Summary
Smut svampar orsakar många förödande jordbruks sjukdomar. De sprids som vilande teliospores som gror i svar på miljömässiga ledtrådar. Vi beskriver två metoder för att undersöka molekylära förändringar under groning: mäta andning ökar för att upptäcka metabolisk aktivering och bedöma ändra molekylära händelser genom att isolera teliospores distinkta morfologiska skeden.
Abstract
Smut svampar är etiologiska agenter för flera förödande jordbruks sjukdomar. De kännetecknas av produktionen av teliospores, som är tjocka spridning agenter. Teliospores kan förbli vilande i årtionden. Dvala kännetecknas av låg ämnesomsättning priser, pausade makromolekylära biosyntes och kraftigt sänkta nivåer av andning. Efter mottagandet krävs Miljösignaler, GRO teliospores för att producera haploida celler, som kan initiera nya omgångar av infektion. Teliospore grobarhet kännetecknas av återupptagandet av makromolekylära biosyntes, ökad andning och dramatiska morfologiska förändringar. För att exakt mäta förändringar i cellandningen under de tidiga stadierna av grobarhet, har vi utvecklat ett enkelt protokoll som sysselsätter en Clark-typ respirometer. De senare stadierna av grobarhet kännetecknas av specifika morfologiska förändringar, men grobarhet är asynkron. Vi utvecklade en lokalt-teknik som gör det möjligt för oss att samla in teliospores distinkta grobarhet skeden.
Introduction
De smut svamparna (Ustilaginales) består av över 1600 arter som infekterar gräs inklusive de viktiga spannmål av havre, korn och vete, orsakar miljarder dollar i skördeförluster årligen1. Dessa svampar kännetecknas av produktionen av teliospores, som har mörkt pigmenterade cellväggar och är spridning agenter. Teliospores funktion för att skydda genetiska materialet under stressiga spridning mellan värdväxter och kan kvarstå i ett vilande tillstånd för år2. Som sådan, är teliospores en viktig komponent i sjukdomen sprids.
Vårt laboratorium använder för att studera teliospore biologi, och tredjeparts modell smut svampen Ustilago maydis (U. maydis), vilket är den kausala smittämnet 'gemensamma smut majs'. Mogen U. maydis teliospores kännetecknas av tillväxt gripandet, minskad cellulär metabolism och låga nivåer av cellandningen3. Under gynnsamma miljöförhållanden (t.ex., förekomsten av specifika sockerarter), U. maydis teliospores gror och slutföra meios, producerande källor som kan initiera nya omgångar av infektion. Grobarhet kännetecknas av ökad andning, återgång till metaboliska aktiviteten och progression genom observerbara morfologiska stadier av grobarheten4.
Inledningsskedet av grobarhet inkluderar ökad respiration och metabolisk funktion, men det finns inga morfologiska tecken på förändring. De ursprungliga mätningarna av respiratoriska förändringar i U. maydis genomfördes över 50 år sedan, mäta syreförbrukning manometrically med en Warburg kolv apparater5. Vi har utvecklat en ny, enkel metod att studera exakt förändringar i andningen under teliospore grobarhet genom att mäta syreförbrukning under en tid av grobarheten använder en Clark-typ microrespirometer. Vi tidigare använde denna metod för att studera förändringar i andningsfrekvens mellan vildtyps- U. maydis haploida celler och mutanter med defekta mitokondrierna6, och har anpassat protokollet här för att studera förändringar i teliospore andning under grobarhet. Detta ger ett sätt att korrekt identifiera tidpunkten för respiration förändring så att vi kan rikta teliospores vid lämplig tidpunkt efter inledningen av grobarhet att undersöka tidiga molekylära händelser. Progressionen av grobarhet kan följas mikroskopiskt när promycelia framträder ur teliospore, men den asynkrona naturen hämmas tillräckligt teliospores isolering på ett visst Stadium för utredning. Vi utvecklat ett lokalt teknik liknande dem som används för in vitro- befruktning fysiskt samla teliospores på olika morfologiska faser av grobarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. majs Cob infektion
- Växa Zea mays (cv. Golden Bantam) tills cobs bildas och har börjat silk (ca 60 dagar).
- Kultur kompatibel haploida U. maydis stammar använder standardprotokoll som tidigare beskrivs7.
- Infektera majskolvar med standardprotokoll som tidigare beskrivna7.
2. teliospore skörd
- Autoklav utrustning (Büchner trattar, Büchner kolvar, blenders, 250 mL centrifug flaskor, platt spatlar och vatten) med hjälp av en standard torr cykel med minst 30 min sterilisering vid 121 ° C (standard flytande cykel för vatten).
- Ta bort infekterade cobs från växter (ca 28 – 35 dagar efter infektion) använda en rakhyvel och Ställ majskolvar på en bricka täckt i bänk protector.
- Ta bort tumörer från cobs med ett rakblad och samla i en bägare.
- Fyll en 250 mL laboratorium mixer kopp med tumörer till cirka 1/3 full och autoklaveras dH2O tills mixern koppen är cirka 3/4 full. Störa tumörer av pulserande mixern på låg, tills homogeniserade.
- Anslut vakuumpumpen till ett vattenlås och sedan till en 1 L Büchner kolv.
- Sätt stora Büchner tratt i kolven och linje botten av Büchner tratten med fyra lager av cheesecloth.
- Slå på vakuumpumpen.
- Häll en del av homogeniserad tumörer genom cheesecloth och skrapa med en spatel.
- Häll några dH2O i cheesecloth för att spola teliospores genom.
- Upprepa tills den dH2O kommer genom cheesecloth är tydlig.
- Vrida ur cheesecloth som innehåller den homogeniserade tumörmaterial i filtret för att säkerställa maximal teliospore återhämtning.
- När 1 L Büchner kolven blir nära full, Töm den till en stor Erlenmeyerkolv och ställ det åt sidan.
- Sätta en ny bit av cheesecloth i filtret och upprepa steg (2,7 – 2.12) tills samtliga tumörer har stört och filtreras.
- Häll de filtrerade teliospores i lättbetong och autoklaverad 250 mL centrifug flaskor och centrifugera vid 1 000 x g i 5 min, och Dekantera supernatanten.
- Upprepa steg 2.14 tills alla de filtrerade teliospores är pelleterat genom centrifugering.
- Avbryta pellets i en liten mängd vatten och överföring till 50 mL centrifugrör.
- Centrifugera rören vid 1 000 x g i 5 min, och Dekantera supernatanten.
- Centrifugerade i ca 50 mL dH2O, Centrifugera rören vid 1 000 x g i 5 min och Dekantera supernatanten. Försiktigt skrapa bort det grå översta lagret med en spatel och kasta den. Upprepa tills det inte längre ett grått lager på toppen.
- Torra proverna övernattning i vakuum exsickator.
- Förvara torkade teliospores vid 4 ° C fram till användning.
-
Om du vill behandla teliospores med kopparsulfat8 innan förmå att gro.. Om den inte behandlas, då utföra noggrann Mikroskopisk analys av teliospores att bekräfta urvalet representerar ren teliospores och saknar bakteriell eller andra föroreningar.
- Väg upp cirka 50 mg teliospores i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Tillsätt cirka 1,0 mL av 0,75% CuSO4 till 1,5 mL mikrocentrifug röret som innehåller teliospores. Pipettera upp och ner för att upphäva teliospores i CuSO4 lösningen följt av agitera provet för 3 h.
- Centrifugera provet vid 2500 x g i 5 min och avlägsna supernatanten. Återsuspendera pelleten teliospore med sterilt vatten, upprepa centrifugeringen och avlägsna supernatanten.
- Upprepa steg 2.21.3 två gånger.
3. teliospore livskraft och grobarhet Test
- Väg upp cirka 10 mg U. maydis teliospores i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör att bedöma deras livskraft och tidpunkten för grobarhet.
- I en biosäkerhet skåp, förbereda potatis dextros buljong (PDB, 24 g/L) kompletteras med streptomycin sulfate (160 µg/mL).
- Avbryta teliospores i 500 µL för PDB. Pipettera försiktigt för att blanda och bryta upp alla klumpar av teliospores.
- Överför teliospore till en Ånghärdad 250 mL Erlenmeyerkolv, innehållande 10 mL av det preliminära budgetförslaget.
- Inkubera kolven vid 28 ° C skakar vid 90 rpm för 12 – 16 h.
- I en biosäkerhet skåp, ta bort ett 20 µL prov av de teliospores som inducerade att gro och förbereda ett objektglas.
-
Med Mikroskop visuellt bedöma stadier av grobarhet som finns och förekomst av bakteriell kontamination.
- Räkna antalet teliospores på arrangerar jag genom V med hjälp av en hemocytometer och bestämma den procent som har grott.
- Om bara steg I teliospores är närvarande, fortsätta att Inkubera kolven för totalt 24 h innan bedömningen av teliospore grobarhet. Fortsätt inkubation för upp till 48 h innan anse stickprovet icke-viabla.
- Om bakteriell kontaminering, komplettera det preliminära budgetförslaget med kanamycin sulfate (50 µg/mL) samt streptomycin sulfat (160 µg/mL) och upprepa sedan steg 3.1 till 3,7. Om bakteriell kontaminering kvarstår, behandla teliospores med Kopparvitriol och upprepa steg 3.1 till 3,7.
4. induktion av grobarhet för andning övervakning
- Väger lika mycket (t.ex., 50 mg) av teliospores för varje andning experiment.
- I en biosäkerhet skåp, lägga till teliospores till en Ånghärdad respiration kammare.
- Fylla kammaren med PDB (24 g/L) kompletteras med streptomycin sulfat (160 µg/mL) och kanamycin sulfat (50 µg/mL).
- Pipettera upp och ner för att skapa en teliospore suspension.
- Kammaren locket i kammaren att skapa lufttät tätning.
5. mätningar syre förbrukning hastighet (OCR)
- Placera kammaren i kammaren rack inuti ett vattenbad (förvärmd till 28 ° C).
- Placera sonden O2 inuti öppnandet av kammaren.
- Övervaka de datapunkter som visas i realtid på programmet ”SensorTrace Rate” och låta sonden stabilisera (~ 3 min efter sonden placeras i kammaren).
- Klicka på ”åtgärd” för att mäta O2 nivåer kontinuerligt i 6 h med mätningar inspelade med 2 s intervall.
- Stoppa mätningen, och upprepa steg 4.1 – 5,4 för varje prov som skall analyseras.
- Exportera data till Microsoft Excel genom att klicka på ”fil | Exportera | Spara som .xls ”.
6. dataanalys
-
Beräkna OCR
- I den exporterade Excel-filen under fliken ”Within_Rates”, att spela in den ”Rate” för varje kammare mätning (nmol/h).
- För varje experimental prov, subtrahera ”graden” av tomma kammaren från ”graden” av den experimentella provkammaren att erhålla en korrigerad OCR-värdet, och ta det absoluta värdet av detta nummer.
- Beräkna den totala OCR per mg teliospores genom att dividera det korrigerade absoluta OCR värdet av cellulära massa används.
- Genomsnittliga replikera ”OCR per mg teliospores” värden för varje stam.
- Analysera data med hjälp av lämplig statistisk metod (t.ex., student's t-test, variansanalys) använder Microsoft Excel för andra statistisk programvara.
- Att rå Diagramdata, beräkna procentandelen av syre kvar för varje tidpunkt som du vill rita grafer. Dela första behandlingen själv och multiplicera med 100 (100% syre kvar), sedan dividera varje efterföljande behandling med i första behandlingen och multiplicera med 100 att få procent av syre kvar i kammaren.
7. induktion av Teliospore grobarhet att isolera Teliospores i olika skeden av grobarhet
- Förbereda PDB (24 g/L) kompletteras med streptomycin sulfat (160 µg/mL) i en biosäkerhet skåp.
- Placera ca 10 mg U. maydis teliospores i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Avbryta teliospores i 500 µL för PDB. Pipettera försiktigt för att blanda tills det finns inga klumpar av teliospores medium.
- Överför teliospore till en Ånghärdad 250 mL Erlenmeyerkolv, innehållande PDB kompletteras med streptomycin sulfat.
- Inkubera kolven över natten vid 28 ° C skakar vid 90 rpm.
8. beredning av petriskål och Micromanipulator
-
Förbereda en petriskål (57 cm2) genom pipettering rader av droppar för microcapillary förberedelse och provtagning.
- Pipettera 5 µL (x 4) dH2O droppar över toppen av petriskål.
- Överför med pipett 2 µL (x3) RNA stabilisering lösning på petriskål användas för provtagning.
- Pipettera 5 µL (x 30) droppar av spira teliospores på petriskål.
- Tillsätt 15 mL av mineralolja till petriskål. Se till att alla droppar omfattas av olja innan du fortsätter.
- Förbereda en microcapillary med en 15 µm inre diameter, 1 mm fläns, 55 mm lång och en 20° spets vinkel genom att placera den i hållaren för microcapillary och dränka det i mineralolja där kapillärkraft gör att mineralolja ange microcapillary. Släpp trycket i microcapillary innan föra den till vatten droplet-programmet. Aspirera för att förbereda microcapillary med vatten.
9. isolering av scenen-specifika spira Teliospores
- Med hjälp av kontrollerna av micromanipulator, flytta den förberedda microcapillary till en grobarhet droppar. Penetrera droplet-programmet, lägre i microcapillary och ta munnen på microcapillary upp till en gror teliospore skede groning av intresse.
- Aspirera långsamt för att fånga den gror teliospore. Stoppa aspirera när teliospore har gått in i microcapillary. Upprepa tills det finns ungefär fem teliospores i microcapillary.
- Höja microcapillary med micromanipulator och föra den till den samling droplet RNA stabilisering lösning. Penetrera droplet-programmet och injicera teliospores i droplet-programmet.
- Upprepa steg 8,1 till 8,3 tills ungefärligt 1.000 teliospores har fångats.
10. återvinning av samling Droplet
- Pipettera upp samling droplet-programmet och överföra det till locket på ett RNase/DNAS-free 2,0 mL mikrocentrifug rör. Ta försiktigt bort mineraloljan med pipett utan att störa samling droplet-programmet.
- Använda teliospores för nedströms applikationer såsom RNA isolering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med metoden microrespirometer-baserade Clark-typen för att mäta förändringar i andningen under teliospore dvala och grobarhet, bekräftat vi att vilande teliospores uppvisar en låg nivå av respiration (~ 1 075 µmol/h/mg) jämfört med spira teliospores (~ 2 614 µmol/h/mg; Figur 1A). Detta motsvarar en ~2.4-fold förändring i genomsnittliga andelen andning mellan vilande teliospores och teliospores som har inducerats att gro.. Dessutom har vi identifierat att teliospores som har inducerats att gro. har en ~ 45 min fördröjning i syreupptagningsförmåga (figur 1B). Detta indikeras av den ~ 30 min försenade syreupptagningsförmåga (figur 1B) utöver de ~ 15 min fördröjningen mellan induktion av grobarhet och start av syre mätningar. Detta identifierar en tidpunkt för att påbörja bedömningen av molekylära förändringar i de gror teliospores som synbart inte ändrar.
Efterföljande ändringar under groning kan observeras microscopically. Fem stadier av grobarhet bestämdes. Etapp I av grobarhet representerar teliospores som har inducerats att gro. men förblir omöjlig att skilja från vilande teliospores. Stadium II teliospores har en framväxande promycelium med en längd som är mindre än eller lika med diametern på teliospore. Stadium III teliospores har promycelia som är större än teliospore diameter. Stadium IV av grobarheten är den första spirande av källor från promycelia och steg V är de resulterande haploida källor som delar av spirande (figur 2). Med hjälp av lokalt-tekniken som vi har utvecklat, har vi framgångsrikt isolerat 500 till 1000 gror teliospores för nedströms applikationer såsom RNA isolering för RT-PCR eller RNA-Seq (tabell 1). Figur 3 visar den allmänna uppsättningen upp av Petri dish för lokalt och stegen för lokalt med hjälp av en micromanipulator.
Figur 1: tidsförloppet för syreförbrukning under teliospore groning. Vilande teliospores förmåddes att gro och syrenivåer spelades ständigt för 6 h med en Clark-typ microrespirometer. Un-inducerad vilande teliospores användes som kontroll, och alla mätningar var normaliserade till ett blindprov. (A) Data representeras av genomsnittliga OCR. (B) Raw-data plottas att erhålla respiration kurvor, tillåta att upptäcka förändringar i OCR under kursens gång. Teliospores som har inducerats att gro. förbruka syre i genomsnitt 2,4-faldigt snabbare än un-inducerad vilande teliospores (p < 0,01; Student's t-test). GRIS: efter induktion av grobarhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: stadier av teliospore grobarhet. Stadier I till V av teliospore grobarhet illustreras (A–E). Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: lokalt att isolera olika morfologiska faser av spira teliospores. Den allmänna Ställ in en Petri dish för lokalt och stegen för att isolera teliospore på stadium III av grobarheten är illustrerade. (A) Illustration av en petriskål ställa upp med rader av droppar som innehåller antingen sterilt vatten, RNA stabilisering lösning, eller spira teliospores. Efter groning induktion var teliospores isolerade i specifika stadier av grobarhet använder lokalt. (B) en grobarhet droplet som innehåller inducerad för att gro. teliospores i steg I-III. (C) en beredd microcapillary växte upp till ett steg III teliospore för insamling genom aspiration. (D) The stadium III teliospore i ett glas microcapillary tas bort från grobarhet droplet-programmet och flyttade till en samling droplet. (E) microcapillary sattes in in samling droplet som innehåller RNA stabilisering lösningen och den steg III teliospore injicerades i droplet-programmet. (F) en samling av stadium III teliospores i RNA stabilisering lösningen. Skalstapeln = 20 µm (A-D, F) och 50 µm (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Grobarhet scenen | Antal gror teliospores isolerade |
| Steg I | 1 000 |
| Steg II | 500 |
| Stadium III | 650 |
Tabell 1: antal gror teliospores framgångsrikt isolerade för varje grobarhet etapp i en standard isolering experiment. Tabellen visar Genomsnittligt antal teliospores som har isolerats med lokalt för steg I-III innan samling för nedströms tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Giftig biotrophic växt patogener orsaka miljarder dollar i skördeförluster årligen. Majoriteten av dessa patogener producera teliospores som är sammanbyggda till svamp spridning och sexuell reproduktion. Att få kunskap om utvecklingen och groning av teliospores är avgörande för att förstå spridningen av de förödande sjukdomar som orsakas av dessa svampar. För att identifiera molekylära förändringar på viktiga kontrollpunkter har vi utarbetat en metod för att identifiera tidpunkten för fysiologiska förändringar och en annan för att isolera teliospores i olika skeden av grobarhet. Seto o.a. (opublicerade) noterade fem stadier av teliospore groning av ljusmikroskop (figur 2). För att undersöka fysiologiska aktivering under steg I och för att bedöma respiration klassar under groning, vi använde en Clark-typ microrespirometer att exakt mäta förändringar i syreförbrukning. Våra exempeldata visar att vår metod är exakt och mycket reproducerbara. Våra resultat bekräftar att spira U. maydis teliospores uppvisar en drastisk ökning av cellandningen jämfört med un-inducerad vilande teliospores. För första gången har vi identifierat att U. maydis teliospores som har inducerats att gro. uppvisar en ~ 45 min fördröjning i syreupptagningsförmåga. Detta tyder på att U. maydis teliospores kan kräva en del tid att bearbeta grobarhet signaler (t.ex., förekomsten av sockerarter) innan du svarar, att ökad syreupptagningsförmåga är inte bland de mycket omedelbart svar på grobarhet signaler eller att vår analys inte var tillräckligt känslig för att upptäcka den minimal förändringen i inledande syreupptagningen.
Tidigare studier respiration klassar av smut teliospores3 förlitade sig på en Warburg kolv apparatur att mäta syre nivåer manometrically5. Kort, denna metod mäter syreförbrukning och CO2 -produktion genom att identifiera förändringar i trycket i en sluten kolven genom direkt observation av vätska nivåförändringar i manometer armen. Experimenten kan vara svårt att ställa upp, och mätningar kan vara oklara. Apparaten skall närvara under hela mätningen och omfattande beräkningar är nödvändiga för att uppskatta OCR. Våra protokoll gör användning av tekniska framsteg, vilket eliminerar kravet för användaren att förbli av apparaten för varaktigheten av experimentet, ta mätningar av ögat, och använda omfattande matematiska formler. Andra har använt tidiga Clark-typ respirometers åtgärd OCR Neurospora crassa9 och Botryodpilodia theobromae10 sporer, dock dessa tidiga instrument tillåtet kontinuerliga mätningar för max 20 min. Denna begränsning skulle inte ha tillåtit identifiering av ~ 45 min förseningen i syreupptagningsförmåga som vi observerade med den nyare modellen respirometer. Våra protokoll har gjort tolkning av data enklare, eftersom utslaget är koncentrationen av syre kvar i kammaren, som kan vara direkt diagram utan någon beräkningar eller data manipulation. Det är dessutom möjligt att ta kontinuerliga mätningar (varje 2 s) för en obestämd tid tills tillgängligt syre är helt slut. Detta möjliggör identifiering av små förändringar i andning under en lång tid. Därför har vi förbättrat tidigare tekniker och utvecklat en enkel, exakt och reproducerbar metod att mäta syreförbrukningen av svampsporer. Till vår kunskap är detta den första studien att använda en modern Clark-typ respirometer för att studera respiration av vilande kontra spira teliospores smut svampar.
Trots den lätthet och enkelhet i detta protokoll, optimering krävs och det finns biologiska verkligheten som begränsad analys. Första, lämpliga urvalsstorlekar måste identifieras för att uppnå rimlig OCRs. För mycket prov kan leda till för tidig kraschar av syrehalten och för lite prov kan resultera i en oförmåga att iaktta meningsfulla förändringar i syreförbrukning. Andra, det är absolut nödvändigt att tillåta sonden tid att stabilisera (~ 3 min) för att ge korrekta initiala data. Slutligen är det viktigt att komplettera grobarhet medium med antibakteriella medel (t.ex., streptomycin sulfat) för att säkerställa bakteriell kontamination inte förändrar OCR avläsningar. De biologiska begränsningar som vi inför var en låg grobarheten över tidsförloppet för mätning, (~ 1%) som bestämts genom att observera visuella morfologiska förändringar. Att fastställa spore livskraft skulle tillåta denna ränta beslutsamhet som ska konverteras till ett pris per spore nummer och isolera teliospores med högre grobarhet skulle leda till högre OCRs. Den asynkrona grobarheten U. maydis teliospores11 är en verklighet som måste redovisas och kan ha bidragit till en oförmåga att upptäcka syreförbrukning tidigare i grobarhet.
För att förbättra noggrannheten och precisionen hos mäta förändringar i teliospore respiration, skulle kunna framtida anpassningar till denna metod omfatta mätning OCR en enda cell-grund. Mikromanipulation tekniker kan användas för att isolera en enda teliospore, som sedan kan förmås att gro, och dess respiration klassar kan övervakas. Detta skulle kunna förbättra upplösning, som tillhandahåller information om OCR under det dvala-grobarhet skiftet per teliospore, snarare än per mg teliospores. Dessutom skulle detta lösa förbryllande frågan om asynkron grobarhet.
För senare stadier av grobarhet utvecklat vi en mikromanipulation metod för att isolera teliospores i gemensamma stadier av grobarhet. Detta möjliggjorde skapandet av förhållandevis synkrona teliospore populationer för analys. Olika metoder för att isolera enstaka mikroorganismer har beskrivits och har förbättrats under de år12. Dessa metoder inkluderar utspädning av spore suspensioner att få enstaka mikroorganismer, semi mekaniska metoder med hjälp av microcapillaries att få sporer som överförs till medium för odling, och mekaniska metoder som använder micromanipulators . Tidigare metoder som vi brukade få teliospores i samma skede av grobarheten inkluderar hydromassagefunktion centrifugal elutriation och filtrering gror teliospores genom en nylon membran med en viss porstorlek. Använda dessa metoder som tillät oss för att berika för spira teliospores, men innehöll våra prover fortfarande teliospores i olika stadier av grobarhet13. Dagens teknik för mikromanipulation av enstaka mikroorganismer har förbättrats med införandet av högre förstoring och instrument för fina kontroll kapillär nålar, aspiration och överföring av mikroorganismer. Tidigare mikromanipulation tekniker har fokuserat på isolera enstaka celler för odling eller användning i enskild cell PCR-program14. Användning av micromanipulators att isolera enstaka svampsporer har tidigare inte fastställts. En föregående metod för att isolera enstaka svampsporer inneburit att användningen av fin pincett eller nålar att plocka små bitar av fast medium innehållande gror sporer15. Mikromanipulation med användning av micromanipulators används allmänt i jäst studier där kluster av ascospores kan vara separerade följande sporulering i kultur på agarsubstrat för meiotiska genetisk analys16. Vi har utvecklat en metod som kombinerar mikromanipulation tekniken för bakterieceller14 och in vitro- befruktning metoder för att isolera gror teliospores. Vi har visat att hundratals gemensamma grobarhet scenen teliospores kan erhållas med denna teknik. Dessa prover kan användas för efterföljande uttryck studier med hjälp av tekniker såsom RTqPCR eller RNA-följande punkter att erhålla en befolkning på teliospores där grobarhet synkroniseras tillåter analys av specifika förändringar i genuttryck som inträffar under tidigt, mid och senare stadier av teliospore grobarhet.
Lokalt av arrangerar särskilda spira teliospores kan kräva erfarenhet i uppsättningen upp och känna igen de olika stadierna i grobarhet, dock denna erfarenhet kan erhållas snabbt genom praxis. I området i närheten finns det flera steg som måste följas för framgångsrikt lokalt följt av RNA isolering. Först, grobarhet medium måste kompletteras med antibiotika (t.ex., streptomycin sulfat) att undertrycka tillväxten av bakteriell kontamination när grobarhet påbörjas samt under samling av spira teliospores. Andra, det är viktigt att använda en stabilisering lösning att stabilisera och skydda RNA för isolering. RNA stabilisering lösningen hindrar också insamlade teliospores från framåt till nästa grobarhet scenen samtidigt samla ytterligare teliospores. För det tredje är det viktigt att ta bort mineralolja när samling droplet-programmet har återvunnits för att säkerställa framgångsrika RNA-extraktion. Slutligen, vi har märkt vissa förlust av RNA kvalitet om isolerade teliospores lagras i RNA stabilisering lösning för en längre tidsperiod; Det rekommenderas därför att RNA är isolerade omedelbart efter insamling av grobarhet scenen specifika teliospores. En begränsning i metoden är att scenen jag teliospores som samlas in kan innehålla vilande, döda och inducerad att gro. teliospores som dessa tre stadier är morfologiskt oskiljbara. Dessutom när samlande steg III teliospores, en blandning av teliospores i meios I eller meios II kunde erhållas. Ett sätt att hjälpa skilja mellan verkligt vilande och döda teliospores kunde vara att bestämma lönsamheten för provet. En metod för att bedöma svamp spore lönsamhet använder live/dead cell livskraft analyser kan kunna bedöma andelen livskraftiga teliospores där mer informativ grobarhet priser kan vara beslutsam17. Dessutom kunde nucleus färgning med DAPI, exempelvis användas för att visualisera meios händelserna som sker under steg III och övergången till etapp IV för att ytterligare karakterisera teliospores morfologiskt på steg III. Detta skulle hjälpa i samlingen av teliospores i bara utgör en etapp av grobarheten när du använder vår lokalt metod.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat en enkel, exakt och reproducerbar metod att mäta förändringarna i cellandningen som inträffar under den dvala-grobarhet förskjutningen av Ustilago maydis teliospores. Dessutom har vi utvecklat en metod för att samla in specifika stadier av spira teliospores som kan användas för nedströms applikationer, såsom RNA-följande punkter Våra metoder kan anpassas för att rymma olika cell-typer och arter. Vi räknar med att förbättringar av våra tekniker kommer att underlätta upptäckt av respiratoriska förändringar på en enda spore nivå samt ytterligare definiera de händelser som förekommer i de senare stadierna av grobarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter för att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Paul Frost för användning av hans microrespirometer, och Nicole Wagner och Alex Bell för tekniskt bistånd. Detta arbete finansierades genom en NSERC bidrag till B.J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
- Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. Swan, A. , InTech. 411-460 (2012).
- Christensen, J. J. Monograph Number 2. , The American Phytopathological Society. Worcester, MA. (1963).
- Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
- Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
- Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
- Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).
- Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).
- Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
- Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).
- Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).
- Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).
- Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).
- Seto, A. M. Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , Trent University. M.Sc. thesis (2013).
- Fröhlich, J., König, H. Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. König, H., Varma, A. , Springer. 425-437 (2006).
- Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
- Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).
