são distinguidos por alterações morfológicas específicas, mas a germinação é assíncrona. Desenvolvemos uma técnica de microdissection que nos permitirá coletar teliospores em fases distintas de germinação.
Introduction
Os fungos (Ustilaginales) consistem em mais de 1.600 espécies que infectam de gramíneas, incluindo as importante cereais de milho, cevada e trigo, causando bilhões de dólares em perdas de safra anualmente1. Estes fungos são caracterizados pela produção de teliospores, que tem sombriamente pigmentado paredes celulares e são os agentes de dispersão. Teliospores a função de proteger o material genético durante o stress da dispersão entre plantas hospedeiras e pode persistir em um estado dormente por anos2. Como tal, teliospores são um componente essencial da propagação da doença.
A fim de estudar Biologia teliospore, nosso laboratório utiliza o fungo de obscenidade modelo Ustilago maydis (U. maydis), que é o agente causal da doença 'ferrugem comum do milho'. Maduras U. maydis teliospores caracterizam-se pela detenção de crescimento, metabolismo celular reduzido e baixos níveis de respiração celular3. Em condições ambientais favoráveis (ex., a presença de açúcares específicos), U. maydis teliospores germinar e completar basidiósporos meiose, produzindo que podem iniciar novas rodadas de infecção. Germinação é caracterizada por aumento da respiração, a atividade de retorno para metabólica e a progressão por etapas morfológicas observáveis de germinação4.
A fase inicial de germinação inclui aumento da respiração e função metabólica, no entanto, não há morfológicos indícios de mudança. As originais de alteração respiratória em U. maydis foram efectuadas medições mais de 50 anos atrás, medição do consumo de oxigênio manometrically com um balão de Warburg aparelho5. Nós desenvolvemos um método de estudar alterações precisas na respiração durante a germinação de teliospore pela medição do consumo de oxigênio durante um tempo de germinação, usando um microrespirometer de Clark-tipo novo, simples. Anteriormente, usamos este método para estudar alterações na frequência respiratória entre o selvagem-tipo U. maydis células haploides e mutantes com mitocôndrias defeituosas6e adaptaram o protocolo aqui para estudar alterações na respiração teliospore durante germinação. Isso fornece um meio de identificar com precisão o momento da mudança de respiração para que nós pode direcionar teliospores no momento oportuno, após o início da germinação para investigar eventos moleculares precoce. A progressão de germinação pode ser seguida ao microscópio uma vez que o promycelia emerge o teliospore, mas a natureza assíncrona inibiu o isolamento de bastante teliospores em uma determinada fase para investigação. Desenvolvemos uma técnica de microdissection similar àqueles usados para fertilização in vitro para coletar fisicamente teliospores em distintas fases morfológicas da germinação.
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Protocol
1. infecção de espiga de milho
- Crescer Zea mays (CV. Golden Bantam) até que as espigas são formadas e começaram a seda (aproximadamente 60 dias).
- Cultura haploides compatíveis U. maydis cepas usando protocolos padrão como anteriormente descrito7.
- Infectar as espigas de milho usando protocolos padrão, como descrito anteriormente,7.
2. teliospore colheita
- Equipamento de autoclave (funil de Büchner, frascos de Büchner, liquidificadores, garrafas de 250 mL centrífuga, espátulas planas e água) usando um padrão seco ciclo com pelo menos 30 min esterilização a 121 ° C (ciclo líquido padrão para água).
- Remova infectadas espigas de plantas (aproximadamente infecção de postagem de 28-35 dias) usando uma navalha e coloque as espigas em uma bandeja coberta de protetor de banco.
- Remover os tumores de espigas com uma lâmina de barbear e recolher num copo.
- Encher um copo de liquidificador de laboratório de 250 mL com tumores até aproximadamente 1/3 completo e adicionar autoclavado dH2O até o copo do liquidificador é de aproximadamente 3/4 completo. Perturbar os tumores por pulsando o misturador no ponto baixo, até homogeneizado.
- Conecte a bomba de vácuo para uma armadilha de água e em seguida para um balão de Büchner de 1 L.
- Inserir o balão grande funil de Büchner e forre o fundo do funil de Büchner com quatro camadas de gaze.
- Ligue a bomba de vácuo.
- Despeje uma porção dos tumores homogeneizadas através da gaze de algodão e raspar com uma espátula.
- Despeje algumas dH2O pano a fim de liberar os teliospores através de.
- Repita até o dH2O passando a gaze é claro.
- Torça o pano contendo o material homogeneizado tumor no filtro para garantir a recuperação máxima teliospore.
- Quando o balão de Büchner 1L está ficando perto de cheio, esvazie-a em um Erlenmeyer de grande e reserve.
- Colocar um novo pedaço de gaze no filtro e repita os passos (2.7-2.12) até que todos os tumores foram interrompidos e filtrados.
- Despeje os teliospores filtradas em frascos de 250ml autoclavado centrífuga e centrifugar a 1.000 x g por 5 min e decante o sobrenadante.
- Repita a etapa 2.14 até todos os teliospores filtrados são peletizados por centrifugação.
- Suspenda as bolinhas em uma pequena quantidade de água e transferir para tubos de centrífuga de 50 mL.
- Centrifugar os tubos a 1.000 x g por 5 min e decante o sobrenadante.
- Suspender o pellet em aproximadamente 50 mL de dH2O, centrifugar os tubos a 1.000 x g por 5 min e decante o sobrenadante. Delicadamente raspe a camada superior cinza com uma espátula e deposite. Repita até que já não há uma camada de cinza por cima.
- Seca as amostras durante a noite num exsicador de vácuo.
- Loja teliospores secas a 4 ° C até o uso.
-
Se desejado, trate as teliospores com sulfato de cobre8 antes de induzir a germinar. Se não for tratada, em seguida, execute minuciosa análise microscópica dos teliospores para confirmar a amostra representa teliospores puras e é desprovida de bactérias ou outras contaminações.
- Pese cerca de 50 mg de teliospores em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
- Adicione cerca de 1,0 mL de 0,75% CuSO4 para o tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo os teliospores. Pipete para cima e para baixo suspender os teliospores da solução de CuSO4 seguido de agitar a amostra durante 3 h.
- Centrifugar a amostra a 2.500 x g por 5 min e retire o sobrenadante. Resuspenda o pellet de teliospore com água estéril, repetir a centrifugação e remover o sobrenadante.
- Repita a etapa 2.21.3 mais duas vezes.
3. teliospore viabilidade e teste de germinação
- Pese cerca de 10 mg de teliospores U. maydis em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para avaliar sua viabilidade e o tempo de germinação.
- Em uma armário de biossegurança, prepare batata dextrose caldo de carne (PDB, 24 g/L) suplementado com sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL).
- Suspenda os teliospores em 500 µ l do PDB. Delicadamente, pipete para misturar e quebrar todos os grupos de teliospores.
- Transferi a suspensão de teliospore para um esterilizada 250ml balão de Erlenmeyer contendo 10 mL de APO.
- Incube o frasco a 28 ° C, agitando a 90 rpm para 12-16 h.
- Em uma armário de biossegurança, retire uma amostra de 20 µ l dos teliospores induzido a germinar e preparar uma lâmina de microscópio.
-
Usando um microscópio, visualmente avalie estágios de germinação que estão presentes e a presença de contaminação bacteriana.
- Contar o número de teliospores em encena através de V usando um hemocytometer e determinar a porcentagem que tem germinado.
- Se única fase I teliospores estão presentes, continuar a incubar o frasco para um total de 24 h antes de avaliar a germinação de teliospore. Continue a incubação por um período máximo de 48 h antes de considerar a amostra inviáveis.
- Se houver contaminação bacteriana, completar o PDB com sulfato de canamicina (50 µ g/mL) bem como sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL) e em seguida, repita as etapas de 3.1 a 3.7. Se persistir de contaminação bacteriana, tratar teliospores com sulfato de cobre e repita as etapas de 3.1 a 3.7.
4. indução da germinação para monitorização da respiração
- Pesar a quantidade igual (ex., 50 mg) de teliospores para cada experiência de respiração.
- Em uma armário de biossegurança, adicione teliospores para uma câmara de respiração autoclavados.
- Encher a câmara com PDB (24 g/L) suplementado com sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL) e sulfato de canamicina (50 µ g/mL).
- Pipete para cima e para baixo para criar uma suspensão de teliospore.
- Coloque a tampa de câmara na câmara para criar vedação hermética.
5. obtenção de medições de taxa (OCR) de consumo de oxigênio
- Coloque a câmara no rack câmara dentro de um banho de água (pré-aquecido a 28 ° C).
- Coloque a sonda de2 O dentro da abertura da câmara.
- Monitorar os pontos de dados em tempo real sobre o programa de "Taxa de SensorTrace" e deixar a sonda estabilizar (~ 3 min depois a sonda é colocada na câmara).
- Clique em "Medida" para medir os níveis de2 O continuamente por 6 h com medições gravadas em intervalos de 2 s.
- Parar a medição e repita etapas 4.1 – 5.4 para cada amostra a ser analisada.
- Exportar os dados para o Microsoft Excel, clicando em "arquivo | Exportação | Salve como. xls".
6. análise de dados
-
Calcular o OCR
- No arquivo Excel exportado sob a aba "Within_Rates", grave a "taxa" para cada medição de câmara (nmol/h).
- Para cada amostra experimental, subtrair a "taxa" da câmara em branco da "Taxa" da câmara de amostra experimental para obter um valor corrigido do OCR e o valor absoluto desse número.
- Calcule o total OCR por mg de teliospores, dividindo o valor corrigido de OCR absoluto pelo celular usado em massa.
- Média replicar valores "OCR por mg de teliospores" para todas as estirpes.
- Analisar os dados usando o método estatístico apropriado (por exemplo., t do estudante-teste, análise de variância) usando o Microsoft Excel de outros softwares estatísticos.
- Para o gráfico de dados brutos, calcular a porcentagem de oxigênio restante para cada ponto de tempo que você deseja gráfico. Dividir a primeira leitura por si só e multiplique por 100 (100% de oxigênio restante), depois dividir cada leitura subsequente pela primeira leitura e multiplicar por 100 para obter a porcentagem de oxigênio restante na câmara.
7. indução da germinação de Teliospore para isolar Teliospores em distintas fases de germinação
- Prepare o PDB (24 g/L) suplementado com sulfato de estreptomicina (160 µ g/mL) em um armário de biossegurança.
- Coloque aproximadamente 10 mg de teliospores U. maydis em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
- Suspenda os teliospores em 500 µ l do PDB. Suavemente a pipeta para misturar até que haja sem grumos de teliospores no meio.
- Transferi a suspensão de teliospore para um Erlenmeyer de 250ml esterilizado contendo PDB suplementado com sulfato de estreptomicina.
- Incube o frasco durante a noite a 28 ° C, agitando a 90 rpm.
8. preparação da placa de Petri e micromanipulador
-
Prepare um prato de Petri (57 cm2) por linhas de pipetagem de gotículas para preparação da conta e coleta de amostra.
- Pipete 5 gotas de2O de dH µ l (x 4) na parte superior da caixa de Petri.
- Pipete 2 µ l (x3) de solução de estabilização de RNA sobre o prato de Petri deve ser usado para coleta de amostra.
- Pipete 5 µ l (x 30) as gotas de germinação teliospores sobre o prato de Petri.
- Adicione 15 mL de óleo mineral para o prato de petri. Certifique-se de que todas as gotas estão cobertas pelo óleo antes de prosseguir.
- Prepare uma conta com um 15 µm de diâmetro interno, flange de 1 mm, 55 mm de comprimento e um ângulo de ponta de 20°, colocando-o no suporte de conta e submergindo no óleo mineral onde ação capilar permitirá que o óleo mineral entrar a conta. Libera a pressão na conta antes de trazê-lo para a gota de água. Aspirado para preparar a conta de água.
9. isolamento de estágio específico germinação Teliospores
- Usando os controles do micromanipulador, mova a conta preparada para dentre as gotas de germinação. Penetrar o droplet, reduzir a conta e trazer a boca da conta até um teliospore de germinação na fase de germinação de interesse.
- Lentamente, Aspire para capturar o teliospore de germinação. Pare por aspiração, uma vez que o teliospore entrou a conta. Repita até há cerca de cinco teliospores na conta.
- Criar a conta com o micromanipulador e trazê-lo para a gota de coleção de solução de estabilização de RNA. Penetrar a gota e injetar os teliospores da gota.
- Repita as etapas de 8.1 a 8.3 até aproximadamente 1.000 teliospores foram capturados.
10. recuperação de coleção da gota
- Pipetar acima da gota de coleção e transferi-lo para a tampa de um tubo de microcentrifugadora de 2,0 mL RNase/DNase-livre. Remova cuidadosamente o óleo mineral com uma pipeta sem perturbar o droplet de coleção.
- Use os teliospores para aplicações a jusante, tais como a isolação do RNA.
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Representative Results
Usando o método de Clark-tipo com base em microrespirometer de medir as mudanças na respiração durante a dormência teliospore e germinação, Confirmámos que dormente teliospores apresentam um baixo nível de respiração (~ 1.075 µmol/h/mg), comparado a germinação teliospores (~ 2.614 µmol/h/mg; Figura 1A). Isto representa uma mudança de ~2.4-fold em média taxa de respiração entre dormentes teliospores e teliospores que têm sido induzidos a germinar. Além disso, nós identificamos que teliospores que tem sido induzidos a germinar têm um atraso de ~ 45 min na captação de oxigênio (figura 1B). Isto é indicado pelo atraso de ~ 30 min na captação de oxigênio (figura 1B), além do atraso de ~ 15 min entre a indução da germinação e início das medições de oxigênio. Isto identifica um ponto de tempo para começar a avaliar alterações moleculares em teliospores a germinação que visivelmente não estão mudando.
Alterações subsequentes durante a germinação podem ser observadas microscopicamente. Cinco estágios de germinação foram determinados. Fase I de germinação representa teliospores que tem sido induzidos a germinar, mas permanecem indistinguível de teliospores dormentes. Teliospores de estágio II tem um promycelium com um comprimento que é menor ou igual ao diâmetro do teliospore emergente. Teliospores de fase III tem promycelia que são maiores que o diâmetro do teliospore. Fase IV da germinação é a brotação inicial de basidiósporos do promycelia, e fase V são os basidiósporos haploides resultantes que dividem-se por gemulação (Figura 2). Usando a técnica de microdissection que desenvolvemos, com sucesso isolamos teliospores germinação de 500 a 1.000 para aplicações a jusante, tais como a isolação do RNA por RT-PCR ou RNA-Seq (tabela 1). A Figura 3 mostra o conjunto geral do Petri dish para microdissection e as etapas para microdissection usando um micromanipulador.
Figura 1: evolução temporal do consumo de oxigênio durante a germinação de teliospore. Teliospores dormentes foram induzidas a germinar, e os níveis de oxigênio foram registrados continuamente para 6 h, usando um microrespirometer de Clark-tipo. Un-induzidas teliospores dormentes foram usados como um controle, e todas as medições foram normalizadas para uma amostra em branco. (A) dados representados como OCR média. (B) dados brutos conspirou para obter curvas de respiração, permitindo a detecção de alterações em OCR no decurso do tempo. Teliospores que tem sido induzidos a germinar consomem oxigênio a uma taxa média 2.4-fold mais rápido do que teliospores un-induzidas de dormentes (p < 0,01; T do estudante-teste). PORCO: pós-indução da germinação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: estágios de germinação teliospore. Estágios I V da germinação de teliospore são ilustradas (A–E). Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Microdissection isolar estágios morfológicos distintos de germinação teliospores. O conjunto geral acima de um Petri dish para microdissection e as etapas para isolar o teliospore fase III da germinação são ilustrados. (A) ilustração de uma placa de Petri configurar com linhas de gotículas contendo ou água estéril, solução de estabilização de RNA, ou teliospores de germinação. Após a indução da germinação, teliospores foram isoladas em estágios específicos de germinação usando microdissection. (B) contendo uma gota de germinação induzido a germinar teliospores nas fases eu através de III. (C) uma conta preparada fui educada para um teliospore de fase III para coleção através de aspiração. (D) teliospore o estágio III em uma conta de vidro é retirado da gota de germinação e mudou-se para uma gotícula de coleção. (E) a conta foi inserido na solução de estabilização de coleção gotículas contendo RNA e teliospore a fase III foi injetado o droplet. (F) uma coleção de teliospores de fase III na solução de estabilização de RNA. Barra de escala = 20 µm (A-D, F) e 50 µm (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Fase de germinação | Número de germinação teliospores isolado |
| Fase I | 1.000 |
| Fase II | 500 |
| Fase III | 650 |
Tabela 1: número de germinação teliospores com sucesso isolado para cada fase de germinação em um experimento de isolamento padrão. A tabela ilustra os números médios das teliospores que foram isoladas usando microdissection para estágios eu através de III antes da coleta para aplicações a jusante.
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Discussion
Patógenos de vegetais basidiomiceto biotrófica causam bilhões de dólares em perdas de safra anualmente. A grande maioria desses patógenos produzem teliospores que são parte integrantes de fungo dispersão e reprodução sexual. Ganhar o conhecimento do desenvolvimento e germinação de teliospores é fundamental para entender a propagação das doenças devastadoras causadas por estes fungos. A fim de identificar alterações moleculares em pontos chave controle criámos um método para identificar o momento de mudanças fisiológicas e outra para isolar teliospores em fases distintas da germinação. Seto et al (não publicados) observou cinco estágios de germinação teliospore por microscopia de luz (Figura 2). A fim de investigar a ativação fisiológica durante a fase I e para avaliar a taxa de respiração durante a germinação, usamos um Clark-tipo microrespirometer para medir precisamente a mudanças no consumo de oxigênio. Nossos dados de amostra indicam que nosso método é preciso e altamente reprodutíveis. Nossos resultados confirmam que germina U. maydis teliospores apresentam um aumento drástico na respiração celular, em comparação com teliospores dormentes un-induzidos. Pela primeira vez, nós identificamos que U. maydis teliospores que tem sido induzidos a germinar apresentam um atraso ~ 45 min na captação de oxigênio. Isto sugere que o teliospores U. maydis podem exigir algum tempo para processar sinais de germinação (ex., a presença de açúcares) antes de responder, não é o consumo de oxigênio aumentado entre as respostas muito imediatas para sinais de germinação ou que nosso ensaio não foi suficientemente sensível para detectar a mínima alteração na captação de oxigênio inicial.
Anterior, estudos examinando taxas de respiração de teliospores de carvão3 dependia de um aparelho de balão de Warburg para medir oxigênio níveis manometrically5. Brevemente, este método mede CO2 produção e consumo de oxigênio, através da detecção de alterações na pressão em um frasco fechado através da observação direta das mudanças de nível fluidas no braço manómetro. Os experimentos podem ser difíceis de configurar, e as medições podem ser imprecisas. Os aparelhos devem ser atendidos durante todo o período de medição e cálculos extensos são necessários para estimar o OCR. Nosso protocolo faz uso dos avanços tecnológicos, eliminando a exigência para o usuário permanecem pelo aparato para a duração do experimento, tomar medidas a olho nu e usar fórmulas matemáticas extensas. Outros autores utilizaram cedo respirometers Clark-tipo de medida OCR de Neurospora crassa9 e Botryodpilodia theobromae10 esporos, no entanto, estes instrumentos início permitido medições contínuas para um máximo de 20 min. Essa limitação não teria permitido a identificação do atraso ~ 45 min na captação de oxigênio, que observamos com o mais recente respirometer de modelo. Nosso protocolo fez interpretação de dados mais simples, como a leitura é a concentração de oxigênio restante na câmara, que pode diretamente ser graficamente sem qualquer manipulação de dados ou cálculos. Além disso, é possível tirar medições contínuas (cada 2 s) com um montante indefinido de tempo até o oxigênio disponível é esgotado completamente. Isto permite a identificação de pequenas mudanças na respiração durante um longo período de tempo. Portanto, temos melhorado técnicas anteriores e desenvolveu um método simples, preciso e reprodutível para medir o consumo de oxigênio de esporos fúngicos. A nosso conhecimento, este é o primeiro estudo usar um moderno respirometer Clark-tipo para estudar a respiração dos dormentes contra germinando teliospores de fungos.
Apesar da facilidade e simplicidade do presente protocolo, otimização é obrigatório e existem realidades biológicas que limitou a análise. Tamanhos de amostra primeiro, o caso devem ser identificados para alcançar OCRs razoáveis. Muito amostra pode levar a queda prematura dos níveis de oxigênio, e muito pouco da amostra pode resultar na incapacidade de observar alterações significativas no consumo de oxigênio. Em segundo lugar, é imperativo para permitir que o tempo de sonda para estabilizar (~ 3 min) para fornecer dados precisos de iniciais. Por último, é importante para completar o médio de germinação com agentes antibacterianos (ex., sulfato de estreptomicina) para assegurar-se de contaminação bacteriana não altera as leituras de OCR. As limitações biológicas que enfrentamos foram uma taxa de germinação baixa ao longo do tempo de medição, (~ 1%), conforme determinado pela observação visuais mudanças morfológicas. Determinar a viabilidade dos esporos permitiria essa determinação da taxa a ser convertido em uma taxa por número de esporos e isolar teliospores com maiores taxas de germinação levaria a maiores OCRs. A germinação assíncrona de U. maydis teliospores11 é uma realidade que deve ser contabilizada e pode ter contribuído para uma incapacidade para detectar o consumo de oxigênio no início de germinação.
Para melhorar a exatidão e a precisão da medição de alterações na respiração teliospore, futuras adaptações para este método podem incluir medição de OCR em uma única célula-base. Técnicas de micromanipulação poderiam ser usadas para isolar um único teliospore, que pode então ser induzida a germinar e sua taxa de respiração podem ser monitorado. Isso poderia melhorar a resolução, fornecendo informações sobre o OCR durante o turno de germinação-dormência por teliospore, e não por mg de teliospores. Além disso, isso resolveria a questão confundimento de germinação assíncrona.
Para fases posteriores da germinação, nós desenvolveu um método de micromanipulação para isolar teliospores em fases comuns da germinação. Isto permitiu a criação de populações relativamente síncrono teliospore para análise. Diversos métodos para isolar o único microrganismos têm sido descritos e tem sido melhorados ao longo de12anos. Estes métodos incluem a diluição de suspensões de esporos para obter único microorganismos, métodos semi mecânicos com o uso de microcapilares para obter os esporos que são transferidos para meio para métodos de cultivo e mecânicos que utilizam Micromanipuladores . Métodos anteriores que usamos para obter teliospores na mesma fase de germinação incluem centrífugas elutriation contracorrente e filtragem de germinação teliospores através de uma membrana de nylon com um tamanho de poro específico. Usando estes métodos nos permitiu enriquecer para germinação teliospores, no entanto, nossas amostras ainda continham teliospores em vários estágios de germinação13. Tecnologia atual para micromanipulação de microorganismos único tem melhorado com a introdução de maior ampliação e instrumentos para controle fino de agulhas capilares, aspiração e transferência de microorganismos. Técnicas de micromanipulação anteriores focalizaram-se em isolar células únicas para cultivo ou para uso em uma única célula PCR aplicações14. O uso de Micromanipuladores para isolar os esporos de fungos único anteriormente não foi estabelecido. Um método anterior para isolar os esporos de fungos único envolvia o uso de fórceps bem ou agulhas para pegar pequenos pedaços de meio sólido contendo a germinação de esporos de15. Micromanipulação com o uso de Micromanipuladores é amplamente utilizada em estudos de fermento onde clusters de ascósporos podem ser separada esporulação seguir em cultura em ágar-ágar para análise genética meiótica16. Nós desenvolvemos um método que combina a técnica de micromanipulação para células bacterianas14 e em vitro métodos de fertilização para isolar teliospores de germinação. Mostramos que centenas de comum teliospores de fase de germinação podem ser obtidas com esta técnica. Estas amostras podem ser usadas para estudos de expressão a jusante, usando técnicas tais como RT-qPCR ou RNA-Seq. obtenção de uma população de teliospores em que a germinação é sincronizada permite a análise de alterações específicas na expressão do gene que ocorre durante a mais cedo, meados e posteriores fases da germinação de teliospore.
Microdissection da fase específica de germinação teliospores pode exigir experiência em conjunto acima e reconhecendo as diferentes fases de germinação, no entanto, esta experiência pode ser obtida rapidamente através da prática. Há várias etapas que devem ser seguidas para o sucesso microdissection seguido pelo isolamento de RNA. Primeiro, a média de germinação deve ser suplementada com antibióticos (ex., sulfato de estreptomicina) para suprimir o crescimento de contaminação bacteriana quando é iniciada a germinação, bem como durante a coleta de teliospores de germinação. Em segundo lugar, é importante usar uma solução de estabilização para estabilizar e proteger o RNA para isolamento. A solução de estabilização de RNA também impede que teliospores coletados progredindo para a próxima fase de germinação, enquanto a recolha de teliospores adicionais. Em terceiro lugar, é importante remover o óleo mineral, uma vez que a gota de coleção foi recuperada para garantir sucesso extração de RNA. Por último, notamos alguma perda de qualidade de RNA se teliospores isoladas são armazenados em solução de estabilização de RNA por um período prolongado de tempo; Portanto, é recomendável que o RNA é isolado imediatamente após a coleta de teliospores específico de germinação fase. Uma limitação do método é que o palco eu teliospores coletados poderiam conter dormente, morto e induzido para germinar teliospores como esses três estágios são morfologicamente indistinguíveis. Além disso, quando a coleta de teliospores de fase III, uma mistura de teliospores na meiose I ou meiose II poderia ser obtido. Uma forma de auxiliar na distinção entre teliospores verdadeiramente dormentes e mortos poderia ser determinar a viabilidade da amostra. Um método para avaliar a viabilidade do esporo do fungo, utilizando ensaios de viabilidade celular vivo/morto pode ser capaz de avaliar a percentagem de teliospores viáveis do que taxas de germinação mais informativas poderiam ser determinado17. Além disso, núcleo de coloração com DAPI, por exemplo, poderia ser usado para visualizar os eventos da meiose que estão ocorrendo durante a fase III e a transição para a fase IV para caracterizar ainda mais teliospores morfologicamente no estágio III. Isso ajuda na coleção de teliospores em apenas uma etapa de germinação quando usando nosso método microdissection.
Em conclusão, temos desenvolvido um método simples, preciso e reprodutível de medir as mudanças na respiração celular que ocorrem durante o turno de germinação-dormência de Ustilago maydis teliospores. Além disso, temos desenvolvido um método para coletar as fases específicas de germinação teliospores que poderiam ser usados para aplicações a jusante, tais como o RNA-Seq Nossos métodos podem ser adaptados para acomodar vários tipos de células e espécies. Nós antecipamos que melhorias para nossas técnicas irão facilitar a detecção de alterações respiratórias em um único esporo nível, bem como mais definindo os eventos que estão ocorrendo nas fases posteriores de germinação.
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Disclosures
Os autores têm sem concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Paul Frost para uso de seu microrespirometer e Nicole Wagner e Alex Bell para assistência técnica. Este trabalho foi financiado por uma bolsa NSERC para B.J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
- Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. Swan, A. , InTech. 411-460 (2012).
- Christensen, J. J. Monograph Number 2. , The American Phytopathological Society. Worcester, MA. (1963).
- Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
- Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
- Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
- Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).
- Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).
- Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
- Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).
- Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).
- Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).
- Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).
- Seto, A. M. Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , Trent University. M.Sc. thesis (2013).
- Fröhlich, J., König, H. Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. König, H., Varma, A. , Springer. 425-437 (2006).
- Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
- Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).
