Summary
Hier beschrijven we de isolatie van darmen-gliale cellen uit de intestinale submucosa-sequentiële EDTA incubations met divalente kationen en vervolgens incubatie in de oplossing van de gegevensterugwinning van de niet-enzymatische cel chelaat. De resulterende celsuspensie op poly-D-lysine en laminin plating resulteert in een sterk verrijkt cultuur van submucosal gliacellen voor functionele analyse.
Abstract
De darmen zenuwstelsel (ENS) bestaat uit neuronen en darmen gliale cellen (EGCs) die zich binnen de gladde spieren muur, de submucosa en de lamina propria bevinden. EGCs spelen een belangrijke rol in de homeostase van de darm door de vrijlating van verschillende trofische factoren en bijdragen tot de integriteit van de epitheliale barrière. De meeste studies van primaire darmen gliale culturen cellen geïsoleerd van de plexus myenteric na enzymatische dissociatie gebruiken. Hier, wordt een niet-enzymatische methode te isoleren en cultuur EGCs van de intestinale submucosa en de lamina propria beschreven. Na handmatige verwijdering van de Musculus longitudinalis laag, werden EGCs bevrijd van de lamina propria en de submucosa, met behulp van opeenvolgende HEPES-buffer EDTA incubations gevolgd door incubatie in de oplossing van de gegevensterugwinning van de verkrijgbare niet-enzymatische cel. De incubations EDTA volstonden om te strippen allermeest naar de epitheliale mucosa uit de lamina propria, waardoor de oplossing van de gegevensterugwinning cel te bevrijden van de submucosal EGCs. Eventuele resterende lamina propria en gladde spieren werd verwijderd samen met de myenteric-glia. EGCs waren gemakkelijk geïdentificeerd door hun vermogen om te uiten gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP). Slechts ongeveer 50% van de celsuspensie bevatte GFAP + cellen na het voltooien van weefsel incubations en voorafgaand aan plating op het poly-D-lysine/laminin substraat. Echter na 3 dagen voor het kweken van de cellen in gliale cel-afgeleide neurotrophic factor (GDNF)-met cultuurmedia, de bevolking van de cel vast te houden aan de substraat-gecoate platen bestaat uit > 95% darmen glia. We een hybride muis lijn gemaakt door het fokken van een hGFAP-Cre muis om de lijn van de verslaggever ROSA-tdTomato voor het bijhouden van het percentage van GFAP + cellen met behulp van endogene cel fluorescentie. Dus, niet-myenteric darmen glia kan worden geïsoleerd door niet-enzymatische methoden en gekweekte gedurende ten minste 5 dagen.
Introduction
Interesse in de functie van de darmen gliale cellen (EGCs) is gestaag toegenomen als gevolg van hun erkende rollen in de darm integriteit en homeostase1,2. EGCs is bovendien afhankelijk van hun locatie langs de lengte van de GI tract3,4. EGCs release verschillende trofische factoren, met inbegrip van gliale cel-afgeleide neurotrophic factor (GDNF), bijdragen tot de darm motiliteit1,5 en reageren op microbiële bijproducten6,7. Studies hebben aangegeven dat de EGC populatie heterogeen is en dat hun functie is afhankelijk van of ze submucosal zijn of zich bevinden binnen de myenteric plexus1,7. Bijvoorbeeld, bijdragen EGCs binnen de submucosa aan strakke kruispunten8. Differentiële expressie van het algemeen kaderakkoord voor vrede en fosforylatie in EGCs zijn gekoppeld aan de ziekte van Parkinson, suggereren hun mogelijke link naar het fenotype van de darm van deze stoornis9. Onlangs, werd naar voren gebracht dat het verlies van de nucleaire eiwit menen in geïsoleerde culturen van EGCs van de proximale intestinale submucosa voldoende was voor het opwekken van expressie van het hormoon gastrine10. Dientengevolge, werd voorgesteld dat EGCs zou de oorsprong van duodenale gastrinoom, een soort neuro-endocriene tumor10. Collectief, onderstrepen deze voorbeelden het belang van het bestuderen van het gedrag en de functie van geïsoleerde EGCs in neuropatische aandoeningen en kanker11.
De uitdaging op het gebied blijft hoe te isoleren en bestuderen een of beide EGC populaties in vitro. Lineage trace experimenten aangetoond dat EGCs in de submucosa en de lamina propria zijn afkomstig uit voorlopercellen in de plexus myenteric7. Hoewel er verschillende gepubliceerde isolatie protocollen die beschikbaar zijn voor het genereren van de culturen van myenteric EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, geen specifiek gericht op isolatie van de submucosal/lamina propria EGC bevolking. Bestaande protocollen voor EGC isolatie meer specifiek gebruiken een combinatie van de mechanische scheiding of de microdissection van de gladde spieren gecombineerd met enzymatische dissociatie, uiteindelijk de mucosal cellaag teruggooi.
Het doel van dit manuscript is om aan te tonen de stappen voor het niet-enzymatisch isoleren primaire EGCs uit de lamina propria voor in vitro studies. Aangezien er geen markeringen die specifiek onderscheid myenteric EGCs in de submucosa, was de ruimtelijke scheiding van de epitheliale mucosa van de gladde spieren benut om submucosal EGCs isoleren. Bovendien, door het combineren van EDTA chelatie met niet-enzymatische dissociatie, waren EGCs geïsoleerd uit de submucosa in tegenstelling tot de gladde spieren, die samen met de bijbehorende inter-myenteric EGCs werd verworpen. Verdere scheiding van de submucosa en de lamina propria EGCs opgetreden door het kweken van de cellen gliale cel-vriendelijke substraten, bijvoorbeeld, poly-D-lysine en laminin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven beschreven werden goedgekeurd door de Universiteit van Michigan, en de Commissie over het gebruik en de verzorging van dieren.
1. bereiding van steriele Poly-D-lysine (PDL) en Laminin oplossingen
- Ten minste één dag voorafgaand aan de isolatie van de cel, poly-D-lysine (PDL) en laminin gecoate platen voorbereiden.
Opmerking: Zowel 6-well en 12-well platen bereid waren afhankelijk van de experimentele doelen. Typisch, 12-Wells-platen werden gebruikt voor de kwantitatieve analyse met behulp van westelijke vlekken; Overwegende dat, met het 6-Wells-platen werden gebruikt om gesteriliseerde met autoclaaf (steriele) coverslips voor immunohistochemistry. 24-Wells-platen werden gebruikt om cultuur EGCs voor Ca2 + flux imaging. - Verdun voorraadoplossingen met ultrazuiver weefselkweek rang, DNase-vrij en RNase-gratis water in een weefselkweek kap met air HEPA-gefilterd.
-
Steriliseren van glas coverslips
- Houd het dekglaasje aan met steriel pincet en coverslips in een bekerglas van 100% ethanol voor 15 min. toestaan de ethanol te verdampen in de weefselkweek kap en vervolgens in de 6-Wells-platen onderdompelen.
- Als alternatief, verschillende coverslips individueel op plaatsen 2 mm dikke Vloeipapier in een plastic container en vervolgens autoclaaf.
2. coating platen
Opmerking: deze stappen onder de motorkap van een steriele weefselkweek laminaire flow uitvoeren.
- 1 mg/mL PDL voorraad ontdooien en 1:10 met steriel, weefselkweek rang water verdunnen, zodat de eindconcentratie 100 µg/mL is. Gebruik 2 mL per putje jas 6-Wells-platen, 1 mL ter dekking van een putje van de plaat van een 12-well en 0,5 mL voor een goed in de 24-Wells-platen. Opslaan van de resterende verdunde PDL in 12 mL aliquots bij-20 ° C.
- Verwijder na het toestaan van de PDL jas de putten voor ten minste 1 uur, de PDL met een steriele pipet. Laat de platen in de lucht droog is geheel onder de motorkap van een weefselkweek laminaire flow.
Opmerking: Na het verwijderen van de PDL-oplossing met een steriele Pipet, het kan worden gebruikt in tweemaal meer binnen 1 week na het passeren van een 0,22 µm filter en opslaan bij 4 ° C. - Ontdooi de voorraad van de laminin op het ijs om te voorkomen dat de formatie van de gel.
Opmerking: Onverdund laminin wordt stevig wanneer verwarmd boven de 8 ° C. - Verdun de laminin voorraad (0,5 mg/mL) 1:50 met steriele Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) om een eindconcentratie van 10 µg/mL. Winkel de verdunde laminin in 12 mL aliquots bij-20 ° C.
- Voeg verdunde laminin de putjes met gedroogde PDL. Gebruik 1 mL ter dekking van het oppervlak van de 6-well en 0,5 mL ter dekking van de onderkant van de 12-Wells-platen. Voor coverslips, voeg toe 400 µL van verdunde laminin aan de coverslips tot dekking van de oppervlakte.
- Incubeer de gecoate platen bij 37 ° C gedurende 2 uur, als de plaat dezelfde dag (snelle coating) wordt gebruikt. Als dat niet het geval is, zegel van de platen met plastic wrap, en 's nachts bewaren bij 4 ° C (langzaam coating).
Opmerking: De afdichting is kritische drogen en besmetting te voorkomen. - Verwijder de laminin oplossing zorgvuldig met een pipet te voorkomen krassen op het oppervlak. Zachtjes was de putjes drie keer met steriele DPBS.
- Volledige gliale groei media aan elk goed en handhaving van de platen bij 37 ° C tot klaar om toe te voegen de EGC schorsing toevoegen.
Opmerking: Poly-D-lysine en laminin gecoate platen kunnen worden opgeslagen voor 3 dagen bij 4 ° C. Coat de platen enkele dagen vooruit en vervolgens bewaren bij 4 ° C, spoel de platen met steriele DPBS driemaal. Voeg 2 mL steriele DPBS aan elk putje na de laatste wasbeurt. Afdichting van de plaat met parafilm en winkel bij 4 ° C. Het is essentieel om ervoor te zorgen dat de laminin droogt niet uit.
3. bereiding van isolatie oplossingen
- Bereid de oplossing van EDTA/HEPES/DPBS dissociatie. Voor 500 mL van de oplossing, steriele DPBS (zonder calcium en magnesium) te gebruiken om een definitieve oplossing van 10 mM HEPES en 5 mM EDTA. Voeg 5 mL van de 1 M HEPES-buffer en 5 mL 0,5 M EDTA stockoplossing tot 490 mL van de DPBS. Bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
- Bereiden de gliale cel resuspensie media met behulp van de reagentia die zijn vermeld in tabel 1.
- Bereiden gliale groei media met behulp van de reagentia die zijn vermeld in tabel 2.
Opmerking: Gliale groei media met GDNF kunnen worden opgeslagen voor een week bij 4 ° C.
4. verwijdering van de intestinale Segment
Opmerking: Muizen mochten gratis toegang tot de voedsel en water voorafgaand aan euthanization door de Isofluraan drop, methode en de verwijdering van een vitaal orgaan. C57BL/6 muizen groter is dan 8 weken leeftijd werden gebruikt. Zowel mannen als vrouwen werden gebruikt zonder merkbare verschillen in de voorbereiding.
- De muis met een overdosis van Isofluraan euthanaseren en liggende in een ontleden lade plaatsen. PIN van de extremiteiten en steriliseren van de buik met 70% ethanol. De huid van de tent met een tang en open vervolgens de buik met een schaar.
- Til de lever en identificeren van de distale maag/pylorus. Verwijder vervolgens 7 cm van de proximale darm. Wees voorzichtig niet te scheuren van de darm.
-
Houd de Maagportier met een tang terwijl het knipprogramma weg het mesenterium.
- Botte dissectie met de achterkant van de schaar gebruiken om te schrapen weg aanhangend alvleesklier.
- Plaats de intestinale segment in ijskoude DPBS zonder Ca2 + of Mg2 + (figuur 1A).
Opmerking: Andere segmenten van de darm of de dikke darm kunnen ook worden verwijderd met behulp van dezelfde techniek.
- Gebruik een 5 of 10 mL spuit gekoppeld aan een botte uiteinde 20 G naald te spoelen van de inhoud van de fecale met ijs koud DPBS (figuur 1B).
- Verdeel de darm in 3 cm segmenten te verwijderen van de longitudinale spier met behulp van de techniek die in eerste instantie beschreven door Smith et al. 12 en zoals gewijzigd in Sundaresan et al. 10.
NB: Intestinale segmenten van maximaal twee muizen worden gebruikt per 30 mL van de oplossing van de isolatie HEPES/EDTA/DPBS. - Afbreken van ongeveer 4 cm te scheiden van de houten stok van de katoen-tip. Geniet van de houten stok in DPBS (Figuur 1 c).
- Slip een van de intestinale segmenten soepel op de wordt bevochtigd stick (figuur 2A-C).
- Verwijder aanhangend mesenterium nog steeds verbonden met behulp van naald-neus tang (figuur 2D).
-
Gebruik een schone scheermesje of scalpel om twee longitudinale nicks langs de darm waar het mesenterium was aangesloten (2E figuur).
- NAT van de tip van katoen met DPBS. Wrijf de tip wordt bevochtigd katoen lengterichting langs de spieren losmaken van de longitudinale spier/myenteric plexus (LMMP). Verplaats de katoen-tip horizontaal te plagen weg de LMMP van de circulaire spier langs de lengte van de intestinale segment tijdens het verwijderen van de LMMP.
- Houd het uiteinde van de stick tussen de duim en wijsvinger terwijl het stabiliseren van het segment met de middelste en vierde vinger (figuur 2F). Als alles klaar is, zal de LMMP gemakkelijk schil af de intestinale segment.
- Gooi de LMMP uit de intestinale buis verwijderd en gekoppeld aan het wattenstaafje tenzij EGCs oogsten van de plexus myenteric gewenst is.
- Gebruik een scheermesje te open flay de intestinale segment lengterichting te verwijderen uit de houten stok.
- Bewaar het gestripte intestinale weefsel (overwegend mucosa en de submucosa plus circulaire spier) in DPBS op het ijs. Herhaal stap 4.4 – 4.11 totdat alle intestinale segmenten worden bereid.
5. verwijdering van de epitheliale Mucosa
- Snijd de darmen in kleinere stukken van ~0.5 cm met fijne schaar.
- Plaats het weefsel in een steriele 50 mL conische centrifugebuis met 30 mL van de ijskoude oplossing van EDTA/HEPES/DPBS.
- Rock de weefsel-bevattende oplossing bij 4 ° C gedurende 10 minuten op ~ 60 kantelt per min.
- Bevochtig vooraf een pipet 5 mL plastic door de buffer van de EDTA/HEPES/DPBS op en neer één keer pipetteren en gebruik vervolgens de vooraf bevochtigd pipet om het weefsel Pipetteer en buffer schorsing op en neer (verpulvering) 20 keer te verjagen van de epitheliale mucosa.
- Het weefsel van de EDTA-incubatie verzamelen door het mengsel door een 100 µm nylon cel zeef gieten. Gooi de troebele slijm gevulde doorstroming (Figuur 3).
- Plaats het weefsel behouden in de zeef in een nieuwe 50 mL conische centrifugebuis met 30 mL ijs koud EDTA/HEPES/DPBS met behulp van naald-neus tang.
- Herhaal de incubatie EDTA/HEPES/DPBS een tweede keer door het schommelen van het weefsel bij 4 ° C gedurende 10 minuten op ~ 60 kantelt per min te strippen af extra epitheliale mucosa.
- Bevochtig vooraf een 5 mL-pipet met de buffer en Pipetteer vervolgens de schorsing van het weefsel op en neer 20 keer te verjagen van de slijmvliezen cellen.
Opmerking: Het weefsel zal hebben de neiging vast te houden aan binnenkant van de pipet meer van het epitheel is opgeheven. - Het weefsel na de tweede incubatie verzamelen door het gieten van het mengsel door een zeef van 100 µm nylon cel en gooi de stroom door. De tweede doorstroomtest moet merkbaar minder troebel dan de eerste (Figuur 3).
- Herhaal de 10 min EDTA incubations totdat de oplossing bijna is duidelijk (ongeveer 3 tot 4 incubations afhankelijk van de hoeveelheid weefsel en de doeltreffendheid van de verpulvering) (Figuur 3).
6. verzameling van darmen gliale cellen uit de Lamina Propria en de Submucosa
- Het weefsel van de nylon zeef overbrengen in een tube van 15 mL conische centrifuge met 5 mL van de oplossing van de gegevensterugwinning van de verkrijgbare cel en rock voor 25-30 min bij 4 ° C.
-
Triturate voorzichtig 10 x om zich te distantiëren van de darmen gliale cellen uit de lamina propria.
- Filtreer door een filter van 40 µm en vang het filtraat op in een schone 50 mL-buis.
- Spoel het weefsel op de nylon filter met 1 mL DPBS.
- Negeren van het weefsel en de overdracht van de ~ 5 – 6 mL van het filtraat aan een schone 15 mL conische centrifugebuis.
- Draai het filtraat bij 2.000 x g in een swingende emmer centrifuge voor 5 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de gliale cel-bevattende pellet in ten minste 1 mL buffer van resuspensie door zachtjes pipetteren de pellet op en neer met een 500 µL pipette uiteinde. Vermijd invoering van bubbels.
Opmerking: Pas het resuspensie volume zo nodig voor het aantal putten en platen. Bijvoorbeeld: 1,2 mL voor één 6-well plaat; 2.4 mL voor twee 6-Wells-platen; 2.4 mL voor een 12-well plaat. - Pipetteer 200 µL van de celsuspensie in elk putje van de 6-well of 100 µL voor een 12-well PDL-laminin gecoate platen met gliale groei media.
- Niet storen de gerechten na het toevoegen van de cellen aan de platen en plaatsen in de incubator van de 37 ° C om het maximum aantal cellen te houden.
Opmerking: Een gezonde bereiding van cellen zal hechten binnen 6-8 uur maar wachten gedurende ten minste 24 uur voordat de media door zachtjes pipetteren uit de media samen met niet-aanhanger cellen wijzigen. - De cellen worden gebruikt voor experimenten 3 – 4 dagen nadat ze zijn geplaatst in cultuur (Figuur 4). Immunefluorescentie analyses met behulp van antilichamen van belang aan specifieke proteïne markeertekens (tabel 3) uit te voeren. Bijvoorbeeld GFAP, S100b en p75NTR of Sox10 werd gebruikt hier. E-cadherine of Alfa glad spierweefsel actine antilichamen werden gebruikt ter beoordeling van de mate van besmetting van andere celtypes.
7. immunefluorescentie kleuring
- De media uit de culturen gecombineerd en spoel tweemaal met PBS.
- Fix de culturen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met 4% paraformaldehyde.
- Verwijder de fixeer en spoel na 3 keer met PBS.
- De cellen met PBS met 0,2% permeabilize Triton X-100 bij kamertemperatuur.
- De permeabilized cellen met blokkerende oplossingen bestaat uit anti-kip IGJ, anti-konijn of anti-muis IgG gedurende 2 uur bij kamertemperatuur incuberen.
-
Incubeer de cellen met primaire antilichamen overnachting, bijvoorbeeld GFAP (1:1, 000).
- Spoel de cellen 3 keer met PBS. Als het uitvoeren van colocalization gaat u verder met stap 7.7.
- Incubeer de volgende reeks van primaire antilichamen voor minstens 2 uur bij kamertemperatuur, maar bij voorkeur 's nachts bij 4 ° C. Gebruik een 1:1000 verdunning konijn anti-S100 of een verdunning van de 1:500 van muis anti-p75NTR.
Opmerking: Alle antilichamen worden verdund in PBS. - Spoel de cellen 3 keer met PBS te verwijderen primaire antilichamen. Vervolgens Incubeer de gespoeld cellen met de juiste fluorescently-tagged secundaire antilichamen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (tabel 3).
- Spoel 3 keer met PBS te verwijderen van de secundaire antilichamen.
- De coverslips in dia's 1-2 druppels van de montage-media met DAPI monteren en de cellen onder een fluorescente microscoop bekijken.
8. Stroom Cytometry
- Aanhangend gliale cellen voor stroom cytometry verwijderen door het spoelen van de cellen een keer met DPBS en voeg vervolgens 0,25% trypsine-EDTA per fabrikant protocol. Incubeer de cellen in de trypsine-EDTA-oplossing bij 37 ° C gedurende 3 min. Terminate de spijsvertering door het verzamelen van de cellen in volledige gliale cel groei media.
- De cellen verzamelen door centrifugatie bij 400 x g gedurende 5 min en vervolgens resuspendeer de cellen in PBS.
- Herstellen van de cellen met de 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten en vervolgens permeabilize met 0,2% Triton X-100 in PBS zoals beschreven in stap 7.4.
- Het blokkeren van de cellen met PBS, met 1% BSA en de specifieke weefsel-immuunglobuline voor 20 min, bijvoorbeeld ezel anti-kip IGJ (IgG) (H + L) (1:1, 000) of ezel anti-geit IgG (H + L) (1:1, 000).
- Incubeer de cellen met de primaire antilichamen GFAP (1:2, 000), E-cadherine (1:400), α-gladde spier actine (1:500) of Pgp9.5 (1:500) 's nachts bij 4 ° C.
-
Wassen weg het antilichaam met PBS.
- Incubeer het complex van antigeen-antilichaam met fluorescently-tagged secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten geïncubeerd.
- Gebruik een aparte hoeveelheid cellen geïncubeerd met secundair antilichaam om te dienen als het isotype-besturingselement. Beide populaties van cellen zijn gewassen en geresuspendeerde in PBS voorafgaand aan stroom cytometry.
- Analyseer de twee populaties van cellen in een flow-cytometer door het gating op de levende cellen.
9. voorbereiding van de weefsels van de muis van de hGFAP-Cre:tdTomato muizen
Opmerking: De Lox-STOP-Lox-tdTomato cDNA wordt uitgedrukt uit de ROSA locus22,23 (Jackson Labs, #007914) en genereert endogene fluorescentie wanneer aan een muis uitdrukken van de Cre-recombinase (hGFAP-Cre) gekweekt. In situ analyse is uitgevoerd door bevroren weefselsecties te genereren.
- Intestinale weefsel herstellen in 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur en dan 's nachts uitdrogen in 1 M sacharose in PBS.
- Insluiten van het weefsel in commercieel gekocht optimale scherpe weefsel (OCT) samengestelde bestaat uit 10% polyvinyl alcohol en 4,2% polyethyleenglycol en vervolgens module bevriezen in vloeibare stikstof.
- 5 µm cryosecties bereiden en vervolgens koppelen met behulp van een antifade monteren van media met DAPI.
- Stroom cytometry, EGCs opstellen van de hGFAP-Cre:tdTomato+ muizen zoals beschreven in stappen 4.1-6.5.
- Trypsinize van de cellen van de plaat na 3 dagen in culturen zoals in stap 8.1, en dan fix voor 10 min in 4% paraformaldehyde.
- Analyseren van cellen geïsoleerd van Cre negatieve muizen parallel met cellen geïsoleerd van de hGFAP-Cre:tdTomato+ muizen op een stroom cytometer.
Opmerking: Gates werden gebouwd om te voorkomen dat de dode cellen en puin.
10. Ca2 + Flux Imaging
- Incubeer EGCs verguld op een 24-well plaat met 3 µM Fluo-4-AM bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Afbeelding van de Ca2 + signaal in commercieel gekochte Tyrode de oplossing met behulp van een draaiende schijf confocal microscoop en een golflengte van de excitatie van 480 nm (F480) na het toevoegen van CCK of gastrine peptide. Beeldanalyse werd gemeld in Sundaresan et al. 10 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Preps werden als mislukt beschouwd als GFAP + cellen niet houden en verspreid binnen de 24u (figuur 4A). Het aantal gliale cellen kon niet worden vastgesteld tot na 24 h wanneer de cellen vastgehouden en bewijs toonde van verspreiding in platte aggregaten (figuur 4B). Cellen aan de rand van de clusters neiging om langdurige processen uit te breiden en uitgedrukt klassieke gliale markers, bijvoorbeeld GFAP, S100b en p75NTR (figuur 4C, 4 D)10,16. Door de dag 2nd vasthouden gliacellen strak aan het oppervlak waardoor de bevolking van de niet-aanhanger weg worden gespoeld met PBS. De meeste van de zwevende cellen waren epitheliale en lamina propria cellen samen met cel puin. De aanwezigheid van deze drijvende cel bosjes verminderd de opbrengst van aanhangend gliale cellen onderstrepen het belang van het uitvoeren van de EDTA-incubations totdat de doorstroom nagenoeg helder is, signalering dat de epitheliale cellen zijn verwijderd uit de lamina Propria kern. Daarnaast deed centrifugeren bij snelheden lager dan 1500 x g na broeden in de oplossing van de gegevensterugwinning van de cel niet effectief verzamelen alle levensvatbare cellen in een pellet leidt tot lagere opbrengsten. Typisch, 40.000 tot 100.000 cellen morfologisch consistent met EGCs nageleefd stevig door dag 3 in cultuur.
Analyse van Immunohistochemical met gliale-geassocieerde antilichamen, aangegeven dat de cel die bleef aanhanger clusters door dag 3 waren algemeen kaderakkoord voor vrede, S100b en Sox 10 positieve10,16 (figuur 5A). In de huidige studie, werd deze dezelfde mate van zuiverheid waargenomen door de cellen permeabilizing en analyseren door stroom cytometry (figuur 5B-F). Onmiddellijk na de submucosal/Lamina propria gliale cellen isoleren, stroom cytometry kwam naar voren dat ongeveer 51% van de cellen GFAP + (figuur 5B), wat suggereert de aanwezigheid van GFAP-negatieve celtypen, bijvoorbeeld epitheliale, hematopoietische, endotheel, neuronale cellen, myofibroblasts bekend te bestaan in het epitheel en de lamina propria. Na 3 dagen in de cultuur, het aantal GFAP + cellen vertegenwoordigd meer dan 95% van de cel bevolking geanalyseerd na het verwijderen van de oorspronkelijke media, voorzichtig spoelen met PBS en vervolgens toe te voegen nieuwe media (figuur 5C). Flow analyse bleek interessant, hoge en lage GFAP eiwit-uiten populaties (figuur 5C). Inderdaad, immunefluorescentie onderzoek van de cellen bleek dat de periferie van de clusters neiging om uit te drukken van hogere niveaus van GFAP (figuur 4C, 4 D). Samen genomen, kunnen de twee soorten analyse wijzen op verschillen in EGC looptijd of differentiatie status. Collectief, het percentage van α-SMA + (myofibroblast cel marker), E-cadherine + (epitheliale cel marker), en Pgp 9.5 + (neuronale cel marker) cellen was minder dan 5% (figuur 5D-F). Deze resultaten waren consistent met de voorafgaande studie uitgevoerd met behulp van immunefluorescentie labeling van EGCs tonen van ongeveer 93% GFAP + cellen van 10. De flow analyse onderstreept het belang van het toestaan van de cellen zich te houden aan de platen, omdat het toelaat verwijdering van contaminerende cel populaties, bestaande uit ongeveer 5% van de culturen.
Een doel in deze studie was een verslaggever GFAP-geactiveerd gebruiken om stroom cytometry van de cellen voor verdere analyse en vergelijk de mate van EGC verrijking met behulp van een endogene fluorescerende markering (Figuur 6). De lijn van de muis hGFAP-Cre werd oorspronkelijk beschreven door Messing en collega's 20. Kortom, werd de Cre-recombinase Geplaatst onder de controle van 2.2 kb van de promoter menselijke gliale fibrillary zuur eiwit (hGFAP). Dus, uitgedrukt een willekeurige cel transcriptie van de promotor van dit hGFAP de tdTomato van de rode fluorescerende verslaggever. De bevolking van de cel met het label met de verslaggever van de tdTomato was gevisualiseerde in situ bevroren secties van de darm en de dikke darm (figuur 6A, 6B) gebruiken voor het uitvoeren van de hierboven beschreven procedures voor de isolatie van EGC. Na het uitvoeren van het EDTA/cel herstel isolement en kweken van de cellen gedurende 3 dagen, waren EGCs van deze muizen gemakkelijk geïdentificeerd door hun endogene fluorescentie (Figuur 6 c). Hoewel ongetwijfeld GFAP + cellen talrijker in de proximale darm4,21 zijn, tdTomato + EGCs werden ook waargenomen in de dikke darm (figuur 6B). Met behulp van de tdTomato+ fluorescerende verslaggever geactiveerd door de hGFAP-Cre bleek ook een bimodaal bevolking van hGFAP-tdTomato + cellen (figuur 6D) zoals waargenomen met behulp van de immunefluorescentie analyse van GFAP eiwit (figuur 5C). Hoewel het is gemeld dat niet alle EGCs express GFAP eiwit4, misschien dit punt weerspiegelen verschillen in de mate van expressie van het algemeen kaderakkoord voor vrede. Gemiddeld tentoongesteld ongeveer 66% van de cellen geanalyseerd het hoogste niveau van tdTomato fluorescentie. Daarom kan het protocol voor het herstel van EDTA/cel worden gebruikt om te isoleren van de deelverzamelingen van EGCs in de dunne darm en dikke darm gelabeld door de verslaggever te bestuderen van de verschillen in genuitdrukking.
Dit protocol een voldoende aantal relatief zuiver GFAP + gliacellen voor biochemische studies en westelijke vlekkenanalyse gegenereerd 10. om aan te tonen van gliale cel reactievermogen, een 3-daagse gliale cel prep werd behandeld met de hormonen Cholecystokinine (CCK) of gastrine voor het opwekken van Ca2 + flux (figuur 7A-7B)10. De resultaten toonden aan dat deze GFAP + Adherente cellen gereageerd op extracellulaire agonisten demonstreren hun vermogen om bekende darmen gliale functie tentoon te stellen.
Figuur 1: Set up en voorbereiding van muis darmen. (A) afbeelding van isolatie instellen op ijs, met inbegrip van uitgepakte darmen. (B) foto van 5 mL-spuit gekoppeld aan een naald van 20 G botte uiteinde te spoelen van fecale inhoud. (C) composietsteen einde van een houten wattenstaafje (~ 4 cm) onderdompelen in de buffer DPBS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: stappen gebruikt voor darmen reinigen en verwijderen van de longitudinale spier/myenteric plexus (LMMP). (A-C) Glijden van een intestinale segment op een wordt bevochtigd houten stok. (D) opheffing van aanhangend mesenterium. (E) plukt de darm met een scheermesje. (F) het verwijderen van de LMMP met een vochtig wattenstaafje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: sequentiële Flow-throughs na EDTA incubations. Getoond zijn voorbeelden van de stroom-throughs uit 4 opeenvolgende incubations met behulp van drie 7 cm intestinale segmenten geïncubeerd gedurende 10 minuten met 5 mM EDTA / 10mM HEPES in DPBS en vervolgens de triturated 20 keer. Representatieve stroom-throughs na het gieten door een zeef van 100 µm nylon mesh worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: EGC beelden 24u na plating. Lichte microscopisch onderzoek van de geresuspendeerde cellen 24u na beplating. (A) getoond is een representatief voorbeeld van een slechte voorbereiding met zwevende epitheliale cel klontjes (pijl) en puin. Geen aanhanger EGCs werden waargenomen na 24 h. (B) getoond is een representatief voorbeeld van een uitstekende prep 24u nadat de cel isolatie en resuspensie waarin flarden van EGCs aan de PDL/Laminin vastgehouden platen gecoate. Beelden werden gevangen op een omgekeerde fluorescente microscoop met een digitale camera. Schaal bars = 500 µm (A-B). (C) High power weergave van een patch van EGC cellen gekleurd met GFAP antilichaam (groen) toont cellen aan de rand met een hogere intensiteit van labeling. Verscheidene van de cellen toonde dubbele kernen (pijlpunt, DAPI, blauw). (D) Colocalization van GFAP (groen) met S100 (rood) of p75NTR (rood). Schaal bars = 20 µm (C-D). De cellen waren gemonteerd met een antifade-reagens en de DAPI (blauwe kernen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: stroom cytometry van darmen gliacellen geïsoleerd van de duodenale lamina propria van de volwassen muis. (A) immunofluorescentie van GFAP, S100B en Sox10 op EGC culturen na 3 dagen. Pijlen geven aan Sox 10 positieve kernen. Schaal bars = 20 µm (gebruikt met toestemming van Sundaresan et al. 10). de positieve cellen (B) Percentage van GFAP voordat plating op gecoate platen (intensiteit van de fluorescentie (of vooruit scatter, x-as) versus kant scatter (y-as). (C) Percentage van GFAP positieve (D) α-SMA positieve (E) E-cadherine positief (F) en Pgp 9.5 positieve cellen 3 daysafter beplating. Poorten aangelegd om te voorkomen dat de dode cellen en puin. Het gemiddelde percentage van de fluorescerende bevolking ten opzichte van het aantal cellen (kant spreiding) wordt getoond. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Identificatie van de darmen gliacellen geïsoleerd van de duodenale lamina propria van de hGFAP-Cre+: tdTomato+ volwassen muis. Endogene tdTomato TL (rood) beelden werden gevangen op een fluorescerende fasecontrastmicroscoop met een digitale camera in de darm (A). (inzet) Hetzelfde als A behalve samengevoegd met de afbeelding van de DAPI (blauwe kernen). (B) dubbele punt samengevoegd met DAPI. (C) Enteric gliale cellen (rood) geïsoleerd van hGFAP-Cre:dtTomato+ muizen en gekweekte voor 3 dagen op PDL/Laminin substraat. Schaal bars = 50 µm. (D) Flow cytometrische analyse van tdTomato cellen. Komt te staan is het gemiddelde percentage van GFAP + cellen ± SEM voor 3 verschillende preparaten (3 muizen per prep). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Video van Ca2 + stromen na hormoonbehandeling. EGCs vergulde 24-well PDL en laminin gecoate platen werden gekweekt in de media gliale groei voor 3 dagen. De cellen waren vooraf geladen met 3 µM voor Fura-2-AM gedurende 20 minuten bij 37 ° C en vervolgens behandeld met (A) 100 nM Cholecystokinine (CCK) of (B) 100 nM gastrine. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Onderdelen | Volume worden toegevoegd | Eindconcentratie |
| DMEM/F12 | 44,5 mL | _ |
| Foetale runderserum (FBS) | 5 mL | 10% |
| Penicilline-streptomycine | 500 ΜL | 100 IU/mL Pen |
| Streptomycine | 100 µg/mL Strep | |
| Gentamicine (50 mg/mL stockoplossing) | 20 ΜL | 20 µg Mo/mL |
Tabel 1: Samenstelling van gliale cel resuspensie Media.
| Onderdelen | Volume worden toegevoegd | Eindconcentratie |
| DMEM/F12 | 44 mL | _ |
| Foetale runderserum (FBS) | 5 mL | 10% |
| Penicilline-streptomycine (100 x) | 500ΜL | 100 IU/mL (Pen) |
| 100 µg/mL (Strep) | ||
| Gentamicine (50 mg/mL stockoplossing) | 20 ΜL | 20 µg Mo/mL |
| GDNF (10 µg/mL stockoplossing) | 50 ΜL | 10 ng/mL |
| L-Glutamine (200 mM stock) | 500ΜL | 2 mM |
Tabel 2: Samenstelling van gliale cel groei Media.
| Onderdelen | Immunofluorescentie verdunning | Stroom Cytometry verdunning |
| Kip anti-GFAP | 1 tot 500 | 1 tot en met 2000 |
| Konijn anti-S100 | 1 tot 500 | 1 tot 500 |
| Muis anti-p75 NTR | 1 tot 500 | 1 tot 500 |
| Geit anti-E-cadherine | 1 tot en met 400 | |
| Muis anti-Pgp9.5 | 1 tot 500 | |
| Geit anti-a-Smooth Muscle actine | 1 tot 500 | |
| Alexa Fluor 488 geit anti-kip IGJ | 1 tot en met 1000 | 1 tot en met 1000 |
| Alexa Fluor 568 geit-antimuis IgG | 1 tot en met 1000 | 1 tot en met 1000 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-konijn IgG | 1 tot en met 1000 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-geit IgG | 1 tot en met 1000 |
Tabel 3: Lijst van antilichamen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EGCs spelen een belangrijke rol in de homeostase van de darm, en het is essentieel om te isoleren en bestuderen ze in vitro. In dit protocol, een eenvoudige methode voor het isoleren van EGCs uit de lamina propria van de volwassen muis darm geïntroduceerd om te bestuderen van de darmen gliale functie.
Aanhangend mesenterium en LMMP worden verwijderd met een wattenstaafje verwijdert enkele van de inter-myenteric-glia wonen tussen de lengterichting en spier, verhoogt de bereikbaarheid van buffers aan het submucosal oppervlak en verwijdert veel van de grotere haarvaten . De laatste vermindert het aantal rode bloedcellen besmetten de definitieve culturen. De reeks van EDTA incubations strippen weg de epitheliale mucosa bloot de lamina propria en submucosal glia, die kwetsbaar kunnen zijn na blootstelling aan de chelaatvormers oplossingen. Agitatie door schudden, vortexing of triturating (repetitief op en neer pipetteren) moet worden zorgvuldig uitgevoerd en getimed om te voorkomen dat buitensporige schade aan de cellen. Verpulvering werd hier gebruikt omdat de techniek in een meer consistente rendement van aanhangend, levensvatbare gliacellen resulteerde. Schudden de neiging te introduceren bubbels en levensvatbaarheid van de cellen morfologisch beoordeeld door naleving van de cel aan de gecoate platen te verminderen. Het weefsel moet in stukjes worden gesneden < 0.5 cm tot effectief het weefsel met de pipet 5 mL triturate.
In het algemeen 7 cm segmenten van ten minste 3 muizen is voldoende voor het genereren van genoeg EGCs ter dekking van een 6-well plaat op ongeveer 20-30% confluentie, die vervolgens kan worden gebruikt voor immunocytochemie en qPCR. Meer cellen kunnen echter vereist voor biochemische methoden zoals western blots afhankelijk van het niveau van de uitdrukking van het gen studeerde. Hoewel, typ 1 collageen of Matrigel werd kort onderzocht als alternatief voor het poly-D-lysine/Laminin substraat, meer hechting van de epitheliale celpopulatie werd waargenomen, uiteindelijk verhoging van verontreiniging van de EGC culturen met andere celtypes . Bovendien, collageen type 1 niet stevig te houden aan de platen en gemakkelijk werd verdreven van het oppervlak bij het wijzigen van de media. Fibronectine is een ander substraat dat gebruikte24is geweest, maar hier niet is getest. Laminin blijkbaar vergroot de binding en differentiatie van neurale-crest afgeleide cellen25. Echter, veel van de laminin kunnen variëren, invloed cel hechting en opbrengsten. Bacteriële besmetting van de culturen heeft plaatsgevonden van ongeveer 5% van de tijd en bleef tot een minimum te beperken door het gebruik van steriele reagentia, techniek en antibiotica. Gebruik van het antischimmel reagens was facultatief.
De belangrijkste beperking van het protocol hier is standaardisatie van de agitatie voor het verwijderen van het epithelium zonder beschadiging van de onderliggende EGCs. Bovendien, de voorbereiding kan niet worden beoordeeld onmiddellijk aangezien het afhangt van de naleving van de cel aan de gecoate platen. Drie gebieden te concentreren op bij het oplossen van omvatten: 1) gebruik van verse PDL en laminin jas van de platen; 2) minimaliseren van de tijd van de dissectie aan het begin van de EDTA-incubations door het verhogen van het aantal assistenten; 3) het kwantificeren van de tijd en de methode die wordt gebruikt om het weefsel te verwijderen effectief het epithelium en vervolgens de EGCs doorroeren. Uitbreiding van de tijd in een van deze stappen verhoogt EGC kwetsbaarheid en de waarschijnlijkheid dat ze niet herstellen zal bij het uitplaten in groei media. Hoewel de methode van de verpulvering te distantiëren van het epithelium hier gebruikt werd, werden schudden en vortexing ook getest met inconsistente resultaten misschien omdat er meer exploitant afhankelijk en moeilijk te kwantificeren. Zodra het rendement van Adherente cellen verguld was groter zijn als de cellen werden niet verstoord gedurende 16-24 uur.
De methode die hier gepresenteerd werd gewijzigd volgens de originele studie door Smith et al. 12, dat gericht was op het isoleren van de LMMP. De Smith-aanpak werd hier gebruikt alleen te verwijderen en verwijderen van de LMMP zodat allermeest naar de gliacellen geïsoleerd zou zijn afkomstig uit de submucosa en de lamina propria. Daarnaast zijn de myenteric EGCs zonder enzymatische spijsvertering, niet gemakkelijk bevrijde12. Niettemin, aangezien er geen specifieke markers voor myenteric versus submucosal glia, de aanwezigheid van gliale cellen uit de inter-myenteric plexus kan niet worden uitgesloten. Rosenbaum et al. rapporteerde flow cytometrische analyse van EGCs uiting van verbeterde groen fluorescent proteïne (EGFP) van de promotor van de hGFAP. Ze gebruikt heel jonge muizen (postnatale dag 7) en EGCs geïsoleerd uit de hele darm door enzymatische spijsvertering19. Daarnaast werd flow cytometrische analyse uitgevoerd na twee weken van het handhaven van omstandigheden die bevorderd vrij zwevende neurosphere formatie. Hoewel de auteurs gerapporteerd dat de neurospheres sterk uitgedrukt in zowel GFAP als S100b, de drijvende cel aggregaten ook sterk uitgedrukt α-SMA, wat suggereert dat de uitbreiding van de myofibroblast-celpopulatie aangemoedigd gliosphere ontwikkeling in tegenstelling op het vlakke blad-achtige morfologie hier beschreven. Daarom, terwijl interessant, de studie is niet direct vergelijkbaar met dit protocol. Daarentegen, de morfologie van de cellen in combinatie met aanzienlijk minder α-SMA + cellen suggereren dat de EGCs beschreven in dit protocol geen de 3-dimensionale morfologie tijdens de periode van 3 tot en met 5 - daagse cultuur vertonen. Desalniettemin het protocol hier zowel de Rosenbaum methode gebruiken een fluorescerende verslaggever te identificeren en te isoleren van GFAP + cellen die onderzoeker van vermogen kan je zelf live cel profilering zal verbeteren.
Kortom, beschrijft het huidige protocol het isolement van de darmen gliale cellen uit de submucosa met behulp van een niet-enzymatische aanpak. Het gehele protocol wordt ongeveer 3 h van muis dissectie van eerste beplating op de platen van vooraf gecoat weefselkweek. De meeste tijd intensief stap in het protocol is de verwijdering en de voorbereiding van de darmen voor de eerste EDTA-incubatie. Voorbereiding van de platen en op te slaan in DPBS wordt sterk aanbevolen. Het succes van de voorbereiding is afhankelijk van het efficiënt afvoeren van het epithelium zonder beschadiging van de onderliggende EGCs en naleving van de PDL/Laminin gecoate platen binnen 24 h. primaire EGCs zijn nuttig voor in vitro studies zoals biochemische analyse, CA2 + fluxen en adenovirale transfections10. Verwacht wordt dat de mogelijkheid om te isoleren EGCs uit de submucosa of de LMMP toestaat verdere studies om te definiëren van de verschillen in de EGC groei eigenschappen, differentiatie en morfologie met behulp van hele genoom benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen erkennen steun van R37 DK045729 (naar JLM), R01 AR060837 (aan HX) en de Universiteit van Michigan gastro-intestinale Research Center moleculaire Core P30 DK034933.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D lysine (1 mg/mL stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/mL stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5 M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50 mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 |
References
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas? Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
