Summary
Qui, descriviamo l'isolamento di cellule glial-enterico dal submucosa intestinale utilizzando le incubazioni EDTA sequenziale per chelare cationi bivalenti e quindi l'incubazione in soluzione di recupero delle cellule non-enzimatici. La sospensione cellulare risultante su poli-D-lisina e laminin di placcatura si traduce in una cultura altamente arricchita delle cellule glial submucosal per l'analisi funzionale.
Abstract
Il sistema nervoso enterico (ENS) è costituito da neuroni e cellule gliali enteriche (EGCs) che risiedono all'interno della parete del muscolo liscio, sottomucosa e della lamina propria. EGCs svolgono un ruolo importante nell'omeostasi dell'intestino attraverso il rilascio di vari fattori trofici e contribuire all'integrità della barriera epiteliale. Maggior parte degli studi delle culture primarie di gliale enteriche utilizzare cellule isolate dal plesso mioenterico dopo dissociazione enzimatica. Qui, un metodo non-enzimatici per isolare e cultura EGCs da submucosa intestinale e della lamina propria è descritto. Dopo la rimozione manuale dello strato muscolare longitudinale, EGCs furono liberati dalla lamina propria e sottomucosa utilizzando sequenziale incubazioni tamponata HEPES EDTA seguite da incubazione in soluzione di recupero di cella non enzimatici commercialmente disponibile. Le incubazioni di EDTA sono stati sufficienti per la maggior parte della mucosa epiteliale dalla lamina propria, permettendo la soluzione di recupero di cella liberare il EGCs submucosal della striscia. Qualsiasi residuo di lamina e muscolo liscio è stato scartato insieme glia myenteric. EGCs facilmente sono stati identificati dalla loro capacità di esprimere la proteina silicea fibrillare glial (GFAP). Solo circa il 50% della sospensione delle cellule contenute cellule GFAP + dopo aver completato le incubazioni tessuto e prima della placcatura sul substrato di poli-D-lisina/laminin. Tuttavia, dopo 3 giorni di coltura le cellule in fattore neurotrophic derivato da cellule gliali (GDNF)-contenenti terreni di coltura, la popolazione delle cellule aderenti alle piastre rivestite con substrato composto da > 95% glia enterica. Abbiamo creato una linea di topo ibrido allevando un mouse hGFAP-Cre per la linea di reporter ROSA-tdTomato di monitorare la percentuale di cellule GFAP + usando la fluorescenza delle cellule endogene. Così, non-myenteric glia enterica può essere isolato dai metodi non-enzimatici e coltivata per almeno 5 giorni.
Introduction
Interesse per la funzione delle cellule gliali enteriche (EGCs) sono costantemente aumentata a causa del loro ruolo riconosciuto in intestino l'integrità e l'omeostasi1,2. Inoltre, EGCs variano in base alla loro posizione lungo la lunghezza del tratto GI3,4. EGCs rilasciare vari fattori trofici, compreso il fattore neurotrofico delle cellule gliali (GDNF), contribuiscono a sventrare motilità1,5 e rispondere a sottoprodotti microbici6,7. Gli studi hanno indicato che la popolazione di EGC è eterogenea e che la loro funzione varia a seconda che siano submucosal o risiedono all'interno del plesso mioenterico1,7. Ad esempio, EGCs all'interno del submucosa contribuiscono a giunzioni strette8. Espressione di GFAP e fosforilazione in EGCs differenziale sono stati collegati alla malattia di Parkinson, suggerendo loro possibile legame con il fenotipo di intestino di questo disordine9. Recentemente, è stato osservato che la perdita della proteina nucleare menin in culture isolate di EGCs da submucosa intestinale prossimale era sufficiente per indurre l'espressione dell'ormone gastrina10. Di conseguenza, è stato proposto che EGCs potrebbe essere l'origine dei gastrinomi duodenali, un tipo di tumore neuroendocrino10. Collettivamente, questi esempi sottolineano l'importanza di studiare il comportamento e la funzione di EGCs isolato in disturbi neuropatici e cancro11.
La sfida nel campo rimane come isolare e studiare uno o entrambi EGC popolazioni in vitro. Lignaggio traccia esperimenti hanno dimostrato che EGCs nel submucosa e della lamina propria provengono da cellule progenitrici nel plesso myenteric7. Anche se ci sono parecchi protocolli di isolamento pubblicati disponibili per generare colture di myenteric EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, nessuno è destinato in particolare isolamento della popolazione EGC submucosal/lamina propria. Protocolli esistenti per l'isolamento di EGC, in particolare, utilizzare una combinazione di separazione meccanica o il microdissection del muscolo liscio combinato con dissociazione enzimatica, scartando alla fine lo strato delle cellule della mucosa.
L'obiettivo di questo manoscritto è quello di illustrare i passaggi per isolare non-enzimatico primario EGCs da lamina propria per gli studi in vitro . Poiché non ci sono indicatori che specificamente distinguono myenteric EGCs da quelli nel submucosa, la separazione spaziale della mucosa epiteliale da muscolo liscio è stata sfruttata per isolare EGCs submucosal. Inoltre, combinando chelazione EDTA con dissociazione non enzimatica, EGCs sono stati isolati da sottomucosa in contrasto con il muscolo liscio, che è stato scartato insieme il EGCs inter-myenteric associato. Si è verificato ulteriore separazione della sottomucosa e della lamina propria EGCs coltivando le cellule glial cell-friendly substrati, ad es., poli-D-lisina e laminina.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dalla Commissione dell'Università del Michigan per l'uso e la cura degli animali.
1. preparazione di soluzioni di laminina e Sterile poli-D-lisina (PDL)
- Almeno un giorno prima dell'isolamento delle cellule, preparare poli-D-lisina (PDL) e laminin rivestito di piastre.
Nota: Sia 6 pozzetti e 12-pozzetti piatti erano preparati a seconda degli obiettivi sperimentali. In genere, sono stati utilizzati 12-pozzetti per l'analisi quantitativa mediante western blot; considerando che, in piastre da 6 pozzetti sono state utilizzate per tenere sterilizzato nell'autoclave (sterile) vetrini coprioggetto per immunoistochimica. piastre da 24 pozzetti sono state utilizzate per cultura EGCs per Ca2 + imaging di cambiamento continuo. - Diluire le soluzioni di riserva con il grado di coltura tissutale ultrapura, privo di DNasi e RNAsi-libera dell'acqua in una cappa di coltura del tessuto con aria filtrata HEPA.
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Lamelle di vetro di sterilizzazione
- Tenere il coprioggetto con pinze sterili e immergere i vetrini coprioggetti in un becher di etanolo al 100% per 15 min. Consenti l'etanolo evaporare nella coltura del tessuto cappa e poi posto nella piastre da 6 pozzetti.
- In alternativa, posizionare diverse lamelle individualmente su 2 mm spessore carta assorbente in un contenitore di plastica e poi autoclave.
2. rivestimento piastre
Nota: eseguire questi passaggi sotto cappa a flusso laminare sterili per coltura.
- Scongelare 1 mg/mL di brodo di PDL e diluire 01:10 con acqua grado di coltura del tessuto sterile, in modo che la concentrazione finale è 100 µ g/mL. Uso 2 mL ogni pozzetto per rivestire piastre da 6 pozzetti, 1ml per coprire un pozzetto di una piastra 12-pozzetti e 0,5 mL per un pozzetto delle piastre a 24 pozzetti. Memorizzi il rimanente PDL diluito nelle 12 mL aliquote a-20 ° C.
- Dopo aver lasciato il PDL rivestire i pozzetti per almeno 1 h, rimuovere il PDL con una pipetta sterile. Le piastre per aria, lasciare asciugare completamente sotto cappa a flusso laminare di coltura del tessuto.
Nota: Dopo aver rimosso la soluzione PDL con una pipetta sterile, può essere usato due volte più entro 1 settimana dopo passando attraverso un filtro da 0,22 µm e conservazione a 4 ° C. - Scongelare il brodo laminin sul ghiaccio per evitare la formazione di un gel.
Nota: Non diluito laminin diventa solido quando riscaldato sopra 8 ° C. - Diluire la laminina stock (0,5 mg/mL) 01:50 con sterile di Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) per ottenere una concentrazione finale di 10 µ g/mL. Memorizzi la laminina diluito nelle 12 mL aliquote a-20 ° C.
- Aggiungere laminin diluiti nei pozzetti contenenti secchi PDL. Usare 1 mL per coprire la superficie di 6 pozzetti e 0,5 mL per coprire il fondo delle piastre 12-pozzetti. Per vetrini coprioggetti, aggiungere 400 µ l di laminina diluito a lamelle per ottenere copertura di superficie.
- Incubare le piastre a 37 ° C per 2 h, se la piastra viene utilizzata lo stesso giorno (rivestimento rapido). In caso contrario, sigillare le piastre con involucro di plastica e conservare durante la notte a 4 ° C (rivestimento lento).
Nota: Sigillatura è fondamentale per evitare l'essiccazione e la contaminazione. - Rimuovere la soluzione di laminina accuratamente con una pipetta per evitare di graffiare la superficie. Lavare delicatamente i pozzetti tre volte con DPBS sterile.
- Aggiungere media crescita gliale completa a ciascun bene e mantiene le piastre a 37 ° C fino al momento di aggiungere la sospensione EGC.
Nota: Poly-D lisina e laminin rivestito lastre possono essere conservati per 3 giorni a 4 ° C. Ungere le piastre diversi giorni di anticipo e quindi conservare a 4 ° C, lavare i piatti con DPBS sterile tre volte. Aggiungere 2 mL di DPBS sterile ad ogni pozzetto dopo il lavaggio finale. Sigillare la piastra con parafilm e conservare a 4 ° C. È essenziale per garantire che il laminin non si asciughi.
3. preparazione delle soluzioni di isolamento
- Preparare la soluzione di EDTA/HEPES/DPBS dissociazione. Per 500 mL di soluzione, è necessario utilizzare DPBS sterile (senza calcio e magnesio) per ottenere una soluzione finale di 10 mM HEPES e 5mm EDTA. A 490 mL della DPBS, aggiungere 5 mL di tampone HEPES 1 M e 5 mL di soluzione madre di EDTA 0.5 M. Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Preparare il supporto di risospensione delle cellule glial utilizzando i reagenti elencati nella tabella 1.
- Preparare i supporti di crescita gliale utilizzando i reagenti elencati nella tabella 2.
Nota: Supporto di crescita gliale contenente GDNF possa essere memorizzati per una settimana a 4 ° C.
4. rimozione del segmento intestinale
Topi sono stati ammessi Accesso gratuito per il cibo e l'acqua prima del euthanization dal metodo di caduta di isoflurano e rimozione di un organo vitale. Sono stati utilizzati topi C57BL/6 maggiori di 8 settimane di età. Entrambi i sessi sono stati utilizzati senza notevoli differenze nella preparazione.
- Eutanasia il mouse con un sovradosaggio di isoflurane e posto in posizione supina in un vassoio per dissezione. Appuntare le estremità e sterilizzare l'addome con etanolo al 70%. Tenda la pelle con il forcipe e quindi aprire l'addome con le forbici.
- Sollevare il fegato e identificare il distale dello stomaco/piloro. Quindi rimuovere 7 centimetri di intestino prossimale. Fare attenzione a non lacerare l'intestino.
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Tenere premuto il piloro con forcipe mentre cattura distanza mesentery.
- Utilizzare una dissezione smussa con il dorso della forbice per raschiare via pancreas aderente.
- Inserire il segmento intestinale in DPBS ghiacciata senza Ca2 + o Mg2 + (Figura 1A).
Nota: Altri segmenti dell'intestino o del colon possono essere rimosso anche utilizzando la stessa tecnica.
- Usare una siringa da 5 o 10 mL attaccata ad un ago di 20 G di estremità smussata per scovare il contenuto fecale con ghiaccio freddo DPBS (Figura 1B).
- Dividere l'intestino in segmenti di 3cm per rimuovere il muscolo longitudinale utilizzando la tecnica descritta inizialmente da Smith et al. 12 e modificati nel Sundaresan et al. 10.
Nota: Segmenti intestinali da fino a due topi sono utilizzati per 30 mL di soluzione di isolamento di HEPES/EDTA/DPBS. - Rompere fuori circa 4 cm per separare il bastone di legno dalla punta di cotone. Immergere il bastone di legno in DPBS (Figura 1).
- Infilare uno dei segmenti intestinali senza intoppi sulla chiavetta bagnata (Figura 2A-C).
- Rimuovere il mesentere aderente ancora attaccato utilizzando pinze becchi (Figura 2D).
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Utilizzare una lama di rasoio pulita o bisturi per rendere due Nick longitudinale lungo l'intestino dove il mesentere è stato attaccato (Figura 2E).
- Bagnate la punta di cotone con DPBS. Strofinare la punta di cotone bagnato longitudinalmente lungo il muscolo per allentare longitudinale del muscolo/mienterici (LMMP). Quindi spostare la punta di cotone orizzontalmente per stuzzicare via il LMMP dal muscolo circolare lungo la lunghezza del segmento intestinale durante la rimozione di LMMP.
- Tenere la punta del bastone tra il pollice e l'indice mentre stabilizzando il segmento con il dito medio e quarto (Figura 2F). Al termine, il LMMP si staccano facilmente il segmento intestinale.
- Scartare il LMMP spogliato dal tubo intestinale e collegato al tampone di cotone, a meno che la raccolta di EGCs dal plesso mioenterico è desiderato.
- Utilizzare una lama di rasoio per flay Apri il segmento intestinale in senso longitudinale per togliere il bastone di legno.
- Conservare il tessuto intestinale spogliato (prevalentemente mucosa e sottomucosa più muscolo circolare) in DPBS sul ghiaccio. Ripetere i passaggi 4.4 – 4,11 per tutti i segmenti intestinali sono preparati.
5. rimozione della Mucosa epiteliale
- Tagliare l'intestino in piccoli pezzi di ~0.5 cm con forbice.
- Posizionare il tessuto in una provetta conica per centrifuga sterile 50 mL contenente 30 mL di soluzione di EDTA/HEPES/DPBS ghiacciata.
- Roccia la soluzione contenente tessuto a 4 ° C per 10 min a ~ 60 si inclina al minuto.
- Inumidire preventivamente una pipetta di plastica da 5 mL pipettando il buffer EDTA/HEPES/DPBS su e giù per una sola volta e quindi utilizzare la pipetta pre-umidificata per pipettare il tessuto e tampone sospensione su e giù (triturazione) 20 volte per sloggiare il mucosa epiteliale.
- Raccogliere il tessuto dall'incubazione di EDTA versando il composto attraverso un colino di cella di 100 µm in nylon. Scartare il torbido muco-riempita flusso continuo (Figura 3).
- Posizionare il tessuto conservato nel colino in una nuova provetta conica per centrifuga di 50 mL contenente 30 mL di ghiaccio freddo EDTA/HEPES/DPBS utilizzando pinze becchi.
- Ripetere l'incubazione di EDTA/HEPES/DPBS una seconda volta da dondolo il tessuto a 4 ° C per 10 min a ~ 60 si inclina al minuto per rimuovere disattivare ulteriore mucosa epiteliale.
- Inumidire preventivamente una pipetta da 5 mL con il buffer e quindi dispensare la sospensione di tessuto su e giù per 20 volte per sloggiare le cellule mucose.
Nota: Il tessuto tende a bastone all'interno della pipetta come più dell'epitelio viene rimosso. - Raccogliere il tessuto dopo la seconda incubazione versando il composto attraverso un colino di cella in nylon di 100 µm e scartare il flusso attraverso. Il secondo passaggio dovrebbe essere notevolmente meno torbido rispetto alla prima (Figura 3).
- Ripetere le incubazioni di EDTA 10 min fino a quando la soluzione è quasi chiaro (incubazioni di circa 3 o 4 a seconda della quantità di tessuto e l'efficacia della triturazione) (Figura 3).
6. raccolta di cellule gliali enteriche dalla Lamina Propria e sottomucosa
- Trasferire il tessuto dal filtro in nylon in una provetta conica per centrifuga 15 mL contenente 5 mL della soluzione di recupero cellulare disponibile in commercio e rock per 25-30 min a 4 ° C.
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Triturare delicatamente 10x per dissociare le cellule di gliale enteriche da lamina propria.
- Filtrare su un filtro di 40 µm e raccogliere il filtrato in una provetta pulita 50 mL.
- Sciacquare il tessuto sul filtro in nylon con 1 mL di DPBS.
- Scartare il tessuto e trasferire i ~ 5 – 6 mL del filtrato in una provetta conica per centrifuga pulito da 15 mL.
- Girare il filtrato a 2.000 x g in una centrifuga di Benna oscillante per 5 min a 4 ° C.
- Risospendere il pellet contenente delle cellule gliale in almeno 1 mL di tampone di risospensione pipettando delicatamente la pallina su e giù con una punta di pipetta 500 µ l. Evitare l'introduzione di bolle.
Nota: Regolare il volume di risospensione per il numero di pozzi e piastre. Ad esempio, 1,2 mL per una piastra a 6 pozzetti; 2,4 mL per due piastre da 6 pozzetti; 2,4 mL per una piastra 12-pozzetti. - Dispensare 200 µ l di sospensione cellulare in ciascun pozzetto del 6 pozzetti o 100 µ l per un PDL-laminina rivestito a 12 pozzetti contenenti glial crescita media.
- Non disturbare i piatti dopo aver aggiunto le cellule per le piastre e immissione nell'incubatore 37 ° C per consentire il massimo numero delle cellule di aderire.
Nota: Una preparazione sana delle cellule verrà allegare all'interno di 6 – 8 h ma attendere almeno 24 ore prima di cambiare i media pipettando delicatamente fuori i media insieme a cellule non aderenti. - Utilizzare le celle per gli esperimenti di 3 – 4 giorni dopo che essi sono posti in coltura (Figura 4). Eseguire analisi immunofluorescente usando gli anticorpi di interesse per specifiche proteine marker (tabella 3). Ad esempio, GFAP, S100b e p75NTR o Sox10 è stata usata qui. E-caderina o anticorpi dell'actina del muscolo liscio alfa sono stati utilizzati per valutare il grado di contaminazione da altri tipi di cellule.
7. immunofluorescenza colorazione
- I media fuori le culture di aspirare e lavare due volte con PBS.
- Difficoltà le culture per 20 min a temperatura ambiente con paraformaldeide al 4%.
- Rimuovere il fissativo e poi lavare 3 volte con PBS.
- Permeabilize le cellule con PBS contenente 0,2% Triton X-100 a temperatura ambiente.
- Incubare le cellule permeabilized con soluzioni blocchi composto da anti-pollo IgY, anti-coniglio o anti-IgG di topo per 2 h a temperatura ambiente.
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Incubare le cellule con anticorpi primari durante la notte, per esempio, GFAP (1:1, 000).
- Sciacquare le cellule 3 volte con PBS. Se l'esecuzione di colocalizzazione procedere a passo 7.7.
- Incubare la prossima serie di anticorpi primari per almeno 2 ore a temperatura ambiente, ma preferibilmente durante la notte a 4 ° C. Utilizzare una diluizione di 1: 1000 di coniglio anti-S100 o una diluizione di 1: 500 di topo anti-p75NTR.
Nota: Tutti gli anticorpi vengono diluiti in PBS. - Sciacquare le cellule 3 volte con PBS per rimuovere gli anticorpi primari. Incubare le cellule risciacquate con gli anticorpi secondari etichetta fluorescente appropriati per 2 h a temperatura ambiente (tabella 3).
- Lavare 3 volte con PBS per rimuovere gli anticorpi secondari.
- Montare i vetrini coprioggetti sui vetrini utilizzando 1-2 gocce di mezzi di montaggio con DAPI e Mostra le cellule sotto un microscopio a fluorescenza.
8. flusso Cytometry
- Rimuovere le cellule gliale aderenti per citometria a flusso, risciacquando le cellule una volta con DPBS e quindi aggiungere 0,25% tripsina-EDTA secondo il protocollo del produttore. Incubare le cellule nella soluzione a 37 ° C per 3 min. Terminate la digestione della tripsina-EDTA raccogliendo le cellule nei media di crescita delle cellule di glial completa.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 400 x g per 5 min e quindi risospendere le cellule in PBS.
- Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 min e poi permeabilize con 0,2% Triton X-100 in PBS come descritto nel punto 7.4.
- Bloccare le cellule con PBS contenente BSA 1% e l'immunoglobulina specifica del tessuto per 20 min, per esempio, asino anti-pollo IgY (IgG) (H + L) (1:1, 000) o asino anti-capra IgG (H + L) (1:1, 000).
- Incubare le cellule con gli anticorpi primari GFAP (1:2, 000), E-caderina (1: 400), l'actina del muscolo liscio come α (1: 500) o PGP 9.5 (1: 500) durante la notte a 4 ° C.
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Lavare via l'anticorpo con PBS.
- Incubare il complesso antigene-anticorpo con anticorpi secondari fluorescente contrassegnati incubati a temperatura ambiente per 30 min.
- Utilizzare un'aliquota separata di cellule incubate con anticorpo secondario per servire come il controllo di isotipo. Entrambe le popolazioni delle cellule sono lavate e risospesi in PBS prima della citometria a flusso.
- Analizzare le due popolazioni di cellule su un citometro a flusso di gating su cellule vive.
9. preparazione del Mouse tessuti dalla hGFAP-Cre:tdTomato topi
Nota: Il cDNA di Lox-STOP-Lox-tdTomato è espresso dal ROSA locus22,23 (Jackson Labs, #007914) e genera endogeno fluorescenza quando allevato per un mouse che esprimono la Cre ricombinasi (hGFAP-Cre). Analisi in situ viene eseguita mediante la generazione di sezioni di tessuto congelato.
- Difficoltà tessuto intestinale in paraformaldeide al 4% per 1 h e quindi disidratare una notte in 1 M saccarosio in PBS.
- Incorporare il tessuto in commercialmente acquistato tessuto di taglio ottimale (OCT) composto composto da 10% di alcool polivinilico e 4,2% polietilene glicole e poi lo snap congelamento in azoto liquido.
- Preparare 5 µm cryosections e poi montare utilizzando un antifade montanti con DAPI.
- Per citometria a flusso, preparare EGCs dalla hGFAP-Cre:tdTomato+ topi come descritto ai punti 4.1 – 6,5.
- Tripsinizzano le cellule dalla piastra dopo 3 giorni nelle colture in passo 8.1 e quindi difficoltà per 10 min in paraformaldeide al 4%.
- Analizzare le cellule isolate da topi Cre negativo in parallelo con cellule isolate dalla hGFAP-Cre:tdTomato+ topi su un citometro a flusso.
Nota: I cancelli sono stati costruiti per evitare i detriti e le cellule morte.
10. Ca2 + Imaging di flusso
- Incubare EGCs placcato su una piastra a 24 pozzetti con 3 µM Fluo-4-AM a 37 ° C per 30 min.
- Immagine il segnale di Ca2 + in soluzione di Tyrode commercialmente acquistati utilizzando un microscopio confocale del disco rotante e una lunghezza d'onda di eccitazione di 480 nm (F480) dopo l'aggiunta del peptide CCK o gastrina. Analisi delle immagini è stata segnalata in Sundaresan et al. 10 .
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Representative Results
Le preparazioni sono state considerate infruttuosi se cellule GFAP + non aderire e diffondere all'interno di 24 h (Figura 4A). Il numero di cellule gliali non potrebbe essere determinato fino a dopo 24 h quando le cellule hanno aderito e hanno mostrato la prova della diffusione in aggregati piatti (Figura 4B). Celle al bordo dei cluster tendevano ad estendere i processi lunghi ed espresso classici marcatori gliali, ad es., GFAP, S100b e p75NTR (Figura 4, 4D)10,16. Di giorno in giorno 2nd , cellule gliali aderito strettamente alla superficie consentendo alla popolazione non aderente venire risciacquata via con PBS. La maggior parte delle cellule galleggianti erano epiteliale e della lamina propria cellule insieme a detriti cellulari. La presenza di questi ciuffi di cella flottante ridotto il rendimento delle cellule gliale aderenti, sottolineando l'importanza di effettuazione le incubazioni di EDTA, fino a quando il passaggio è quasi chiaro, segnalazione che le cellule epiteliali sono stati rimossi dalla lamina propria base. Inoltre, centrifugazione a velocità inferiore a 1.500 x g dopo incubazione della soluzione di recupero cellulare non efficacemente raccogliere tutte le cellule vitali in una pallina che conduce alla diminuzione della resa. In genere, 40.000 a 100.000 cellule morfologicamente costanti con EGCs attenuti dal giorno 3 nella cultura.
L'analisi di Immunohistochemical con gli anticorpi glial-collegata, indicato che la cella cluster che è rimasto aderente dal giorno 3 erano GFAP, S100b e Sox 10 positivo10,16 (Figura 5A). Nello studio corrente, questo stesso grado di purezza è stato osservato permeabilizing le cellule e l'analisi di citometria a flusso (figura 5B-F). Immediatamente dopo aver isolato cellule gliali submucosal/Lamina propria, citometria a flusso ha rivelato che circa il 51% delle cellule erano GFAP + (figura 5B), suggerendo la presenza di tipi di cellule GFAP-negativi, ad esempio, epiteliali, ematopoietiche, cellule endoteliali, neuronali, myofibroblasts conosciuta per esistere nell'epitelio e la lamina propria. Dopo 3 giorni in coltura, il numero di cellule GFAP + rappresentava oltre il 95% della popolazione cellulare analizzata dopo aver rimosso il supporto originale, risciacquo delicatamente con PBS e quindi aggiungendo fresco media (Figura 5). Interessante, l'analisi di flusso ha rivelato ad alta e bassa popolazioni che esprimono proteina GFAP (Figura 5). Infatti, l'analisi immunofluorescente delle cellule ha rivelato che la periferia dei cluster tendeva a esprimere i livelli elevati di GFAP (Figura 4, 4D). Presi insieme, i due tipi di analisi potrebbero indicare le differenze nello stato di maturità o differenziazione di EGC. Collettivamente, la percentuale di α-SMA + (indicatore di cella myofibroblast), E-caderina + (marcatore delle cellule epiteliali) e Pgp 9.5 + cellule (marcatore di un neurone delle cellule) era inferiore al 5% (Figura 5-F). Questi risultati erano costanti con lo studio preliminare effettuato mediante etichettatura immunofluorescente di EGCs risultati circa il 93% GFAP + cellule 10. L'analisi del flusso sottolinea l'importanza di permettere alle cellule di aderire alle piastre, poiché esso permette la rimozione di contaminanti popolazioni di cellule che comprende circa il 5% delle colture.
Un obiettivo di questo studio era quello di utilizzare un reporter di GFAP-attivata per facilitare la citometria a flusso delle cellule per ulteriori analisi e per confrontare il grado di arricchimento di EGC utilizzando un marcatore fluorescente endogeno (Figura 6). La linea di mouse hGFAP-Cre è stato originariamente descritto da Messing e colleghe 20. In breve, la ricombinasi Cre è stato disposto sotto il controllo di 2,2 kb del promotore umano proteina acida fibrillare glial (hGFAP). Così, qualsiasi cella trascrivere questo promotore hGFAP espresso il reporter fluorescente rosso tdTomato. La popolazione delle cellule etichettata con il reporter di tdTomato era visualizzata in situ utilizzando sezioni congelate dell'intestino e del colon (Figura 6A, 6B) prima di eseguire le procedure di isolamento di EGC sopra descritte. Dopo l'esecuzione l'isolamento di recupero di EDTA/delle cellule e coltura delle cellule per 3 giorni, EGCs da questi topi erano facilmente identificati dai loro fluorescenza endogena (Figura 6). Anche se le cellule GFAP + probabilmente sono più numerosi nell' intestino prossimale4,21, tdTomato + EGCs inoltre sono stati osservati nel colon (Figura 6B). Anche utilizzando il reporter fluorescente tdTomato+ attivato da hGFAP-Cre ha rivelato una popolazione bimodale di hGFAP-tdTomato + cellule (Figura 6) come osservato utilizzando l'analisi immunofluorescente di GFAP proteina (Figura 5). Anche se è stato segnalato che non tutte le EGCs express GFAP proteina4, questo punto potrebbe riflettere le differenze nel livello di espressione di GFAP. In media, circa il 66% delle cellule analizzate hanno esibito il massimo livello di tdTomato di fluorescenza. Pertanto, il protocollo di recupero di EDTA/cella potrebbe essere utilizzato per isolare sottoinsiemi di EGCs in tutto l'intestino tenue e colon etichettati dal reporter per esaminare le differenze nell'espressione genica.
Questo protocollo generato un numero sufficiente di cellule gliali GFAP + relativamente pure per gli studi biochimici e analisi western blot 10. per dimostrare la reattività delle cellule gliali, una preparazione di 3 giorni delle cellule gliali è stata trattata con la colecistochinina degli ormoni (CCK) o la gastrina per indurre il cambiamento continuo di Ca2 + (figura 7A-7B)10. I risultati hanno mostrato che queste cellule GFAP + aderente ha risposto agli agonisti extracellulari dimostrando la loro capacità di esporre funzione gliali enterico conosciuta.
Figura 1: Set up e preparazione degli intestini mouse. (A) immagine di isolamento impostare su ghiaccio tra cui estratti gli intestini. (B) foto di 5 mL-siringa collegata ad un ago smussato fine 20 G per scovare il contenuto fecale. (C) Engineered fine di un tampone di cotone in legno (~ 4 cm) ammollo nel buffer DPBS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: procedura utilizzata per pulire gli intestini e rimuovere longitudinale del muscolo/mienterici (LMMP). (A-C) Scorrevole in un segmento intestinale su un bastone di legno bagnato. (D) rimozione del mesentery aderente. (E) intaccare l'intestino con una lama di rasoio. (F) rimuovendo il LMMP con un batuffolo di cotone umido. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: flusso sequenziale-through dopo le incubazioni EDTA. Vengono mostrati esempi di flow-through da 4 incubazioni sequenziale utilizzando 7cm tre segmenti intestinali incubate per 10 min con 5 mM EDTA / 10mM HEPES in DPBS e quindi il triturato 20 volte. Rappresentante flow-through dopo aver versato attraverso un setaccio di maglia di nylon 100 µm sono mostrati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: EGC immagini 24h dopo il placcaggio. Luce l'esame al microscopio delle cellule sedimento 24h dopo il placcaggio. (A) indicato è un esempio rappresentativo di una preparazione povero risultati galleggiante delle cellule epiteliali ciuffi (freccia) e detriti. Nessun aderente EGCs sono stati osservati dopo 24 h. (B) indicato è un esempio rappresentativo di un'eccellente preparazione 24h dopo l'isolamento delle cellule e la risospensione in cui le patch di EGCs aderirono al PDL/Laminin piastre rivestite. Immagini sono state catturate su un microscopio invertito a fluorescenza con una fotocamera digitale. Scala bar = 500 µm (A-B). (C) vista di alto potere di una patch di cellule EGC macchiato con l'anticorpo GFAP (verde) mostrando le cellule alla periferia con una maggiore intensità di etichettatura. Molte delle cellule ha mostrato i nuclei doppi (blu freccia, DAPI,). (D) colocalizzazione di GFAP (verde) con S100 (rosso) o p75NTR (rosso). Scala bar = 20 µm (C-D). Le celle sono stati montati con un reagente antifade e DAPI (nuclei di blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: flusso cytometry delle cellule glial enteriche isolato da perfusiona lamina propria del mouse adulto. (A) immunofluorescenza di GFAP, S100B e Sox10 sulle culture EGC dopo 3 giorni. Le frecce indicano Sox 10 nuclei positivi. Scala bar = 20 µm (usato con il permesso di Sundaresan et al. 10). le cellule positive (B) percentuale di GFAP prima placcatura su piastre (l'intensità di fluorescenza (o forward scatter, asse x) versus scatter laterale (asse y). (C) percentuale di Pgp 9.5 cellule positive 3 daysafter placcatura e GFAP positivo (D) α-SMA positiva (E) E-caderina positivo (F). Cancelli sono stati costruiti per evitare i detriti e le cellule morte. Viene mostrato la percentuale media della popolazione fluorescente rispetto al numero di cellule (dispersione laterale). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Identificazione delle cellule glial enteriche isolato da perfusiona lamina propria della Cre-hGFAP+: topo adulto tdTomato+ . TdTomato endogeno fluorescente (rosso) immagini sono state catturate su un microscopio fluorescente del contrasto di fase con una fotocamera digitale nell'intestino (A). (inserto) Idem come A tranne fusa con immagine DAPI (nuclei di blu). (B) Colon si fuse con DAPI. (C) Enteric cellule gliali (rosso) isolate da hGFAP-Cre:dtTomato+ topi e colta per 3 giorni su substrato di PDL/Laminin. Scala bar = 50 µm. (D) analisi citofluorimetrica delle cellule tdTomato. Viene mostrato il medio % di GFAP + cellule ± SEM per 3 diverse preparazioni (3 topi per prep). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Video del Ca2 + flussi dopo trattamento ormonale. EGCs placcato su 24 pozzetti PDL e laminin rivestito lastre sono state coltivate nei media crescita gliale per 3 giorni. Le cellule sono state pre-caricate con 3 µM di Fura-2-AM per 20 min a 37 ° C e quindi sono stati trattati con (A) 100 nM colecistochinina (CCK) o (B) 100 gastrina nM. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
| Componenti | Volume da aggiungere | Concentrazione finale |
| DMEM/F12 | 44,5 mL | _ |
| Siero bovino fetale (FBS) | 5 mL | 10% |
| Penicillina-streptomicina | 500 Μ l | 100 UI/mL penna |
| Streptomicina | 100 µ g/mL Strep | |
| Gentamicina (50 mg/mL di brodo) | 20 Μ l | 20 µ g/mL |
Tabella 1: Composizione media di risospensione delle cellule gliali.
| Componenti | Volume da aggiungere | Concentrazione finale |
| DMEM/F12 | 44 mL | _ |
| Siero bovino fetale (FBS) | 5 mL | 10% |
| Penicillina-streptomicina (100x) | 500 Μ l | 100 UI/mL (Pen) |
| 100 µ g/mL (Strep) | ||
| Gentamicina (50 mg/mL di brodo) | 20 Μ l | 20 µ g/mL |
| GDNF (10 µ g/mL di brodo) | 50 Μ l | 10 ng/mL |
| L-Glutammina (stock di 200 mM) | 500 Μ l | 2 mM |
Tabella 2: Composizione dei terreni di coltura delle cellule gliali.
| Componenti | Diluizione di immunofluorescenza | Diluizione a flusso Cytometry |
| Pollo anti-GFAP | 1 a 500 | 1 a 2000 |
| Rabbit anti-S100 | 1 a 500 | 1 a 500 |
| Mouse anti-p75 NTR | 1 a 500 | 1 a 500 |
| Capra anti-E-caderina | 1-400 | |
| Mouse anti-PGP 9.5 | 1 a 500 | |
| Capra anti-un-liscia del muscolo actina | 1 a 500 | |
| Alexa Fluor 488 capra anti-pollo IgY | da 1 a 1000 | da 1 a 1000 |
| Alexa Fluor 568 IgG di capra anti-topo | da 1 a 1000 | da 1 a 1000 |
| Alexa Fluor 594 asino di anti-coniglio IgG | da 1 a 1000 | |
| Alexa Fluor 488 asino anti-capra IgG | da 1 a 1000 |
Tabella 3: Elenco degli anticorpi
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Discussion
EGCs svolgono un ruolo importante nell'omeostasi dell'intestino, ed è essenziale per isolare e studiarle in vitro. In questo protocollo, un metodo semplice per l'isolamento di EGCs da lamina propria dell'intestino topo adulto è stata introdotta per studiare la funzione gliali enterico.
Rimuovendo il mesentere aderente e LMMP con un tampone di cotone rimuove alcune delle glia inter-myenteric che risiedono tra il muscolo longitudinale e circolare, aumenta l'accessibilità dei buffer alla superficie submucosal e rimuove gran parte dei capillari più grandi . Quest'ultimo riduce il numero di globuli rossi, contaminando le culture finale. La serie di incubazioni di EDTA spogliare la mucosa epiteliale esponendo la lamina propria e sottomucosa glia, che può essere fragile dopo esposizione alle soluzioni chelanti. Agitazione mediante agitazione, Vortex o triturazione (ripetitivo su e giù per il pipettaggio) deve essere eseguita con attenzione e a tempo per evitare danni eccessivi alle cellule. Triturazione è stata usata qui perché la tecnica ha provocato una resa più coerenza delle cellule glial aderente, vitale. Agitazione tendevano a introdurre bolle e ridurre la vitalità cellulare valutata morfologicamente da aderenza delle cellule per le piastre rivestite. Il tessuto deve essere tagliato in pezzi < 0,5 cm per triturare efficacemente il tessuto con la pipetta 5ml.
Generalmente, è sufficiente per generare abbastanza EGCs per coprire una piastra a circa 20 – 30% 6 segmenti 7 cm da almeno 3 topi confluency, che può quindi essere utilizzato per immunocitochimica e qPCR. Tuttavia, più celle potrebbero essere necessarie per metodi biochimici quali macchie occidentali a seconda del livello di espressione del gene studiato. Anche se, tipo 1 collagene o Matrigel è stata brevemente esaminata come alternativa al substrato di poli-D-lisina/Laminin, maggior aderenza della popolazione delle cellule epiteliali è stata osservata, in definitiva crescente contaminazione delle culture EGC con altri tipi di cellule . Inoltre, collagene di tipo 1 non aderiscono saldamente alle piastre e facilmente è stato sloggiato dalla superficie quando si modificano i media. La fibronectina è un altro substrato che è stato usato24, ma non è stato testato qui. Laminina apparentemente migliora l'associazione e differenziazione della cresta neurale derivato cellule25. Tuttavia, ci sono un sacco di laminina può variare, un impatto di aderenza e rendimenti delle cellule. Contaminazione microbica delle culture si è verificato circa il 5% del tempo ed è stata mantenuta al minimo mediante l'uso di reagenti sterili, tecnica e antibiotici. Uso del reagente antifungino era facoltativa.
La limitazione principale del protocollo qui è la standardizzazione dell'agitazione per rimuovere l'epitelio senza danneggiare la sottostante EGCs. Inoltre, la preparazione non può essere accertato immediatamente dato che dipende l'aderenza delle cellule per le piastre rivestite. Tre aree di concentrarsi sulla risoluzione dei problemi comprendono: 1) uso di fresco PDL e laminin per rivestire le piastre; 2) ridurre il tempo da dissezione ad inizio le incubazioni di EDTA aumentando il numero degli assistenti; 3) quantificare il tempo e il metodo utilizzato per agitare il tessuto per rimuovere efficacemente l'epitelio e quindi il EGCs. Estendere il tempo in uno di questi passaggi aumenta la fragilità EGC e la probabilità che essi non si riprenderà quando placcato in crescita media. Anche se il metodo di triturazione per dissociare l'epitelio è stato usato qui, agitazione e Vortex inoltre sono stati provati con risultati incoerenti forse perché è più operatore dipendente e difficili da quantificare. Una volta placcato il rendimento delle celle aderenti era maggiore se le cellule non sono state disturbate per 16 – 24 h.
Il metodo presentato qui è stato modificato secondo lo studio originale da Smith et al. 12, che si è concentrata su isolando il LMMP. L'approccio di Smith è stato usato qui solo per rimuovere e scartare la LMMP modo che la maggior parte delle cellule gliale isolate sarebbe provengono da submucosa e della lamina propria. Inoltre, senza digestione enzimatica, la EGCs myenteric non sono prontamente liberato12. Tuttavia, poiché ci sono marcatori specifici per myenteric contro glia submucosal, può escludere la presenza di cellule gliali dal plesso mioenterico inter. Rosenbaum et al ha segnalato l'analisi cytometric di flusso di EGCs espressione della proteina fluorescente verde avanzata (EGFP) dal promotore hGFAP. Hanno usato molto giovani topi (postnatale giorno 7) e isolato EGCs dall'intero intestino dalla digestione enzimatica19. Inoltre, l'analisi cytometric di flusso è stato effettuato dopo due settimane di mantenere condizioni che neurosphere digalleggiante formazione promossa. Anche se gli autori hanno segnalato che la neurospheres altamente espressi sia GFAP e S100b, gli aggregati di cellule galleggianti anche fortemente espresso α-SMA, suggerendo che espansione della popolazione cellulare myofibroblast incoraggiato lo sviluppo gliosphere al contrario alla morfologia piatta foglio-come descritta qui. Pertanto, mentre interessante, lo studio non è direttamente paragonabile al presente protocollo. Al contrario, la morfologia delle cellule accoppiato con significativamente meno α-SMA + cellule suggeriscono che il EGCs descritti nel presente protocollo non esibiscono la morfologia 3-dimensionale durante il periodo di coltura di 3 ai 5 giorni. Tuttavia, il protocollo qui e il metodo di Rosenbaum è possibile utilizzare un reporter fluorescente per identificare e isolare cellule GFAP + che miglioreranno la capacità del ricercatore di vivere cella profilatura.
In conclusione, l'attuale protocollo descrive l'isolamento delle cellule glial enteriche da submucosa utilizzando un approccio non-enzimatici. L'intero protocollo prende circa 3 h dalla dissezione del mouse per placcatura iniziale sulle piastre di coltura tissutale prepatinato. Più tempo passo intensivo nel protocollo è la rimozione e la preparazione dell'intestino per la prima incubazione di EDTA. Preparare le piastre e l'archiviazione in DPBS è fortemente raccomandato. Il successo della preparazione dipende la rimozione efficiente dell'epitelio senza danneggiare la sottostante EGCs e aderenza alle piastre PDL/Laminin rivestito all'interno di 24 h. primaria EGCs sono utili per gli studi in vitro quali analisi biochimica, Flussi di CA2 + e adenovirali transfezioni10. Si prevede che la capacità di isolare EGCs da sottomucosa o il LMMP permetterà ulteriori studi per definire le differenze nelle proprietà di crescita, la differenziazione e la morfologia utilizzando approcci intero genoma EGC.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano riconoscere sostegno da DK045729 R37 (a JLM), AR060837 R01 (a HX) e l'Università del Michigan gastrointestinale Research Center molecolare Core P30 DK034933.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D lysine (1 mg/mL stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/mL stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5 M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50 mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 |
References
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