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Biology

Germinación de esta investigadora mediante el análisis de Microrespiration y microdisección

doi: 10.3791/57628 Published: May 13, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Smut hongos causan muchas enfermedades agrícolas devastadoras. Se dispersan como teliosporas latentes que germinan en respuesta a señales ambientales. Describiremos dos métodos para investigar cambios moleculares durante la germinación: aumento de la respiración para detectar la activación metabólica de medición y evaluación cambiar acontecimientos moleculares aislando teliosporas en etapas morfológicas distintas.

Abstract

Smut hongos son los agentes etiológicos de diversas enfermedades agrícolas devastadoras. Se caracterizan por la producción de teliosporas, que son agentes de dispersión de paredes gruesas. Teliosporas pueden permanecer latentes durante décadas. La latencia se caracteriza por bajas tasas metabólicas, biosíntesis macromolecular en pausa y reduce los niveles de respiración. Sobre la recepción de señales ambientales requiere, teliosporas germinan para producir células haploides, que pueden iniciar nuevas rondas de la infección. Germinación de la Teliospora se caracteriza por la reanudación de la biosíntesis macromolecular, respiración creciente y dramáticos cambios morfológicos. Para medir con precisión cambios en la respiración celular en las primeras etapas de la germinación, hemos desarrollado un protocolo simple que emplea un respirómetro tipo Clark. Las últimas etapas de la germinación se distinguen por cambios morfológicos específicos, pero la germinación es asincrónica. Hemos desarrollado una técnica de microdisección que nos permite recoger teliosporas en etapas distintas de la germinación.

Introduction

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Los hongos de carbones (Ustilaginales) consisten en más de 1.600 especies que infectan gramíneas incluyendo los cereales importantes de maíz, cebada y trigo, causando miles de millones de dólares en pérdidas en los cultivos anuales1. Estos hongos se caracterizan por la producción de teliosporas, que han pigmentado oscuro las paredes celulares y son los agentes de dispersión. Teliosporas función para proteger el material genético durante las tensiones de la dispersión entre plantas hospederas y pueden persistir en estado latente por años2. Como tal, teliosporas son un componente esencial de la extensión de la enfermedad.

Para estudiar la biología de esta, nuestro laboratorio utiliza el hongo modelo de smut Ustilago maydis (U. maydis), que es el agente causal de la enfermedad 'carbón común del maíz'. Madura U. maydis teliosporas se caracterizan por detención del crecimiento, metabolismo celular reducida y bajos niveles de respiración celular3. En condiciones ambientales favorables (por ej., la presencia de azúcares específicos), U. maydis teliosporas germinan y completar basidiosporas de meiosis, produciendo que pueden iniciar nuevas rondas de la infección. Germinación se caracteriza por respiración creciente, la actividad volver a metabólico y la progresión a través de etapas morfológicas observables de germinación4.

La etapa inicial de germinación incluye aumento de la respiración y la función metabólica, sin embargo, hay no hay indicaciones morfológicas de cambio. Las medidas originales del cambio respiratoria en U. maydis se llevaron a cabo más de 50 años, medir el consumo de oxígeno manometrically con un frasco de Warburg aparato5. Hemos desarrollado un método nuevo, simple de estudiar cambios precisos en la respiración durante la germinación de la Teliospora midiendo el consumo de oxígeno durante un tiempo de germinación utilizando un microrespirometer de tipo Clark. Anteriormente utilizamos este método para estudiar cambios en la frecuencia respiratoria entre el tipo salvaje células haploides de U. maydis y mutantes con mitocondrias defectuosas6y han adaptado el protocolo aquí para estudiar cambios en la respiración de esta durante germinación. Esto proporciona un medio de identificar con precisión el momento del cambio de la respiración por lo que podemos apuntar teliosporas en el momento apropiado después de la iniciación de la germinación para investigar los eventos moleculares tempranos. La progresión de la germinación puede ser seguida microscópicamente una vez el promycelia sale de la Teliospora, pero la naturaleza asíncrona inhibió el aislamiento de suficiente teliosporas en una etapa determinada de investigación. Hemos desarrollado una técnica de microdisección similar a los utilizados para la fertilización in vitro para recoger físicamente teliosporas en distintas etapas morfológicas de la germinación.

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Protocol

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1. maíz mazorca infección

  1. Zea mays (CV. gallo de oro) de crecer hasta que las mazorcas están formadas y han comenzado a seda (aproximadamente 60 días).
  2. Cultivo de haploides compatibles U. maydis cepas utilizando protocolos estándar como se ha describen7.
  3. Infectar las mazorcas de maíz usando protocolos estándar como se describió anteriormente7.

2. esta cosecha

  1. Equipo de autoclave (embudos Büchner, frascos de Büchner, licuadoras, botellas de centrífuga de 250 mL, espátulas planas y agua) utilizando un estándar seco ciclo con al menos 30 min esterilización a 121 ° C (ciclo líquido estándar para el agua).
  2. Eliminar las mazorcas infectadas de las plantas (aproximadamente post infección de 28 a 35 días) utilizando una maquinilla de afeitar y las mazorcas en una bandeja cubierta de protector de banco.
  3. Quitar los tumores de las mazorcas con una cuchilla de afeitar y recoger en un vaso de precipitados.
  4. Llene un vaso de licuadora de laboratorio de 250 mL con tumores hasta aproximadamente 1/3 por completo y añadir autoclave dH2O hasta que la taza de la licuadora es aproximadamente 3/4 completo. Interrumpir los tumores por pulsación la batidora en mínimo, hasta homogeneizada.
  5. Conecte la bomba de vacío a una trampa de agua y luego a un frasco de Büchner 1 L.
  6. Inserte el embudo de Büchner grande en el matraz y forre el fondo del embudo Büchner con cuatro capas de Gasa.
  7. Encienda la bomba de vacío.
  8. Vierta una porción de los tumores homogeneizadas a través de la estopilla y raspar con una espátula.
  9. Verter algunos dH2O en la estopilla para eliminar las teliosporas a través.
  10. Repetir hasta el dH2O a través de la estopilla está claro.
  11. Escurra la estopilla que contiene el material homogeneizado tumor en el filtro para garantizar la recuperación de esta máxima.
  12. Cuando el frasco de Büchner 1 L está cerca completo, vaciar en un matraz de Erlenmeyer grande y póngala a un lado.
  13. Poner un nuevo trozo de cañamazo en el filtro y repetir los pasos (2.7 – 2.12) hasta que todos los tumores se han interrumpido y filtrado.
  14. Vierta las teliosporas filtrados en botellas de centrífuga esterilizado 250 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos y decantar el sobrenadante.
  15. Repita paso 2.14 hasta todas las teliosporas filtradas son peleteados por centrifugación.
  16. Suspender las pastillas en una pequeña cantidad de agua y transferir a tubos de centrífuga de 50 mL.
  17. Centrifugar los tubos a 1.000 x g durante 5 minutos y decantar el sobrenadante.
  18. Suspender el pellet en aproximadamente 50 mL de dH2O centrifugar los tubos a 1.000 x g durante 5 minutos y decantar el sobrenadante. Raspe suavemente la capa superior gris con una espátula y disponer de él. Repita hasta que ya no hay una capa gris en la parte superior.
  19. Seco las muestras durante la noche en un desecador de vacío.
  20. Almacenar teliosporas secas a 4 ° C hasta su uso.
  21. Si lo desea, tratar las teliosporas con sulfato de cobre8 antes de inducir la germinación. Si no se trata, realizar análisis microscópico exhaustivo de las teliosporas para confirmar que la muestra representa teliosporas puros y carece de bacterias u otras contaminaciones.
    1. Pesar aproximadamente 50 mg de teliosporas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Añadir 1,0 mL aproximadamente de 0,75% CuSO4 al tubo de microcentrífuga de 1,5 mL conteniendo las teliosporas. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para suspender las teliosporas en la solución de CuSO4 seguida por agitar la muestra durante 3 horas.
    3. Centrifugar la muestra a 2.500 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de esta con agua estéril y repita la centrifugación, eliminar el sobrenadante.
    4. Repita el paso 2.21.3 dos veces más.

3. esta viabilidad y prueba de germinación

  1. Pesar aproximadamente 10 mg de teliosporas de U. maydis en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para evaluar su viabilidad y el momento de la germinación.
  2. En un gabinete de bioseguridad, preparar caldo dextrosa de papa (PDB, 24 g/L) suplementado con sulfato de estreptomicina (160 μg/mL).
  3. Suspender las teliosporas en 500 μl de PDB. Pipetee suavemente para mezclar y dispersar los grumos de teliosporas.
  4. Transferir la suspensión de esta en una autoclave 250 mL matraz Erlenmeyer que contenía 10 mL de la PDB.
  5. Incube el frasco a 28 ° C agitando a 90 rpm durante 12 a 16 h.
  6. En un gabinete de bioseguridad, saque un 20 μl de muestra de las teliosporas inducidas a germinar y a preparar un portaobjetos de microscopio.
  7. Visualmente con un microscopio, evaluar las etapas de germinación que se presentan y la presencia de contaminación bacteriana.
    1. Contar el número de teliosporas en etapas I a V utilizando un hemocitómetro y determinar el por ciento que ha germinado.
    2. Si sólo la etapa I teliosporas están presentes, continúan Incube el frasco para un total de 24 h antes de evaluar la germinación de la Teliospora. Continuar la incubación durante un máximo de 48 h antes de considerar la muestra no viables.
    3. Si hay contaminación bacteriana, complementar el PDB con el sulfato de kanamicina (50 μg/mL) y estreptomicina (160 μg/mL) y repita los pasos 3.1 a 3.7. Si persiste la contaminación bacteriana, tratamiento de teliosporas con sulfato de cobre y repita los pasos 3.1 a 3.7.

4. inducción de germinación para el control de la respiración

  1. Pesan igual cantidad (por ej., 50 mg) de teliosporas para cada experimento de respiración.
  2. En un gabinete de bioseguridad, añadir teliosporas a una cámara de respiración esterilizado.
  3. Llenar la cámara con PDB (24 g/L) suplementado con estreptomicina (160 μg/mL) y kanamicina sulfato (50 μg/mL).
  4. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para crear una suspensión de esta.
  5. Colocar la tapa de la cámara en la cámara para crear sello hermético.

5. obtención de las mediciones de tasa (OCR) de consumo de oxígeno

  1. Coloque la cámara en la rejilla de la cámara dentro de un baño de agua (precalentada a 28 ° C).
  2. Coloque la sonda de2 O dentro de la abertura de la cámara.
  3. Supervisar los puntos de datos en tiempo real en el programa "SensorTrace Rate" y que la sonda estabilizar (~ 3 minutos después de que la sonda se coloca en la cámara).
  4. Haga clic en "Medida" para medir O2 niveles continuamente durante 6 h con medidas en intervalos s 2.
  5. Detener la medición y repita los pasos 4.1-5.4 para cada muestra a analizar.
  6. Exportar los datos a Microsoft Excel haciendo clic en "archivo | De exportación | Guardar como xls".

6. Análisis de datos

  1. Calcule OCR
    1. En el archivo de Excel exportado bajo la pestaña de "Within_Rates", grabar la "tasa" para cada medición de cámara (nmol/h).
    2. Para cada muestra experimental, reste la "tasa" de la cámara en blanco de la "tasa" de la cámara de muestras experimentales para obtener un valor corregido de OCR y tomar el valor absoluto de este número.
    3. Calcular el total OCR por mg de teliosporas dividiendo el valor de OCR absoluto corregido por el celu utilizado masa.
    4. Medio de replicar los valores "OCR por mg de teliosporas" para cada cepa.
  2. Analizar los datos utilizando el método estadístico adecuado (por ej., de student t-test, análisis de varianza) con Microsoft Excel de otro software de estadística.
  3. Para ver datos, calcular el porcentaje de oxígeno restante para cada punto del tiempo que desea ver. Divida la primera lectura por sí mismo multiplica por 100 (100% oxígeno restante), luego divida cada lectura posterior por la primera lectura y multiplica por 100 para obtener el porcentaje de oxígeno en la cámara.

7. inducción de la germinación de la Teliospora para aislar teliosporas en distintas etapas de la germinación

  1. Preparar el PDB (24 g/L) suplementado con sulfato de estreptomicina (160 μg/mL) en un gabinete de bioseguridad.
  2. Colocar aproximadamente 10 mg de teliosporas de U. maydis en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  3. Suspender las teliosporas en 500 μl de PDB. Pipetee suavemente para mezclar hasta que no queden grumos de teliosporas en el medio.
  4. Transferir la suspensión de esta a un erlenmeyer de 250 mL esterilizado con PDB suplementado con sulfato de estreptomicina.
  5. Incube el frasco durante la noche 28 ° C agitando a 90 rpm.

8. preparación de la placa de Petri y amalgamas dentales

  1. Preparar un plato de Petri (57 cm2) por pipeteo filas de gotas para la preparación de microcapillary y recogida de muestras.
    1. Pipetear 5 gotas de2O de dH μl (x 4) en la parte superior de la caja Petri.
    2. Pipeta (x3) de 2 μl de la solución de estabilización de RNA en la caja Petri para recogida de muestras.
    3. Pipetear 5 gotas de la germinación de teliosporas en la caja Petri μl (x 30).
  2. Añadir 15 mL de aceite mineral a la caja Petri. Asegurar que todas las gotitas están cubiertas por el aceite antes de proceder.
  3. Preparar un microcapillary con un diámetro interno de 15 μm, brida de 1 mm, 55 mm de longitud y un ángulo de punta 20° colocando en el soporte de microcapillary y sumergirse en el aceite mineral donde acción capilar permitirá que el aceite mineral entrar en el microcapillary. Libere la presión en el microcapillary antes de llevar a la gota de agua. Aspire para preparar la microcapillary con agua.

9. aislamiento de la fase específica de la germinación de teliosporas

  1. Utilizando los controles de las amalgamas dentales, hacia el microcapillary preparado una de las gotitas de la germinación. Penetrar en la gota, baje el microcapillary y llevar la boca de la microcapillary hasta una Teliospora de germinación en la fase de germinación de interés.
  2. Aspirar lentamente para capturar la germinación de la Teliospora. Dejar de aspirar una vez que el esta ha entrado en la microcapillary. Repita hasta que hay aproximadamente cinco teliosporas en lo microcapillary.
  3. Aumentar la microcapillary con el instrumental quirúrgico y llevar a la gota de colección de solución de estabilización de RNA. Penetrar la gota e inyectar las teliosporas a la gota.
  4. Repita los pasos 8.1 a 8.3 hasta aproximadamente 1.000 teliosporas han sido capturados.

10. recuperación de la colección de la gotita

  1. Pipeta hasta la gota de la colección y la transferencia a la tapa de un tubo de microcentrífuga de 2.0 mL libre de DNasa/Rnasa. Retire con cuidado el aceite mineral con una pipeta sin molestar a la gota de la colección.
  2. Utilice las teliosporas para aplicaciones posteriores, tales como aislamiento de RNA.

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Representative Results

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Usando el Clark-tipo microrespirometer-método basado en medir los cambios en la respiración durante esta Dormición y germinación, confirmamos que latente teliosporas exhiben un bajo nivel de la respiración (~ 1.075 μmol/h/mg) en comparación con el de la germinación teliosporas (~ 2.614 μmol/h/mg; Figura 1A). Esto representa un cambio de ~2.4-fold en la tasa promedio de respiración entre teliosporas latentes y teliosporas que han sido inducidos a germinar. Además, hemos identificado que teliosporas que han sido inducidos a germinar tienen un retraso de ~ 45 min en la absorción de oxígeno (figura 1B). Esto es indicado por el retraso de ~ 30 min en la captación de oxígeno (figura 1B) además del retardo ~ 15 min entre la inducción de la germinación y el comienzo de las mediciones de oxígeno. Esto identifica un punto de tiempo para comenzar a evaluar cambios moleculares en las germinación teliosporas que visiblemente no cambian.

Microscópicamente se observan cambios posteriores durante la germinación. Se determinaron cinco etapas de la germinación. La etapa de germinación representa teliosporas que han sido inducidos a germinar pero siguen siendo indistinguibles de teliosporas latentes. Teliosporas de fase II con un emergente promycelium con una longitud que sea menor o igual al diámetro de la Teliospora. Teliosporas de etapa III tienen promycelia que son mayores que el diámetro de esta. Etapa IV de germinación es el florecimiento inicial de basidiosporas de lo promycelia, y etapa V son las basidiosporas haploides resultantes que se dividen por gemación (figura 2). Usando la técnica de microdisección que hemos desarrollado, hemos aislado con éxito teliosporas germinación de 500 a 1.000 para aplicaciones posteriores, tales como aislamiento de RNA para RT-PCR o RNA-Seq (tabla 1). La figura 3 muestra el conjunto general para arriba de la Petri dish para la microdisección y los pasos para la microdisección mediante un micromanipulador.

Figure 1
Figura 1: evolución temporal de consumo de oxígeno durante la germinación de la Teliospora. Teliosporas latentes fueron inducidas a germinar, y los niveles de oxígeno se registraron continuamente durante 6 h con una microrespirometer de tipo Clark. Teliosporas inactivos no inducidos fueron utilizados como control, y todas las mediciones fueron normalizadas a una muestra en blanco. (A) datos representan como OCR media. (B) datos en bruto conspiró para obtener las curvas de la respiración, que permite la detección de cambios en OCR durante el curso del tiempo. Teliosporas que han sido inducidos a germinar consumen oxígeno a una tasa promedio 2.4-fold más rápido que las teliosporas inactivos no inducidas (p < 0,01; De Student t-test). CERDO: la inducción de la germinación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: etapas de la germinación de la Teliospora. Etapas I a V de la germinación de la Teliospora se ilustra (AE). Barra de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: microdisección para aislar etapas morfológicas distintas de la germinación de teliosporas. Se ilustra la configuración general de un Petri dish para la microdisección y los pasos para aislar esta en etapa III de la germinación. (A) ilustración de una caja de Petri se configura con filas de gotas que contienen o agua estéril, solución de estabilización de RNA, o la germinación de teliosporas. Tras la inducción de la germinación, teliosporas se aislaron en etapas específicas de germinación usando el microdissection. (B) una gotita de germinación que contiene inducidas a germinar teliosporas en etapas I a III. (C) un microcapillary preparado fue traído para arriba para una esta etapa III para la colección a través de la aspiración. (D) esta la fase III en un microcapillary de vidrio es extraída de la gota de la germinación y se trasladó a una gotita de colección. (E) el microcapillary fue insertado en la solución de estabilización RNA que contiene colección gotita y el esta etapa III se inyectó a la gota. (F) una colección de teliosporas III etapa en la solución de estabilización de RNA. Barra de escala = 20 μm (A, D, F) y 50 (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Etapa de germinación Cantidad de teliosporas germinación aislado
Etapa I 1.000
Etapa II 500
Etapa III 650

Tabla 1: cantidad de teliosporas germinación correctamente aislado para cada etapa de la germinación en un experimento de aislamiento estándar. La tabla muestra el número promedio de teliosporas que han aislado usando el microdissection para etapas I a III antes para aplicaciones posteriores.

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Discussion

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Patógenos foliares de basidiomicetos causan miles de millones de dólares en pérdidas en los cultivos anuales. La gran mayoría de estos patógenos produce teliosporas que son parte integrales de hongos dispersión y reproducción sexual. Obtener conocimiento del desarrollo y la germinación de teliosporas es fundamental para comprender la propagación de las devastadoras enfermedades causadas por estos hongos. Con el fin de identificar cambios moleculares en los puntos clave de control hemos ideado un método para identificar el momento de cambios fisiológicos y otra para aislar teliosporas en distintas etapas de la germinación. Seto et al. (inéditas) indicadas cinco etapas de la germinación de la Teliospora por microscopia ligera (figura 2). Para investigar la activación fisiológica durante la etapa I y evaluar la tasa de respiración durante la germinación, se utilizó un microrespirometer de tipo Clark para precisamente medir los cambios en el consumo de oxígeno. Nuestros datos de la muestra indican que nuestro método es preciso y muy reproducible. Nuestros resultados confirman que germinación U. maydis teliosporas exhiben un aumento drástico en la respiración celular en comparación con teliosporas inactivos no inducidos. Por primera vez, hemos identificado que U. maydis teliosporas que han sido inducidos a germinar exhiben un retraso ~ 45 min en la absorción de oxígeno. Esto sugiere que las teliosporas de U. maydis pueden requerir algún tiempo para procesar señales de germinación (e.g., la presencia de azúcares) antes de responder, ese consumo de oxígeno mayor no está entre las respuestas muy inmediatas a las señales de germinación o que nuestro análisis no era lo suficientemente sensible para detectar el mínimo cambio en la absorción de oxígeno inicial.

Anteriores estudios que examinan las tasas de respiración de teliosporas de carbón3 dependía de un aparato de Warburg frasco para medir oxígeno niveles manometrically5. Brevemente, este método mide el consumo de oxígeno y producción de CO2 mediante la detección de cambios en la presión en un frasco cerrado a través de la observación directa de cambios de nivel de líquido en el brazo del manómetro. Los experimentos pueden ser difíciles de establecer, y las mediciones pueden ser imprecisas. El aparato debe ser atendido durante todo el período de medición y cálculos extensos deben estimar OCR. Nuestro protocolo hace uso de los avances tecnológicos, eliminando el requisito para que el usuario permanezca por el aparato durante la duración del experimento, tomar medidas a ojo y utilizar fórmulas matemáticas extensas. Otros han utilizado principios respirometers tipo de Clark a medida OCR de Neurospora crassa9 y Botryodpilodia theobromae10 esporas, sin embargo, estos primeros instrumentos permitieron mediciones continuas para un máximo de 20 minutos. Esta limitación no habría permitido la identificación del ~ 45 min de retraso en la absorción de oxígeno que se observó con el respirómetro de modelo más reciente. Nuestro protocolo ha hecho interpretación de los datos más simples, como la lectura es la concentración de oxígeno en la cámara, que puede ser directamente trazada sin ninguna manipulación de datos o cálculos. Además, es posible tomar mediciones continuas (cada 2 s) por una cantidad indefinida de tiempo hasta que se agota completamente el oxígeno disponible. Esto permite la identificación de pequeños cambios en la respiración durante un largo período de tiempo. Por lo tanto, hemos mejorado con técnicas anteriores y desarrolló un método sencillo, preciso y reproducible para medir consumo de oxígeno de las esporas de hongos. A nuestro conocimiento, éste es el primer estudio que utiliza un respirómetro de Clark-tipo moderno para estudiar la respiración de reposo y germinación de teliosporas de hongos carbón.

A pesar de la facilidad y simplicidad de este protocolo, la optimización es necesaria y hay realidades biológicas que limita el análisis. Tamaños de muestra en primer lugar, apropiado deben ser identificados para lograr OCR razonable. Demasiado muestra puede llevar a estrellarse prematura de los niveles de oxígeno, y muestra demasiado pequeña puede resultar en la incapacidad para observar cambios significativos en el consumo de oxígeno. En segundo lugar, es imprescindible para permitir que la sonda se estabilice (3 min) para proporcionar los datos exactos de iniciales. Por último, es importante suplementar el medio de germinación con agentes antibacterianos (por ej., sulfato de estreptomicina) para garantizar la contaminación bacteriana no altera las lecturas de OCR. Las limitaciones biológicas que enfrentamos fueron una tasa de germinación baja a lo largo del tiempo de medición, (~ 1%) según lo determinado mediante la observación de cambios morfológicos visuales. Determinación de viabilidad de esporas permite esta determinación de la tasa se convertirá en una tasa por el número de esporas y aislar teliosporas con mayores tasas de germinación llevaría a mayor OCR. La germinación asincrónica de U. maydis teliosporas11 es una realidad que debe explicarse y pudo haber contribuido a una incapacidad para detectar el consumo de oxígeno durante la germinación.

Para mejorar la precisión y exactitud de la medición de cambios en la respiración de esta, las adaptaciones futuras a este método podrían incluir OCR de medición en una sola base de celular. Técnicas de micromanipulación podrían utilizarse para aislar una esta sola, que luego puede ser inducida a germinar y su tasa de respiración pueden ser monitoreado. Esto podría mejorar la resolución, proporcionando información sobre el OCR durante el turno de latencia-germinación por esta, en lugar de por mg de teliosporas. Además, Esto solucionaría el problema de confusión de germinación asincrónica.

Para etapas posteriores de la germinación, se desarrolló un método de micromanipulación para aislar teliosporas en común etapas de germinación. Esto permitió la creación de las poblaciones de esta relativamente sincrónico para el análisis. Varios métodos para aislar microorganismos solo se han descrito y se han mejorado sobre los años12. Estos métodos incluyen la dilución de las suspensiones de esporas para obtener solo microorganismos, métodos semi-mecánicos con el uso de microcapilares para obtener las esporas que son transferidas al medio para métodos de cultivo y mecánicos que utilizan micromanipuladores . Los métodos anteriores que utilizamos para obtener la misma etapa de germinación de teliosporas incluyen elutriación centrífuga contracorriente y filtrado de germinación de teliosporas a través de una membrana de nylon con un tamaño específico de poro. Utilizando estos métodos permitidos enriquecer para germinación de teliosporas, sin embargo, nuestras muestras todavía contienen teliosporas en diversas etapas de germinación13. Actual tecnología de micromanipulación de microorganismos solo ha mejorado con la introducción de mayor aumento e instrumentos para el control fino de agujas capilares, la aspiración y la transferencia de microorganismos. Técnicas de micromanipulación anteriores se han centrado en aislar células individuales para el cultivo o en sola celda PCR aplicaciones14. El uso de micromanipuladores para aislar esporas de hongos solo no se ha establecido previamente. Un método anterior para aislamiento de esporas de hongos solo implicó el uso de Pinzas finas o agujas para recoger pequeños trozos de medio sólido que contiene la germinación de esporas de15. Micromanipulación utilizando micromanipuladores es ampliamente utilizado en estudios de levadura donde racimos de esporas pueden ser separado siguiente esporulación en cultivo en medio agar para el análisis genético meiótico16. Hemos desarrollado un método que combina la técnica de micromanipulación de células bacterianas14 y en vitro fecundación métodos para aislar la germinación de teliosporas. Hemos demostrado que con esta técnica se pueden obtener cientos de común teliosporas de etapa de germinación. Estas muestras pueden utilizarse para estudios de aguas abajo de la expresión mediante técnicas como la RT-qPCR o RNA-seq. obtención de una población en la que se sincroniza la germinación de teliosporas permite el análisis de los cambios específicos en la expresión génica que se produce durante principios, mediadas de y más adelante las etapas de la germinación de la Teliospora.

Microdissection de la etapa específica de la germinación de teliosporas puede requerir experiencia en conjunto para arriba y reconocer las diferentes etapas de la germinación, sin embargo, esta experiencia puede obtenerse rápidamente a través de la práctica. Hay varios pasos que deben seguirse para microdisección exitoso seguido por el aislamiento de RNA. En primer lugar, medio de germinación debe complementarse con antibióticos (por ej., sulfato de estreptomicina) para suprimir el crecimiento de la contaminación bacteriana cuando se inicia la germinación, así como durante la recogida de la germinación de teliosporas. En segundo lugar, es importante utilizar una solución de estabilización para estabilizar y proteger RNA para el aislamiento. La solución de estabilización de RNA impide también recogidos teliosporas avanzando a la siguiente fase de la germinación mientras que recoge teliosporas adicionales. En tercer lugar, es importante eliminar el aceite mineral una vez que se ha recuperado la gota de la colección para asegurar la exitosa extracción de RNA. Por último, hemos notado cierta pérdida de calidad de RNA si teliosporas aislados son almacenados en la solución de estabilización de RNA para un largo período de tiempo; por lo tanto, se recomienda que el ARN es aislado inmediatamente después de la colección de teliosporas específicos de la etapa de germinación. Una limitación del método es que la etapa me teliosporas recogidas podrían contener inactiva, muerta e inducidas a germinar teliosporas como estas tres etapas son morfológicamente indistinguibles. Además, al recoger las teliosporas de etapa III, una mezcla de teliosporas en la meiosis I o meiosis II podía obtenerse. Podría ser una forma de ayudar en la distinción entre teliosporas verdaderamente dormantes y muertas determinar la viabilidad de la muestra. Un método para evaluar la viabilidad de esporas de hongos utilizando ensayos de viabilidad celular vivo o muertos puede ser capaces de evaluar porcentaje de teliosporas viables de que las tasas de germinación más informativas podrían ser determinado17. Además, núcleo de tinción con DAPI, por ejemplo, podría ser utilizado para visualizar los eventos de la meiosis que ocurren durante la fase III y la transición a la fase IV para caracterizar más lejos teliosporas morfológicamente en etapa III. Esto ayudaría en la colección de teliosporas en solamente una etapa de germinación cuando con nuestro método del microdissection.

En conclusión, hemos desarrollado un método simple, precisa y reproducible para medir los cambios en la respiración celular que ocurren durante el turno de latencia-germinación de teliosporas de Ustilago maydis . Además, hemos desarrollado un método para la recogida de etapas específicas de la germinación de teliosporas que podrían ser utilizados para aplicaciones posteriores, tales como RNA-seq. Nuestros métodos puede adaptarse para dar cabida a diversas especies y tipos de la célula. Anticipamos que mejoras a nuestras técnicas facilitará la detección de los cambios respiratorios en una sola espora nivel así como para definir los eventos que están ocurriendo en las últimas etapas de la germinación.

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Disclosures

Los autores tienen ninguna competencia intereses financieros u otros conflictos de interés divulgar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer al Dr. Paul Frost para el uso de su microrespirometer y Nicole Wagner y Alex Bell para asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por una subvención NSERC para B.J.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptomycin Sulfate BioShop STP101
Kanamycin Sulfate BioShop KAN201
Potato Dextrose Broth BD Difco 254920
1 L Waring Laboratory blender Waring 7011S
Cheesecloth VWR 470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock ThermoFisher Scientific 5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2) Unisense OX10
MicroOptode Meter Amplifier Unisense N/A
MR-Ch Small Unisense MR-Ch
SensorTrace Rate Software Unisense N/A
MicroRespiration Rack Unisense MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer Unisense MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope Zeiss
Coarse Manipulator Narishige MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator Narishige MMO-202ND
Pneumatic Microinjector Narishige IM-11-2
TransferTip (ES) Eppendorf 5175107004

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References

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Germinación de esta investigadora mediante el análisis de Microrespiration y microdisección
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Ostrowski, L. A., Seto, A. M., Saville, B. Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection. J. Vis. Exp. (135), e57628, doi:10.3791/57628 (2018).More

Ostrowski, L. A., Seto, A. M., Saville, B. Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection. J. Vis. Exp. (135), e57628, doi:10.3791/57628 (2018).

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