Summary
Her beskriver vi isolering af entero-glial celler fra den tarm-submucosa bruge sekventielle EDTA inkubationer til Chelat divalent kationer og derefter inkubation i ikke-enzymatiske celle opsving løsning. Plating den resulterende cellesuspension på poly-D-Lysin og laminin resulterer i en yderst højberiget kultur af submukøse glial celler for funktionelle analyse.
Abstract
Det enteriske nervesystem (ENS) består af neuroner og enterisk glial celler (EGCs), der bor i den glatte muskulatur væg, submucosa og lamina propria. EGCs spiller en vigtig rolle i gut homøostase via frigivelse af forskellige trofiske faktorer og bidrage til integriteten af den epitel barriere. De fleste undersøgelser af primære enterisk glial kulturer bruge celler isoleret fra myenteric plexus efter enzymatisk dissociation. Her, er en ikke-enzymatisk metode til at isolere og kultur EGCs fra tarm submucosa og lamina propria beskrevet. Efter manuel fjernelse af langsgående muskel lag, blev EGCs befriet fra lamina propria og submucosa ved hjælp af sekventielle HEPES-buffered EDTA inkubationer efterfulgt af inkubation i kommercielt tilgængelige ikke-enzymatiske celle opsving løsning. EDTA inkubationer var tilstrækkelige til at fratage de fleste af epitel slimhinden fra lamina propria, tillader den celle recovery løsning til at befri de submukøse EGCs. Eventuelle resterende lamina propria og glatte muskulatur blev kasseret sammen med myenteric glia. EGCs var let identificeres ved deres evne til at udtrykke glial fibrillære sure protein (GFAP). Kun omkring 50% af cellesuspension indeholdt GFAP + celler efter endt væv inkubationer og før plating på poly-D-lysin/laminin substrat. Men efter 3 dage for dyrkning af celler i glial celle-afledte neurotrope faktor (GDNF)-indeholdende dyrkningsmedier, cellen befolkningen fastholdelsen af substrat-belagt pladerne består af > 95% enterisk glia. Vi lavet en hybrid mus linje ved avl en hGFAP-Cre mus til linjen ROSA-tdTomato reporter at spore procentdelen af GFAP + celler ved hjælp af endogene celle fluorescens. Ikke-myenteric enterisk glia kan således isoleret af ikke-enzymatiske metoder og kulturperler i mindst 5 dage.
Introduction
Interesse i funktionen af entero glial celler (EGCs) steget støt på grund af deres anerkendte roller i den gut-integritet og homøostase1,-2. Derudover EGCs varierer alt efter deres placering langs længden af GI-tarmkanalen3,4. EGCs frigive forskellige trofiske faktorer herunder glial celle-afledte neurotrope faktor (GDNF), bidrage til at gut motilitet1,5 og reagere på mikrobiel biprodukter6,7. Undersøgelser har vist, at befolkningens Ergoguidekonceptet er heterogene og at deres funktion varierer afhængigt af om de er submukøse eller opholde sig myenteric plexus1,7. For eksempel, bidrage EGCs inden for submucosa til stramme kryds8. Differential GFAP udtryk og fosforylering i EGCs har været forbundet med Parkinsons sygdom, hvilket tyder på deres mulige link til gut Fænotypen af denne lidelse9. For nylig, blev det observeret, at tabet af nukleare protein menin i isolerede kulturer af EGCs fra den proksimale intestinal submucosa var tilstrækkelig til at fremkalde udtryk af hormonet gastrin10. Som et resultat, blev det foreslået at EGCs er oprindelsen af duodenal gastrinomas, en type af neuroendokrine tumor10. Kollektivt, understrege disse eksempler relevansen af at studere adfærd og funktion af isolerede EGCs i neuropatiske lidelser og kræft11.
Udfordring i feltet forbliver sådan isolere og studere et eller begge EGC populationer i vitro. Afstamning sporingen eksperimenter viste, at EGCs i submucosa og lamina propria stammer fra stamceller i myenteric plexus7. Selv om der er flere offentliggjorte isolation protokoller kan generere kulturer af myenteric EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, ingen specifikt mål Isolationsgrad af submukøse/lamina propria EGC bestand. Eksisterende protokoller for EGC isolation bruge specifikt en kombination af den mekaniske adskillelse eller microdissection af den glatte muskulatur kombineret med enzymatisk dissociation, til sidst kassere den slimhinde cellelag.
Målet med dette manuskript er at demonstrere fremgangsmåden til ikke-enzymatisk isolere primære EGCs fra lamina propria for in vitro- undersøgelser. Da der er ingen markører, der specifikt adskiller myenteric EGCs fra dem i submucosa, blev rumlig adskillelse af epitel slimhinden fra den glatte muskulatur udnyttet til at isolere submukøse EGCs. Derudover ved at kombinere EDTA kelation med ikke-enzymatiske dissociation, blev EGCs isoleret fra submucosa i modsætning til den glatte muskulatur, der var frasorteret sammen med de tilknyttede inter-myenteric EGCs. Yderligere adskillelse af submucosa og lamina propria EGCs opstod ved dyrkning af celler på glial celler-venlige substrater, fx poly-D-Lysin og laminin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg beskrevet blev godkendt ved University of Michigans Komité for brug og pleje af dyr.
1. forberedelse af Sterile Poly-D-lysin (PDL) og Laminin løsninger
- Mindst én dag før celle isolation, forberede poly-D-lysin (PDL) og laminin overtrukne plader.
Bemærk: Både 6-godt og 12-godt plader blev forberedt alt efter de eksperimentelle mål. Typisk blev 12-godt plader brugt til den kvantitative analyse ved hjælp af western blotting; der henviser til, at 6-godt plader blev brugt til at holde autoklaveres (steril) coverslips for Immunhistokemi. 24-godt plader blev brugt til kultur EGCs for Ca2 + flux billeddannelse. - Fortynd stamopløsninger med laves vævskultur grade, DNase-frit og RNase-fri vand i en vævskultur hætte med HEPA-filtreret luft.
-
Sterilisering glas coverslips
- Hold coverslip med steril pincet og Fordyb coverslips i et bægerglas 100% ethanol i 15 min. Tillad ethanol til at fordampe i vævskultur hood og derefter placere i 6-godt plader.
- Alternativt kan du placere flere coverslips individuelt på 2 mm tyk trækpapir i en plast beholder og derefter autoklave.
2. belægning plader
Bemærk: Udfør disse trin under en steril vævskultur laminar flow hætte.
- Tø 1 mg/mL PDL lager og fortyndes 1:10 med sterile, vævskultur grade vand, således at den endelige koncentration er 100 µg/mL. Bruge 2 mL pr. brønd til pels 6-godt plader, 1 mL til at dække et godt af en 12-godt plade og 0,5 mL til et godt i 24-godt plader. Gemme de resterende fortyndede PDL i 12 mL alikvoter ved-20 ° C.
- Efter at tillade PDL til pels brønde i mindst 1 time, fjerne PDL med en steril pipette. Tillad plader til luft tørre helt under en vævskultur laminar flow hætte.
Bemærk: Efter at fjerne PDL løsning med en steril pipette, kan det være anvendt to gange mere inden for 1 uge efter passerer gennem et 0,22 µm filter og lagring ved 4 ° C. - Tø laminin bestanden på isen for at undgå gel dannelse.
Bemærk: Ufortyndet laminin bliver fast når varmet over 8 ° C. - Fortynd den laminin stock (0,5 mg/mL) 1:50 med steril Dulbecco phosphat bufferet saltvand (DPBS) at opnå en endelig koncentration på 10 µg/mL. Gemme den fortyndede laminin i 12 mL alikvoter ved-20 ° C.
- Tilsæt fortyndede laminin brønde som indeholder tørret PDL. Brug 1 mL dækker 6-godt overflade og 0,5 mL til at dække bunden af 12-godt plader. For coverslips, skal du tilføje 400 µL fortyndede laminin til coverslips at nå overfladen dækning.
- Inkuber de overtrukne plader ved 37 ° C i 2 timer, hvis pladen der bruges den samme dag (hurtig belægning). Hvis ikke, forsegle plader med plastfolie, og gemme natten over ved 4 ° C (langsom belægning).
Bemærk: Forsegling er afgørende for at undgå udtørring og forurening. - Fjerne laminin løsning forsigtigt med en pipette til at undgå at ridse overfladen. Forsigtigt brøndene vaskes tre gange med steril DPBS.
- Tilføje komplet glial vækst medier til hver godt og vedligeholde plader ved 37 ° C indtil klar til at tilføje EGC suspension.
Bemærk: Poly-D Lysin og laminin belagt pladerne kan opbevares i 3 dage ved 4 ° C. Coat pladerne kommende flere dage og derefter opbevares ved 4 ° C, vaske pladerne med steril DPBS tre gange. Tilsættes 2 mL sterilt DPBS til hver brønd efter den sidste vask. Forsegle pladen med parafilm og opbevares ved 4 ° C. Det er vigtigt at sikre, at laminin ikke tørre ud.
3. forberedelse af Isolation løsninger
- Forberede EDTA/HEPES/DPBS dissociation løsning. 500 mL af opløsningen, bruge steril DPBS (uden calcium og magnesium) til at gøre en endelig løsning af 10 mM HEPES og 5 mM EDTA. 490 mL af DPBS, tilføje 5 mL 1 M HEPES buffer og 5 mL 0,5 M EDTA stamopløsning. Opbevares ved 4 ° C indtil brug.
- Forberede glial celler resuspension medierne ved hjælp af de reagenser, der er anført i tabel 1.
- Forberede glial vækst medier ved hjælp af de reagenser, der er anført i tabel 2.
Bemærk: Glial vækst medier indeholdende GDNF kan opbevares i en uge ved 4 ° C.
4. fjernelse af tarm-segmentet
Bemærk: Mus blev tilladt fri adgang til mad og vand før euthanization af isofluran slip-metoden og fjernelse af en vitale organ. C57BL/6 mus større end 8 ugens i alder blev brugt. Begge køn blev brugt uden mærkbare forskelle i præparatet.
- Aflive mus med en overdosis af isofluran og placere liggende i en dissekere bakke. PIN ekstremiteterne og sterilisere maven med 70% ethanol. Telt huden med pincet og derefter åbne maven med en saks.
- Løft leveren og identificere den distale mave/pylorus. Derefter fjerne 7 cm af den proksimale tarmen. Pas på ikke at rive tarmen.
-
Hold pylorus med pincet mens snipping væk mesenterium.
- Bruge stump dissektion med bagsiden af en saks til at skrabe væk vedhængende bugspytkirtlen.
- Placere den intestinale segment i iskold DPBS uden Ca2 + eller Mg2 + (figur 1A).
Bemærk: Andre segmenter af tarm eller kolon kan også fjernes ved hjælp af samme teknik.
- Brug en 5 eller 10 mL sprøjte knyttet til en stump ende 20 G nål til at skylle ud fecal indhold med is koldt DPBS (figur 1B).
- Opdele tarmen i 3 cm segmenter til at fjerne den langsgående muskel ved hjælp af teknikken oprindeligt beskrevet af Smith et al. 12 og som ændret i lene attenhøj et al. 10.
Bemærk: Tarm segmenter fra op til to mus der bruges pr. 30 mL af EDTA-HEPES-DPBS isolation. - Afbryde ca 4 cm til at adskille den træpind fra bomuld tip. Nyd den træpind i DPBS (figur 1 c).
- Slip en af de intestinale segmenter glat på den fugtede stick (figur 2A-C).
- Fjerne vedhængende mesenterium stadig fastgjort ved hjælp af nåle-næse pincet (figur 2D).
-
Brug en ren barberblad eller skalpel at gøre to langsgående nicks langs tarmen hvor mesenterium var fastgjort (figur 2E).
- Våd bomuld tip med DPBS. Gnid den fugtede bomuld spids på langs ad musklen til at løsne den langsgående muskel/myenteric plexus (LMMP). Derefter flytte bomuld spidsen vandret at tirre væk LMMP fra den cirkulære muskel langs længden af den intestinale segment under LMMP fjernelse.
- Hold spidsen af stokken mellem tommel- og pegefinger, mens stabiliserende segment med den midterste og fjerde finger (figur 2F). Når du er færdig, vil LMMP let skrælle den intestinale segment.
- Kassér LMMP strippet fra tarm røret og knyttet til vatpinden, medmindre høst EGCs fra myenteric plexus ønskes.
- Bruge et barberblad til flay open intestinal målgruppe på langs til at fjerne fra den træpind.
- Gemme den afisolerede tarmens væv (overvejende mucosa og submucosa plus cirkulær muskel) i DPBS på is. Gentag trin 4.4 – 4.11, indtil alle intestinal segmenter er forberedt.
5. fjernelse af epitel slimhinden
- Skær tarmene i mindre stykker af ~0.5 cm med fine sakse.
- Sted væv i en steril 50 mL konisk centrifugeglas indeholdende 30 mL iskold EDTA/HEPES/DPBS løsning.
- Rock den væv-holdige løsning ved 4 ° C i 10 min. ved ~ 60 hælder pr. min.
- Pre fugte 5 mL plastik pipette af pipettering EDTA/HEPES/DPBS buffer op og ned ad gangen, og derefter bruge den pre fugtede pipette afpipetteres væv og buffer suspension op og ned (ændring) 20 gange at løsne epitelial slimhinden.
- Indsamle væv fra EDTA inkubation ved at hælde blandingen gennem en 100 µm nylon celle si. Kassér den uklare Slim-fyldt gennemstrømning (figur 3).
- Placer vævet opbevares i sien i en ny 50 mL konisk centrifugeglas indeholdende 30 mL af is kold EDTA/HEPES/DPBS ved hjælp af nåle-næse pincet.
- Gentag EDTA/HEPES/DPBS inkubation en anden gang af vuggende væv ved 4 ° C i 10 min. ved ~ 60 hælder pr. min hen til krænge af yderligere epitelial slimhinde.
- Før fugte 5 mL pipette med bufferen og derefter afpipetteres væv suspensionen op og ned ad 20 gange for at løsne de mukøse celler.
Bemærk: Vævet vil være tilbøjelige til at holde sig til indersiden af pipetten, som flere af epitel fjernes. - Indsamler væv efter den anden inkubation ved at hælde blandingen gennem en 100 µm nylon celle si og kassér flow gennem. Den anden gennemstrømnings bør være mærkbart mindre grumset end først (figur 3).
- Gentag 10 min EDTA inkubationer indtil løsningen er næsten klare (omkring 3 til 4 inkubationer afhængigt af mængden af væv og effektiviteten af ændring) (figur 3).
6. samling af entero Glial celler fra Lamina Propria og Submucosa
- Overføre væv fra nylon si til en 15 mL konisk centrifugeglas der indeholder 5 mL af kommercielt tilgængelige celle genoprettelsesløsning og rock i 25-30 min. ved 4 ° C.
-
Hakkede forsigtigt 10 x for at adskille de enterisk glial celler fra lamina propria.
- Filtreres gennem et 40 µm filter og saml filtratet i en ren 50 mL tube.
- Skyl vævet på filteret nylon med 1 mL af DPBS.
- Kassér væv og overføre ~ 5 – 6 mL af filtratet til en ren 15 mL konisk centrifugeglas.
- Spin filtratet på 2.000 x g i en swingende spand der centrifugeres i 5 min. ved 4 ° C.
- Genopslæmmes glial celler-holdige pellet i mindst 1 mL af resuspension buffer af forsigtigt pipettering pellet op og ned med 500 µL pipette spids. Undgå at indføre bobler.
Bemærk: Juster lydstyrken på resuspension efter behov for antallet af brønde og plader. For eksempel, 1,2 mL til en 6-godt plade; 2,4 mL for to 6-godt plader; 2,4 mL for en 12-godt plade. - Med pipette overfoeres 200 µL af cellesuspension til hver brønd af den 6-godt eller 100 µL for en 12-godt PDL-laminin overtrukne plader der indeholder glial vækst medier.
- Forstyr ikke retter efter føje celler til pladerne og markedsføring i 37 ° C inkubator til at tillade det maksimale antal celler til at overholde.
Bemærk: En sund udarbejdelse af celler vil vedhæfte inden for 6-8 h men vente mindst 24 timer før medieskift af forsigtigt pipettering off medier sammen med ikke-tilhænger celler. - Bruge cellerne for eksperimenter 3 – 4 dage efter de er placeret i kulturen (figur 4). Udføre immunfluorescent analyse ved hjælp af antistoffer af interesse for specifikke protein markører (tabel 3). For eksempel blev GFAP, S100b og p75NTR eller Sox10 brugt her. E-cadherin eller alpha glat-muskel aktin antistoffer blev brugt til at vurdere graden af forurening fra andre celletyper.
7. immunfluorescent farvning
- Opsug medier fra kulturer og skylles to gange med PBS.
- Fix kulturer i 20 min. ved stuetemperatur med 4% PARAFORMALDEHYD.
- Fjerne fiksativ og derefter skylles 3 gange med PBS.
- Permeabilize celler med PBS, som indeholder 0,2% Triton X-100 ved stuetemperatur.
- Inkubér permeabilized cellerne med blokerende løsninger består af anti-kylling IgY, anti-kanin eller anti-mus IgG i 2 timer ved stuetemperatur.
-
Inkuber celler med primære antistoffer overnight, fx GFAP (1:1, 000).
- Skyl celler 3 gange med PBS. Hvis udførelse af colocalization fortsætte til trin 7.7.
- Inkuber det næste sæt af primære antistoffer i mindst 2 timer ved stuetemperatur, men helst natten over ved 4 ° C. Bruge en 1:1000 fortynding af kanin anti-S100 eller en 1: 500 fortynding af musen anti-p75NTR.
Bemærk: Alle antistoffer er fortyndet i PBS. - Skyl celler 3 gange med PBS fjerne primære antistoffer. Så Ruger de skylles celler med de passende fluorescently markeret sekundære antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur (tabel 3).
- Skyl 3 gange med PBS til at fjerne de sekundære antistoffer.
- Montere coverslips på dias ved hjælp af 1-2 dråber af montering medier med DAPI og se celler under et mikroskop for fluorescerende.
8. flowcytometri
- Fjerne vedhængende glial celler til flowcytometri ved skylning cellerne en gang med DPBS og derefter tilføje 0,25% trypsin-EDTA pr. producentens protokol. Inkuber celler i trypsin-EDTA-oploesning ved 37 ° C i 3 min. Terminate fordøjelsen ved at indsamle cellerne i komplet glial celle vækst medier.
- Indsamle cellerne ved centrifugering ved 400 x g i 5 min, og derefter cellerne genopslæmmes i PBS.
- Fix cellerne med 4% PARAFORMALDEHYD i 10 min og derefter permeabilize med 0,2% Triton X-100 i PBS, som beskrevet i trin 7.4.
- Blokere cellerne med PBS, som indeholder 1% BSA og væv specifikke immunoglobulin for 20 min, fx æsel anti-kylling IgY (IgG) (H + L) (1:1, 000) eller æsel anti-ged IgG (H + L) (1:1, 000).
- Inkuber celler med de primære antistoffer GFAP (1:2, 000), E-cadherin (1: 400), α-glat muskel aktin (1: 500) eller Pgp9.5 (1: 500) natten over ved 4 ° C.
-
Vaske væk antistof med PBS.
- Inkuber antigen-antistof kompleks med fluorescently mærket sekundære antistoffer inkuberes ved stuetemperatur i 30 min.
- Brug en separat alikvot af cellerne inkuberes med sekundær antistof til at tjene som kontrolelementet isotype. Begge populationer af celler er vasket og genopslemmes i PBS før flowcytometri.
- Analysere de to populationer af celler på et flow forskellige af gating på levende celler.
9. forberedelse mus væv fra hGFAP-Cre:tdTomato mus
Bemærk: Lox-STOP-Lox-tdTomato cDNA udtrykkes fra ROSA locus22,23 (Jackson Labs, #007914) og genererer endogene fluorescens når avlet til en mus, der udtrykker Cre recombinase (hGFAP-Cre). In situ analyse udføres ved at generere frossen væv sektioner.
- Fix tarmens væv i 4% PARAFORMALDEHYD for 1 h og derefter dehydrere natten over i 1 M saccharose i PBS.
- Integrere væv i kommercielt købt optimal opskæring væv (OCT) sammensatte består af 10% polyvinylalkohol og 4,2% polyethylenglycol, og derefter snap fryse i flydende kvælstof.
- Forberede 5 µm snit frosset organmateriale og derefter montere ved hjælp af en antifade montering medier med DAPI.
- Til flowcytometri, forberede EGCs fra hGFAP-Cre:tdTomato+ mus som beskrevet i trin 4.1 – 6.5.
- Trypsinize celler fra pladen efter 3 dage i kulturer som i trin 8,1 og derefter lave i 10 min. i 4% PARAFORMALDEHYD.
- Analysere celler isoleret fra Cre Negative mus parallelt med celler isoleret fra hGFAP-Cre:tdTomato+ mus på en flow Flowcytometret.
Bemærk: Portene blev bygget for at undgå døde celler og små klippestykker.
10. Ca2 + Flux Imaging
- Inkuber EGCs belagt på en 24-godt plade med 3 µM Fluo-4-AM ved 37 ° C i 30 min.
- Billede Ca2 + signal i kommercielt købte Tyrode løsning ved hjælp af en roterende disk Konfokal mikroskop og en excitation bølgelængde på 480 nm (F480) efter at tilføje CCK eller gastrin peptid. Billedanalyse blev rapporteret i lene attenhøj et al. 10 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Preps blev betragtet som mislykket, hvis GFAP + celler ikke overholder og spredes inden for 24 timer (figur 4A). Antallet af gliaceller kunne ikke bestemmes før efter 24 timer, når cellerne overholdes og viste tegn på spredning i flade aggregater (figur 4B). Celler i udkanten af klyngerne tendens til at forlænge lange processer og udtrykt klassiske glial markører, fx GFAP, S100b og p75NTR (figur 4 c, 4 D)10,16. Af dagens 2nd gliaceller stramt levet op til overfladen tillader ikke-tilhænger befolkningen til skylles væk med PBS. De fleste af de flydende celler var epitel og lamina propria celler med celle debris. Tilstedeværelsen af disse flydende celle klumper reduceret udbyttet af vedhængende gliaceller understregning af betydningen af udfører EDTA inkubationer indtil gennemstrømnings-er næsten klar, signalering, epitelceller er fjernet fra lamina propria kerne. Derudover centrifugering ved hastigheder mindre end 1.500 x g efter inkubation i celle opsving opklaring ikke effektivt samle alle de levedygtige celler ind i en pellet fører til reduceret udbytte. Typisk, 40.000 til 100.000 celler morfologisk sammenhængende med EGCs overholdt fast ved dag 3 i kultur.
Immunhistokemisk analyse med glial-associerede antistoffer, angivet, at cellen klynger at forblev tilhænger af dag 3 var GFAP, S100b og Sox 10 positive10,16 (figur 5A). I den nuværende undersøgelse, blev denne samme grad af renhed observeret af permeabilizing celler og analysere ved flowcytometri (figur 5B-F). Umiddelbart efter isolere submukøse/Lamina propria glial celler, viste flowcytometri, at omkring 51% af cellerne GFAP + (figur 5B), hvilket tyder på tilstedeværelse af GFAP-negative celletyper, fx epitel, hæmatopoietisk, endotel, neuronale celler, myofibroblasts vides at eksistere i epitel og lamina propria. Efter 3 dage i kultur, antallet af GFAP + celler repræsenteret over 95% af cellen befolkningen analyseret efter at fjerne det oprindelige medie, forsigtigt skylning med PBS og derefter tilføje friske medier (figur 5 c). Interessant, viste flow analyse høj og lav GFAP protein-udtrykker populationer (figur 5 c). Immunfluorescent analyse af cellerne afslørede faktisk, at i periferien af klyngerne tendens til at give udtryk for højere niveauer af GFAP (figur 4 c, 4 D). Taget sammen, kan de to typer af analyse indikere forskelle i EGC modenhed eller differentiering status. Kollektivt, procentdelen af α-SMA + (myofibroblast celle markør), E-cadherin + (epitelcelle markør), og Pgp 9,5 + (neuronal celle markør) celler var mindre end 5% (figur 5 d-F). Disse resultater var konsistente med den forudgående undersøgelse udføres ved hjælp af immunfluorescent mærkning af EGCs viser ca. 93% GFAP + celler 10. Analysen af handelsstrømmen understreger betydningen af at tillade celler til at tiltræde pladerne, da det giver mulighed for fjernelse af kontaminerende cellepopulationer bestående af ca. 5% af kulturerne.
Et mål i denne undersøgelse var at bruge en GFAP-aktiveret reporter at lette flowcytometri af celler til yderligere analyse og sammenligne graden af EGC berigelse ved hjælp af en endogen fluorescerende markør (figur 6). Linjen hGFAP-Cre mus blev oprindeligt beskrevet af Messing og kolleger 20. Kort sagt, var Cre recombinase anbragt under kontrol af 2,2 kb for menneskelige glial fibrillære syre protein (hGFAP). Således udtrykt enhver celle omskriver denne hGFAP promotor rødt fluorescerende reporter tdTomato. Befolkningens celle mærket med tdTomato journalist blev visualiseret i situ bruger frosne dele af tarmen og tyktarmen (fig. 6A, 6B) før du udfører EGC isolationsprocedurer beskrevet ovenfor. Efter udførelse af EDTA/celle opsving isolering og dyrkning af celler for 3 dage, EGCs fra disse mus var let identificeres ved deres endogene fluorescens (figur 6 c). Selv om GFAP + celler er velsagtens mere talrige i de proksimale tarmen4,21, tdTomato + EGCs også blev observeret i tyktarmen (fig. 6B). Ved hjælp af den tdTomato+ fluorescerende reporter aktiveres af hGFAP-Cre også afslørede en bimodal befolkning af hGFAP-tdTomato + celler (figur 6D) som observeret ved hjælp af en immunfluorescent analyse af GFAP protein (figur 5 c). Selv om det er blevet rapporteret, at ikke alle EGCs express GFAP protein4, kan dette punkt afspejler forskelle i niveauet af GFAP udtryk. I gennemsnit udstillet omkring 66% af cellerne analyseres den højeste grad af tdTomato fluorescens. Derfor, EDTA/celle opsving-protokollen kunne anvendes til at isolere delmængder af EGCs hele tyndtarmen og tyktarmen mærket af reporter at undersøge forskelle i genekspression.
Denne protokol genereret et tilstrækkeligt antal forholdsvis ren GFAP + glial celler til biokemiske undersøgelser og western blot analyse 10. for at demonstrere glial celler lydhørhed, en 3-dages glial celler prep blev behandlet med hormoner cholecystokinin (CCK) eller gastrin at fremkalde Ca2 + flux (figur 7A-7B)10. Resultaterne viste, at disse GFAP + vedhængende celler reagerede ekstracellulære agonister demonstrere deres evne til at udstille kendte enterisk glial funktion.
Figur 1: sat op og forberedelse af mus tarmene. (A) billede af isolation sat op på isen herunder udtrukne tarme. (B) billede 5 mL-sprøjte knyttet til en 20 G stump ende nål til at skylle ud fecal indhold. (C) tekniker slutningen af et træ vatpind (~ 4 cm) iblødsætning i DPBS buffer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: trin bruges til at rense tarmene og fjerne den langsgående muskel/myenteric plexus (LMMP). (A-C) Glidende en tarm segment på en fugtet træ stick. (D) fjernelse af vedhængende mesenterium. (E) Nicking tarmen med et barberblad. (F) at fjerne LMMP med en fugtig vatpind. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: sekventielle Flow-through efter EDTA inkubationer. Vist er eksempler på flow-through fra 4 sekventielle inkubationer ved hjælp af tre 7 cm intestinal segmenter inkuberes i 10 min med 5 mM EDTA / 10mM HEPES i DPBS og derefter den triturated 20 gange. Repræsentative flow-through efter at hælde gennem en 100 µm nylon mesh si er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: EGC billeder 24 h efter plating. Lys mikroskopisk undersøgelse af resuspenderede celler 24 h efter plating. (A) vist er et repræsentativt eksempel på en dårlig prep viser flydende epitelcelle klumper (pil) og debris. Ingen tilhænger EGCs blev observeret efter 24 h. (B) vises er et repræsentativt eksempel på en fremragende prep 24 h efter celle isolation og resuspension pletter af EGCs overholdt PDL/Laminin overtrukne plader. Billeder blev fanget på en inverteret fluorescerende mikroskop med et digitalt kamera. Skalere barer = 500 µm (A-B). (C) High power view af en patch af EGC celler farves med GFAP antistof (grøn) viser celler i periferien med en højere intensitet af mærkning. Flere af cellerne viste dobbelt kerner (pilespids, DAPI, blå). (D) Colocalization af GFAP (grøn) med S100 (rød) eller p75NTR (rød). Skalere barer = 20 µm (C-D). Cellerne var monteret med en antifade reagens og DAPI (blå kerner). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Flow flowcytometri enterisk glial celler isoleret fra duodenal lamina propria af voksen mus. (A) immunfluorescens af GFAP, S100B og Sox10 på EGC kulturer efter 3 dage. Pilene angiver Sox 10 positive kerner. Skalere barer = 20 µm (anvendes med tilladelse fra lene attenhøj et al. 10). (B) procent af GFAP positive celler før plating på overtrukne plader (Fluorescens intensitet (eller forward scatter, x-aksen) versus side scatter (y-aksen). (C) procentdel af GFAP positive (D) α-SMA positive (E) E-cadherin positive (F) og Pgp 9.5 positive celler 3 arbejdsdage plating. Gates var konstrueret til at undgå døde celler og små klippestykker. Vist er den gennemsnitlige procentdel af fluorescerende befolkningen i forhold til antallet celler (side scatter). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Identifikation af entero gliaceller isoleret fra duodenal lamina propria af hGFAP-Cre+: tdTomato+ voksen mus. Endogene tdTomato fluorescerende (rød) billeder blev fanget på en fase kontrast fluorescerende mikroskop med et digitalt kamera i (A) tarmen. (indsat) Samme som A bortset fra sammenlagt med DAPI billede (blå kerner). (B) kolon fusioneret med DAPI. C entero glial celler (rød) isoleret fra hGFAP-Cre:dtTomato+ mus og kulturperler i 3 dage på PDL/Laminin substrat. Skalere barer = 50 µm. (D) Flow cytometric analyse af tdTomato celler. Vist er den gennemsnitlige % af GFAP + celler ± SEM til 3 forskellige præparater (3 mus pr. prep). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Video af Ca2 + fluxe efter hormonbehandling. EGCs belagt på 24-godt PDL og laminin overtrukne plader var kulturperler i glial vækst medier i 3 dage. Cellerne var præinstalleret med 3 µM af Fura-2-AM i 20 min. ved 37 ° C og derefter blev behandlet med (A) 100 nM cholecystokinin (CCK) eller (B) 100 nM gastrin. Venligst klik her for at downloade denne fil.
| Komponenter | Volumen skal føjes | Endelig koncentration |
| DMEM/F12 | 44,5 mL | _ |
| Føtal bovint Serum (FBS) | 5 mL | 10% |
| Penicillin-Streptomycin | 500 ΜL | 100 IE/mL Pen |
| Streptomycin | 100 µg/mL Strep | |
| Gentamicin (50 mg/mL stock) | 20 ΜL | 20 µg/mL |
Tabel 1: Sammensætningen af Glial celler Resuspension medier.
| Komponenter | Volumen skal føjes | Endelig koncentration |
| DMEM/F12 | 44 mL | _ |
| Føtal bovint Serum (FBS) | 5 mL | 10% |
| Penicillin-Streptomycin (100 x) | 500ΜL | 100 IE/mL (Pen) |
| 100 µg/mL (Strep) | ||
| Gentamicin (50 mg/mL stock) | 20 ΜL | 20 µg/mL |
| GDNF (10 µg/mL stock) | 50 ΜL | 10 ng/mL |
| L-glutamin (200 mM stock) | 500ΜL | 2 mM |
Tabel 2: Sammensætning af Glial celle vækst medier.
| Komponenter | Immunfluorescens fortynding | Flowcytometri delstrømsfortynding |
| Kylling anti-GFAP | 1 til 500 | 1 til 2000 |
| Kanin anti-S100 | 1 til 500 | 1 til 500 |
| Musen anti-p75 NTR | 1 til 500 | 1 til 500 |
| Ged anti-E-cadherin | 1 til 400 | |
| Musen anti-Pgp9.5 | 1 til 500 | |
| Ged anti en glat muskel aktin | 1 til 500 | |
| Alexa Fluor 488 ged anti-kylling IgY | 1 til 1000 | 1 til 1000 |
| Alexa Fluor 568 ged anti-mus IgG | 1 til 1000 | 1 til 1000 |
| Alexa Fluor 594 æsel anti-kanin IgG | 1 til 1000 | |
| Alexa Fluor 488 æsel anti-ged IgG | 1 til 1000 |
Tabel 3: Oversigt over antistoffer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EGCs spiller en vigtig rolle i gut homøostase, og det er vigtigt at isolere og studere dem in vitro. I denne protokol, blev en simpel metode til at isolere EGCs fra lamina propria af voksen mus tarmen indført for at studere enterisk glial funktion.
Fjernelse af vedhængende mesenterium og LMMP med en vatpind fjerner nogle af de inter-myenteric glia bopæl mellem den langsgående og cirkulær muskler, øger tilgængeligheden af buffere submukøse overflade og fjerner meget af de større kapillærer . Sidstnævnte reducerer antallet af røde blodlegemer forurener de endelige kulturer. Serien af EDTA inkubationer strimler væk epitelial slimhinden udsætter lamina propria og submukøse glia, som kan være skrøbelige efter udsættelse for en chelaterende løsninger. Agitation ved rysten, vortexing eller triturating (gentagne op og ned ad pipettering) skal udføres omhyggeligt og timet til at undgå uforholdsmæssigt store skader på cellerne. Ændring blev brugt her, fordi teknikken resulterede i en mere ensartet udbytte af vedhængende, levedygtig glial celler. Ryster tendens til at indføre bobler og nedsætte cellers levedygtighed vurderet morfologisk af celle overholdelse af de belagte plader. Vævet skal være skåret i stykker < 0.5 cm til effektivt hakkede væv med 5 mL pipette.
Generelt, 7 cm segmenter fra mindst 3 mus er tilstrækkelige til at generere nok EGCs for at dække et 6-godt plade på ca. 20-30% confluency, som derefter kan bruges til immuncytokemi og qPCR. Men flere celler kan være påkrævet for biokemiske metoder såsom western blotting afhængigt udtryk af genet studerede. Selv, Skriv 1 collagen eller Matrigel blev kortvarigt undersøgt som et alternativ til poly-D-lysin/Laminin substrat, større overholdelse af befolkningens epitelcelle blev observeret, i sidste ende stigende forurening af EGC kulturer med andre celletyper . Derudover type 1 kollagen overholder ikke fast til pladerne og var nemt forrykke sig fra overfladen når skiftende medier. Fibronektin er en anden substrat, der har været brugt24, men blev ikke testet her. Laminin øger tilsyneladende bindende og differentiering af neurale crest afledt celler25. Men masser af laminin kan variere, påvirker celle overholdelse og udbytter. Mikrobiel forurening kulturer opstod omkring 5% af tiden og blev holdt på et minimum ved brug af sterile reagenser, teknik og antibiotika. Brug en svampedræbende reagens var valgfri.
Den største begrænsning af protokol her er standardisering af agitation fjerne epitel uden at skade de underliggende EGCs. Desuden kan ikke vurdering af præparatet gøres straks da det afhænger af celle overholdelse af de belagte plader. Tre områder til at fokusere på, når fejlfinding omfatter: 1) brug af friske PDL og laminin til pels plader; 2) minimere tiden fra dissektion til begynder EDTA inkubationer ved at øge antallet af assistenter; 3) kvantificere tid og metode til at agitere væv for at fjerne effektivt epitel og derefter EGCs. Udvide tid i et af disse trin øger EGC skrøbelighed og sandsynligheden for, at de ikke vil gendrive når belagt i vækst medier. Selv om metoden ændring at adskille epitel blev brugt her, rysten og vortexing blev også testet med inkonsistente resultater måske fordi det er mere operatør afhængige og vanskelige at kvantificere. Når forgyldt udbyttet af vedhængende celler var større, hvis cellerne ikke blev forstyrret i 16-24 timer.
Metoden præsenteres her blev ændret efter den oprindelige undersøgelse af Smith et al. 12, som fokuserede på isolering af LMMP. Metoden Smith blev brugt her kun at fjerne og kassere LMMP, så at de fleste af gliaceller isoleret ville stammer fra submucosa og lamina propria. Derudover uden Enzymatisk nedbrydning er myenteric EGCs ikke let befriede12. Ikke desto mindre, da der er ingen specifikke markører for myenteric versus submukøse glia, forekomsten af glial celler fra inter-myenteric plexus kan ikke udelukkes. Rosenbaum et al. rapporteret flow cytometric analyse af EGCs udtryk for forbedrede grøn fluorescerende proteiner (EGFP) fra hGFAP initiativtageren. De brugte meget unge mus (postnatal dag 7) og isoleret EGCs fra hele tarmen af enzymatisk fordøjelsen19. Derudover blev flow cytometric analyse udført efter to uger om at opretholde betingelser, som fremmes frit svævende neurosphere dannelse. Selv om forfatterne rapporterede, at neurospheres meget udtrykt både GFAP og S100b, udtrykt flydende celle aggregater også kraftigt α-SMA, tyder på, at udvidelse af befolkningens myofibroblast celle tilskyndet gliosphere udvikling i modsætning til fladt ark-lignende morfologi beskrevet her. Derfor, mens interessant, undersøgelsen er ikke direkte sammenlignelige med denne protokol. Derimod morfologi af cellerne kombineret med betydeligt mindre α-SMA + celler tyder på, at de EGCs, der er beskrevet i denne protokol ikke udviser den 3-dimensionelle morfologi i 3 til 5 - dages kultur periode. Ikke desto mindre, både protokollen her og metoden Rosenbaum bruge en fluorescerende reporter til at identificere og isolere GFAP + celler, der vil forbedre investigator's evne til at live celle profilering.
Afslutningsvis beskriver den nuværende protokol isolering af entero glial celler fra submucosa ved hjælp af en ikke-enzymatisk metode. Hele protokollen tager omkring 3 timer fra mus dissektion til indledende plating på forhånd belagte vævskultur plader. Mest tid intensiv trin i protokollen er fjernelse og forberedelse af tarmene til første EDTA inkubation. Forberede pladerne og opbevaring i DPBS anbefales kraftigt. Succesen ved præparatet, afhænger effektiv fjernelse af epitel uden at skade de underliggende EGCs og overholdelse af PDL/Laminin belagt pladerne inden for 24 h. primære EGCs er nyttige for in vitro- undersøgelser som biokemiske analyser, Ca2 + strømme og adenoviral transfections10. Det forventes, at evnen til at isolere EGCs fra enten submucosa eller LMMP vil tillade yderligere undersøgelser for at definere forskellene i EGC vækstegenskaber, differentiering og morfologi ved hjælp af samlede genom tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende støtte fra R37 DK045729 (til JLM), R01 AR060837 (til HX) og University of Michigan gastrointestinale Research Center molekylære Core P30 DK034933.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D lysine (1 mg/mL stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/mL stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5 M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50 mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 |
References
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas? Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
