Summary
여기, 우리 장 submucosa 순차적 EDTA 외피를 사용 하 여 divalent 양이온 그리고 외피 비 효소 세포 복구 솔루션에 킬레이트 하에서 장 glial 세포의 설명. 폴 리-D-리 신과 laminin에 결과 세포 현 탁 액을 도금 기능 분석을 위한 submucosal glial 세포의 매우 풍부한 문화에 발생 합니다.
Abstract
신경 세포 및 평활 근 벽, submucosa 및 lamina propria 상주 장 glial 세포 (EGCs) 장 신 경계 (ENS)에 의하여 이루어져 있다. EGCs 다양 한 영양 요인의 출시를 통해 직감 항상성에서 중요 한 역할을 하 고 상피 방 벽의 무결성을. 기본 장 폐해 문화의 대부분 연구 사용 세포 효소 분리 후 myenteric 총에서 분리. 여기, 격리 하 고 장 submucosa 및 lamina propria EGCs 문화 비 효소 방법 설명 되어 있습니다. 경도 근육 층의 수동 제거 후 EGCs lamina propria submucosa 상용 비 효소 세포 복구 솔루션에 외피 다음 순차 HEPES 버퍼링 EDTA 외피를 사용 하 여에서 해방 되었다. EDTA 외피 세포 복구 솔루션 submucosal EGCs 해방 수 있도록 lamina propria에서 상피 점 막의 대부분을 제거 하기에 충분 했다. 모든 잔여 lamina propria와 부드러운 근육 myenteric 명과 함께 삭제 되었다. EGCs 쉽게 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP)를 표현 하는 그들의 능력에 의해 확인 되었다. 세포 현 탁 액의 약 50% 포함 된 GFAP + 셀 조직 외피를 완료 한 후 폴 리-D-리/laminin 기판에 도금 하기 전에. 그러나, glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF)에서 세포 배양의 3 일 후-문화 미디어를 포함, 기판 코팅 판에 고착 하는 세포 인구 구성 > 95% 장 명과. 우리는 hGFAP-Cre 마우스 GFAP + 생 세포 형광을 사용 하 여 셀의 비율을 추적 하는 사 tdTomato 기자 라인을 사육 하 여 하이브리드 마우스 라인을 만들었습니다. 따라서, 비-myenteric 장 명과 비 효소 방법으로 격리 하 고 적어도 5 일 동안 배양 될 수 있습니다.
Introduction
장의 glial 세포 (EGCs)의 기능에 대 한 관심 용기 무결성 및 항상성1,2에 그들의 인식된 역할 때문에 꾸준히 증가 했다. 또한, EGCs GI로3,4의 길이 따라 위치에 따라 다릅니다. EGCs glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF) 등 다양 한 영양 요인 해제, 운동1,5 를 직감 하 고 미생물 부산물6,7에 응답을. 연구는 EGC 인구는 이기종 및 그들의 기능 여부 submucosal 또는 myenteric 총1,7내 따라 나타내 었 다. 예를 들어 내는 submucosa EGCs 꽉 접속점8에 기여 한다. 차동 GFAP 표현과 EGCs 인 산화가 장애9의 본질적인 표현 형에 그들의 가능한 연결을 제안 하는 파 킨 슨 병에 연결 되었습니다. 최근, 인접 장 submucosa에서 EGCs의 고립 된 문화에 있는 핵 단백질 menin의 손실을 했다 호르몬 gastrin10의 식을 유도 하기에 충분 한 관찰 되었다. 결과적으로, 그것은 EGCs 십이지 장 gastrinomas, 신경 내 분 비 종양10의 종류의 수 있습니다 제안 했다. 샨 다, 이러한 예 절연된 EGCs neuropathic 질환 및 암11의 기능과 동작의 관련성 밑줄.
필드에 도전 중 하나 또는 모두 EGC 인구에서 생체 외에서연구를 격리 하는 방법 남아 있습니다. 혈통 추적 실험 submucosa 및 lamina propria EGCs myenteric 총7에 조상 세포에서 발생 설명 했다. 여러 게시 된 격리 프로토콜 myenteric EGCs12,13,14,15,,1617의 문화를 생성 하는 사용할 수는 있지만 18,19, 아무도 특히 submucosal/lamina propria EGC 인구의 격리 대상. EGC 격리에 대 한 기존 프로토콜은 특별히 기계적 분리의 조합 또는 효소 분리, 점 막 세포 층을 결국 삭제와 함께 부드러운 근육의 기정을 사용 합니다.
이 원고의 목표 비 효소 lamina propria 생체 외에서 연구에서 기본 EGCs를 분리 하는 단계를 설명 하는 것입니다. 특별히 그는 submucosa에서 myenteric EGCs 구별 없는 마커 때문 평활 근에서 상피 점 막의 공간 분리 submucosal EGCs을 악용 했다. 또한, EDTA chelation 비 효소 분리와 결합 하 여 EGCs 관련된 인터 myenteric EGCs 함께 삭제 되었다 부드러운 근육 달리 submucosa 격리 했다. Submucosa의 lamina propria EGCs 더 분리 glial 세포 친화적인 기판, 예를 들어, 폴 리-D-리 신과 laminin에 세포 배양에 의해 발생 했습니다.
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Protocol
설명 하는 모든 동물 실험 동물의 관리 및 사용에 미시간 대학 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 멸 균 폴 리-D-리 (PDL)와 Laminin 솔루션의 준비
- 셀 격리 전에 적어도 1 일 폴 리-D-리 (PDL)와 laminin 코팅 접시를 준비 합니다.
참고: 6-잘, 12-잘 접시 실험 목표에 따라 준비 되었다. 일반적으로 12-잘 접시 서쪽 오 점;를 사용 하 여 정량 분석을 위해 사용 했다 반면, 6 잘 플레이트 immunohistochemistry 위해 압력가 마로 소독 (살 균) coverslips를 사용 했다. 24-잘 접시 EGCs 캘리포니아2 + 에 대 한 문화를 사용한 영상 유출. - 재고 솔루션 DNase 무료 고 공기 HEPA 필터와 후드를 조직 문화에서 RNase 무료 물 초순 조직 문화 등급을 희석.
-
살 균 유리 coverslips
- 소독 집게와는 coverslip를 누른 coverslips 15 분 조직 문화 후드에 증발 하 고 6 잘 플레이트에 장소를 허용 에탄올에 대 한 100% 에탄올의 비 커에 담가.
- 또는 개별적으로 2mm 두께 압 종이 플라스틱 용기 그리고 압력솥에 여러 coverslips를 배치 합니다.
2. 코팅 판
참고: 메 마른 조직 문화 층 류 두건 아래이 단계를 수행 합니다.
- 1 mg/mL PDL 재고를 해 동 하 고 최종 농도 100 µ g/mL를 무 균, 조직 문화 학년 물 1시 10분 희석. 6 잘 플레이트, 12-잘 접시의 한 잘 커버를 1 mL 및 24-잘 접시에서 한 잘 0.5 mL 코트 잘 당 2 mL를 사용 합니다. -20 ° c.에 12 mL aliquots에 나머지 희석된 PDL를 저장
- 적어도 1 시간에 대 한 웰 스 코트 PDL 허용 후 살 균 피 펫으로 PDL을 제거 합니다. 공기 접시 조직 문화 층 류 두건 아래 완전히 건조 허용 합니다.
참고: 제거한 후 살 균 피 펫으로 PDL 솔루션, 그것은 수 두 번 사용 1 주일 이내 더 0.22 μ m 필터를 통과 하 고 4 ° c.에 저장 후 - Laminin 재고 젤 형성을 피하기 위해 얼음에 녹여
참고: Undiluted laminin이 된다 8 ° c.의 위 예 열 때 고체 - Laminin 주식 (0.5 mg/mL) 1: 50으로 살 균 Dulbecco 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS) 10 µ g/mL의 최종 농도를 희석. -20 ° c.에 12 mL aliquots에 희석된 laminin를 저장
- 포함 하는 웰 스에 희석된 laminin 건조 PDL 추가 합니다. 6 잘 표면 및 12-잘 접시의 바닥을 커버 0.5 mL을 1 mL을 사용 합니다. Coverslips, 400 µ L 희석된 laminin의 표면 범위를 달성 하기 위해 coverslips를 추가 합니다.
- 접시 같은 날 (빠른 코팅) 사용 하는 경우 2 시간, 37 ° C에서 코팅된 접시를 품 어. 아니라면, 번호판, 플라스틱 포장으로 밀봉 하 고 하룻밤 4 ° C (느린 코팅)에서 저장 합니다.
참고: 씰링은 건조 및 오염 방지 하기 위해 중요 합니다. - 신중 하 게 표면 긁힘 방지를 피펫으로 laminin 솔루션을 제거 합니다. 부드럽게 세척 살 균 DPBS와 세 번 웰 스.
- 각 완전 한 폐해 성장 미디어 고 37 ° C에서 번호판 EGC 정지를 추가할 준비가 될 때까지 유지 추가 합니다.
참고: 폴 리 D lysine과 laminin 코팅 접시 4 ° c.에 3 일 동안 저장 될 수 있다 코트 판 몇 일 앞두고 4 ° C에서 저장, 세척 살 균 DPBS와 번호판 세 번. 최종 세척 후 각 잘 하 메 마른 DPBS 2 mL를 추가 합니다. Parafilm와 4 ° c.에 게 접시를 봉인 그것은 laminin를 건조 하지 않습니다 보장 하기 위해 필수적 이다.
3입니다. 격리 솔루션의 준비
- EDTA/HEPES/DPBS 분리 솔루션을 준비 합니다. 솔루션의 500 ml (칼슘, 마그네슘) 없이 메 마른 DPBS 10 mM HEPES 및 5 mM EDTA의 최종 솔루션을 사용 합니다. DPBS의 490 ml 1 M HEPES 버퍼의 5 mL 및 0.5 M EDTA 재고 솔루션의 5 mL를 추가 합니다. 사용 될 때까지 4 ° C에서 저장 합니다.
- 표 1에 나열 된 시 약을 사용 하 여 glial 세포 물의 resuspension 미디어를 준비 합니다.
- 표 2에 나열 된 시 약을 사용 하 여 폐해 성장 미디어를 준비 합니다.
참고: 폐해 성장 미디어 GDNF를 포함 하는 4 ° c.에 1 주 동안 저장 될 수 있다
4입니다. 장 세그먼트의 제거
참고: 마우스 isoflurane 드롭 메서드는 중요 한 장기의 제거에 의해 식품 및 euthanization 이전 물이 허용 되었다. C57BL/6 쥐 나이의 8 주 이상 사용 되었다. 두 남녀는 준비에 눈에 띄는 차이 없이 사용 되었다.
- Isoflurane의 과다와 함께 마우스를 안락사 하 고 배치 해 트레이에 부정사. 사지를 고정 하 고 70% 에탄올과 복 부를 소독. 집게와 피부 천막 한 다음가 위로 복 부를 엽니다.
- 간 들어올리고 원심 위/pylorus 식별 합니다. 7cm 근 내장의 제거. 수 소장을 찢 어 하지 않도록 주의 하십시오.
-
mesentery를 멀리 자르는 동안는 pylorus 집게로 잡으십시오.
- 긁어 멀리 부착 췌는 시저의 뒤를 가진 무뚝뚝한 해 부를 사용 합니다.
- 캘리포니아2 + 또는 Mg2 + (그림 1A) 없이 얼음 처럼 차가운 DPBS로 장 세그먼트를 놓습니다.
참고: 다른 세그먼트의 창 자 또는 결 장 또한 제거할 수 있습니다 동일한 기술을 사용 하 여.
- 사용 5 또는 10 mL 주사기를 얼음으로 지저분한 내용을 플러시 무뚝뚝한 끝 20 G 바늘에 연결 된 차가운 DPBS (그림 1B).
- 3 cm 세그먼트 처음 스미스 그 외 여러분 에 의해 설명 된 기술을 사용 하 여 경도 근육을 제거 하 내장을 나눕니다 12 Sundaresan 그 외 여러분 에서 수정 하 고 10.
참고: 최대 2 개의 마우스에서 장 세그먼트 HEPES/EDTA/DPBS 격리 솔루션의 30 mL 당 사용 됩니다. - 면 끝에서 나무 막대기를 별도로 약 4 cm를 끊다. DPBS (그림 1C)에 나무 막대기를 담근 다.
- 부드럽게 젖은 스틱 (그림 2A-C)에 장 세그먼트 중 하나이 구 요.
- 부착 mesentery 아직도 바늘 코 집게 (그림 2D)를 사용 하 여 연결을 제거 합니다.
-
깨끗 한 면도날을 사용 하 여 또는 두 세로 닉스는 mesentery가 내장 따라 있도록 메스 연결 (그림 2E).
- 젖은 DPBS 면 끝. 경도 근육/myenteric 총 (LMMP)를 풀고 근육을 따라 경도 침수 면 팁을 문질러. 그런 다음 이동 면 팁을 가로로 LMMP 제거 하는 동안 멀리 장 세그먼트의 길이 따라 원형 근육에서 LMMP를 애타게.
- 중간 및 네 번째 손가락 (그림 2F) 세그먼트를 안정화 하면서 엄지손가락과 집게손가락 사이 막대기의 끝을 잡으십시오. 완료 되 면는 LMMP 장 세그먼트에서 쉽게 껍질 것입니다.
- 삭제는 LMMP 장 튜브에서 제거 하 고 myenteric 총에서 EGCs를 수확 하지 않으면 면봉에 연결 된 원하는.
- 나무 막대기에서 제거 하는 경도 장 세그먼트 오픈 혹 평에 면도날을 사용 합니다.
- 얼음에 DPBS 박탈된 장 조직 (주로 점 막과 submucosa 플러스 원형 근육)을 저장 합니다. 모든 장 세그먼트 준비가 될 때까지 단계 4.4-4.11을 반복 합니다.
5입니다. 상피 점 막의 제거
- 좋은 위 창 자 ~0.5 cm의 작은 조각으로 잘라.
- 장소 살 균 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 30 mL의 얼음 처럼 차가운 EDTA/HEPES/DPBS 솔루션을 포함 하는 조직.
- 10 분 ~ 60 분 당 젖 힌 채에 4 ° C에서 포함 하는 조직 솔루션을 바위.
- 미리 한 번 위아래로 EDTA/HEPES/DPBS 버퍼를 pipetting으로 5 mL 플라스틱 피 펫을 축 축 하 게 하 고 다음 조직 플라스틱 버퍼 정지 (분쇄) 위아래로 20 번을 미리 moistened 피 펫을 사용 하 여 상피 점 막 꺼내 려.
- 100 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 혼합물을 붓는 하 여 EDTA 외피에서 조직을 수집 합니다. 폐기는 혼 탁 한 점액 가득한 자형 (그림 3).
- 얼음의 30 mL를 포함 하는 새로운 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에는 스 트레이너에서 유지 조직 장소 차가운 EDTA/HEPES/DPBS 바늘 코 집게를 사용 하 여.
- 락을 10 분 ~ 60 젖 힌 채를 추가 상피 점 막에서 분 당에서 4 ° C에서 조직 하 여 EDTA/HEPES/DPBS 외피를 두 번 반복 합니다.
- 미리 해당 버퍼와 함께 5 mL 피 펫을 축 축 하 게 하 고 점 막 세포를 꺼내 려 20 번 위아래로 조직 정지 플라스틱.
참고: 조직 상피의 제거 이다 피펫으로 내부에 집착 하는 경향이 됩니다. - 100 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 혼합물을 붓는 의해 두 번째 부 화 후 조직을 수집 하 고 삭제를 통해 흐름. 두 번째 흐름 통해 첫 번째 (그림 3) 보다 눈에 띄게 덜 혼 탁 한 이어야 한다.
- 반복 때까지 솔루션은 거의 10 분 EDTA 외피 취소 (조직의 양과 분쇄의 효과 따라 약 3-4 외피) (그림 3).
6. 고 Lamina Propria Submucosa에서 장의 Glial 세포의 수집
- 15 mL 원뿔 원심 분리기 관 상용 셀 복구 솔루션 및 4 ° c.에 25-30 분 동안 바위의 5 mL를 포함 하는 조직 나일론 여과기에서 전송
-
Lamina propria에서 장의 glial 세포 분열을 부드럽게 10 x triturate
- 깨끗 한 50 mL 튜브에서 filtrate 수집 및 40 µ m 필터를 통해 필터링 합니다.
- 조직 DPBS의 1 mL와 함께 나일론 필터에 린스.
- 조직의 삭제 하 고 전송 ~ 5-6 깨끗 한 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 여과 액의 mL.
- 2000 x g 4 ° c.에서 5 분 동안 스윙 양동이 원심 분리기에서 여과 액을 스핀
- 다시 일시 중단 glial 세포 포함 된 펠 릿 1 mL 이상 물의 resuspension 버퍼에에서 부드럽게 500 µ L 피 펫 팁 위쪽 및 아래쪽 펠 릿 pipetting으로. 거품을 소개 하지 마십시오.
참고: 우물과 번호판의 수에 대 한 필요에 따라 물의 resuspension 볼륨을 조정 합니다. 예를 들어 1.2 mL 한 6-잘 접시; 2.4 mL 두 6 잘 플레이트; 2.4 mL 1 12-잘 접시입니다. - 폐해 성장 매체를 포함 하는 12-잘 코팅 PDL laminin 번호판에 대 한 6-잘 또는 100 µ L의 각 음에 세포 현 탁 액의 200 µ L 플라스틱.
- 접시에 셀을 추가 하 고 준수 하는 셀의 최대 수 있도록 37 ° C 배양 기에서 배치 후 요리를 방해 하지 마십시오.
참고: 셀의 건강 준비 6-8 h 이내 첨부 것입니다 하지만 부드럽게 비 부착 한 세포와 함께 미디어를 pipetting으로 미디어를 변경 하기 전에 적어도 24 시간 기다립니다. - 3-4 일 후에 그들은 문화 (그림 4)에 배치 된 실험에 대 한 셀을 사용 합니다. 특정 단백질 마커 (표 3)에 대 한 관심의 항 체를 사용 하 여 immunofluorescent 분석을 수행 합니다. 예를 들어, GFAP, S100b 및 Sox10 p75NTR 여기 사용 되었다. E cadherin 또는 알파 부드러운 근육 말라 항 체는 다른 세포 유형에서 오염 정도 평가 하기 위해 사용 되었다.
7. immunofluorescent 얼룩
- 문화에서 미디어를 발음 하 고 PBS로 두번 씻어.
- 4 %paraformaldehyde 실 온에서 20 분에 대 한 문화를 수정.
- 정착 액을 제거 하 고 PBS로 3 회를 씻어.
- 0.2%를 포함 하는 PBS를 가진 세포를 permeabilize 실 온에서 트라이 톤 X-100.
- 반대로 닭 IgY, 반대로 토끼 또는 실 온에서 2 h에 대 한 반대로 마우스 IgG의 구성 차단 솔루션 permeabilized 셀을 품 어.
-
셀 주 항 체 하룻밤, 예를 들어, GFAP (1:1, 000)을 품 어.
- 3 회 PBS로 세포를 씻어. 만약 colocalization 수행 단계 7.7로 이동 합니다.
- 실내 온도에 적어도 2 시간에 대 한 기본 항 체의 다음 세트를 품 어 하지만 선호 4 ° c.에서 하룻밤 토끼 반-S100 1:1000 희석 또는 마우스 안티-p75NTR의 1: 500 희석 사용 합니다.
참고: 모든 항 체는 PBS에 희석. - 3 회 1 차 항 체를 제거 하는 PBS 가진 세포를 씻어. 그런 다음 적절 한 붙일 태그 2 차 항 체 (표 3) 실 온에서 2 h와 함께 씻어 서 세포를 품 어.
- 2 차 항 체를 제거 하는 PBS로 3 번 씻어.
- DAPI와 설치 미디어의 1-2 방울을 사용 하 여 슬라이드에 coverslips를 탑재 하 고 형광 현미경으로 세포를 봅니다.
8. Cytometry
- 한번 DPBS 셀을 rinsing 하 여 cytometry에 대 한 부착 glial 세포를 제거 하 고 제조 업체의 프로토콜 당 0.25% trypsin EDTA를 추가. 완전 한 glial 세포 성장 매체에 셀을 수집 하 여 3 분 종료 소화에 대 한 37 ° C에서 트립 신-EDTA 용액에 세포를 품 어.
- 5 분에 대 한 400 x g 에서 centrifuging 여 세포를 수집 하 고 다시 PBS에 셀을 일시 중단.
- 10 분 동안 4 %paraformaldehyde 셀을 수정 하 고 permeabilize 0.2% 트라이 톤 X-100 PBS에 단계 7.4에 설명 된 대로.
- 1 %BSA 20 분, 예를 들어, 당나귀 안티 닭 IgY (IgG) (H + L) (1:1, 000) 또는 당나귀 안티 염소 IgG (H + L) (1:1, 000)에 대 한 조직의 특정 면역 글로불린을 포함 하는 PBS를 가진 세포를 차단 합니다.
- 셀 주 항 체 GFAP (1:2, 000), 품 어 E-cadherin (1:400), α-부드러운 근육 걸 (1: 500), 또는 Pgp9.5 (1: 500) 4 ° c.에서 하룻밤
-
PBS 가진 항 체를 씻어.
- 붙일 태그가 이차 항 체 30 분 동안 실 온에서 incubated와 항 원-항 체 복합물을 품 어.
- 이차 항 체와 incubated 셀의 별도 약 수를 사용 하 여 isotype 컨트롤 역할을. 셀의 두 인구 씻어 고 cytometry 이전 PBS에 resuspended.
- 라이브 셀에 게이팅 하 여 교류 cytometer 세포의 2 개의 인구를 분석.
9.는 hGFAP에서 마우스 조직 준비-Cre:tdTomato 쥐
참고: Lox-정지-Lox-tdTomato cDNA로 사 로커 스22,23 (잭슨 실험실, #007914)에서 표현 하 고 생 형광 Cre recombinase (hGFAP-Cre)를 표현 하는 마우스를 사육 하는 때를 생성 합니다. 현장에서 분석 언된 조직 단면도 생성 하 여 수행 됩니다.
- 1 시간에 대 한 4 %paraformaldehyde 장 조직 수정 하 고 하룻밤 PBS에서 1 M 자당에서 탈수.
- 상업적으로 최적의 절단 조직 (10 월) 복합 구성 10% 폴 리 비닐 알콜의 구입에서 조직 포함 및 4.2% 폴 리 에틸렌 글리콜, 및 다음 액체 질소에서 동결.
- 5 µ m cryosections를 준비 하 고 DAPI 미디어를 장착 한 antifade를 사용 하 여 탑재.
- hGFAP에서 EGCs cytometry에 대 한 준비-Cre:tdTomato+ 마우스 4.1-6.5 단계에 설명 된 대로.
- 3 일 후에 단계 8.1에서 문화 접시에서 셀 trypsinize 하 고 4 %paraformaldehyde 10 분 수정.
- 세포는 hGFAP에서 분리 하는 세포와 병렬로 Cre 부정 쥐에서 분리 분석-교류 cytometer에 Cre:tdTomato+ 쥐.
참고: 빌 게이츠는 죽은 세포와 파편을 피하기 위해 건설 되었다.
10. 캘리포니아2 + 영상 유출
- 3 µ M와 24-잘 접시에 도금 EGCs를 품 어 Fluo-4-오전 30 분 동안 37 ° C에서.
- 이미지 회전 디스크 confocal 현미경 및 480의 여기 파장을 사용 하 여 상업적으로 구입한 Tyrode의 솔루션에서 Ca2 + 신호 CCK 또는 gastrin 펩 티 드를 추가한 후 (F480) nm. 이미지 분석이 알려졌다 Sundaresan 외. 10 .
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Representative Results
Preps는 GFAP + 셀 준수 하지 않았고 24 h (그림 4A) 내에서 확산 하는 경우 실패 한 고려 되었다. Glial 세포 수 전지와 준수 플랫 집계 (그림 4B)으로 확산의 증거를 보여주었다 때 24 h 이후까지 확인할 수 없습니다. 클러스터의 가장자리에 세포는 긴 프로세스를 확장 하는 경향이 하 고 고전적인 glial 마커, 예를 들어, GFAP, S100b 및 p75NTR (그림 4C, 4d)10,16. 2nd 하루 glial 세포 비 점착 인구 PBS로 멀리 씻어 서 있을 수 있도록 표면에 밀접 하 게 준수 됩니다. 떠 있는 세포의 대부분은 상피 그리고 lamina propria 세포 세포 파편과 함께. 이러한 부동 셀 덩어리의 존재까지 통해 흐름은 거의 분명 하 고, 상피 세포는 lamina에서 제거 된 신호 EDTA 외피를 수행의 중요성을 강조 하는 부착 glial 세포의 수익률 감소 오는 코어. 또한, 세포 복구 솔루션에 잠복기 후 1500 x g 보다 낮은 속도로 원심 않았다 효과적으로 수집 하지 모든 가능한 셀 생산량 감소에 지도 펠 릿으로. 일반적으로 40000 100000 셀 EGCs 형태학 상으로 일치 주 3 문화에 의해 확고 하 게 준수 됩니다.
폐해 관련 된 항 체와 Immunohistochemical 분석 표시는 셀 클러스터의 그 남아 점착 하루 3 GFAP, S100b, 및 Sox 10 긍정적인10,16 (그림 5A). 현재 연구에서이 같은 정도의 순도 셀 permeabilizing 고 cytometry (그림 5B-F)에 의해 분석 하 여 관찰 되었다. 직후 submucosal/Lamina propria glial 세포를 분리, cytometry 밝혀 그 세포의 약 51 %GFAP + (그림 5B), 예를 들어, 상피, 조 혈, GFAP 부정적인 세포 유형의 존재를 제안 내 피, 신경 세포, 상피와 lamina propria에 존재 하기 위하여 알려진 myofibroblasts. 3 일 후에 문화, GFAP + 셀 수 대표 이상 95% 인구의 셀 원본 미디어를 제거한 후 분석, PBS와 rinsing 부드럽게 하 고 다음 추가 신선한 미디어 (그림 5C). 흥미롭게도, 흐름 분석 공개 및 로우 GFAP 단백질 표현 인구 (그림 5C). 실제로, 세포의 immunofluorescent 분석 클러스터의 주변 GFAP (그림 4C, 4d)의 상부를 표현 하는 경향이 나타났다. 함께 찍은, 분석의 두 가지 유형의 EGC 성숙도 나 분화 상태에 차이 나타낼 수 있습니다. Α의 총칭, 비율-SMA + (myofibroblast 셀 표식), E-cadherin + (상피 세포 마커), 그리고 Pgp 9.5 + (신경 세포 마커) 세포는 5% 미만 (그림 5D-F). 이러한 결과 선행 연구와 일치 했다 10의 약 93%를 보여주는 EGCs immunofluorescent 라벨을 사용 하 여 수행 GFAP + 세포. 흐름 분석 이후 문화의 약 5%를 함유 하는 오염 세포 인구를 제거 수 있도록 접시를 준수 하는 세포 수의 중요성을 밑줄.
이 연구에서 목표 고 생 형광 표식 (그림 6)를 사용 하 여 EGC 농축의 정도 비교 하기 위해 추가 분석에 대 한 셀의 cytometry GFAP 활성화 기자를 사용 했다. HGFAP-Cre 마우스 선 원래 았지 및 동료 20여 설명 했다. 간단히, Cre recombinase 인간의 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (hGFAP) 발기인의 2.2 kb의 통제 하에 두었다. 따라서 어떤 셀이 hGFAP 발기인 속기 빨간 형광 기자 tdTomato 표현. TdTomato 기자와 표시 셀 인구 시각화 된 제자리에 위에서 설명한 EGC 격리 절차를 수행 하기 전에 창 자와 콜론 (그림 6A, 6B)의 냉동된 섹션을 사용 하는. EDTA/셀 복구 격리를 수행 하 고 3 일 동안 세포를 배양, 후이 쥐에서 EGCs 쉽게 그들의 내 인 성 형광 (그림 6 c)에 의해 확인 되었다. 비록 GFAP + 셀 틀림 없이 근 위 소장4,21에 더 많은, tdTomato + EGCs 또한에서 관찰 되었다 콜론 (그림 6B). 또한 hGFAP의 모달 인구를 계시 했다 tdTomato+ 형광 기자 hGFAP-Cre에 의해 활성화를 사용 하 여-tdTomato + 세포 (그림 6D) GFAP의 immunofluorescent 분석을 사용 하 여 관찰로 단백질 (그림 5C). 모든 EGCs GFAP 단백질4표현으로 보고 되어,이 이때 GFAP 식의 수준에서 차이 반영 수 있습니다. 평균, 분석 하는 셀의 약 66 %tdTomato 형광의 최고 수준의 전시. 따라서, EDTA/셀 복구 프로토콜 소장 및 유전자 발현의 차이 검사 하는 기자에 의해 표시 된 콜론 EGCs의 하위 집합을 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜 비교적 순수한 GFAP + glial 세포의 생 화 확 적인 연구와 서쪽 오 점 분석에 대 한 충분 한 수를 생성 10. glial 세포 응답을 보여 3 일 glial 세포 준비 호르몬 cholecystokinin (CCK) 또는 캘리포니아2 + 플럭스 유도 gastrin 대우 되었다 (그림 7A-7B)10. 결과 이러한 GFAP + 부착 세포 세포 외 agonists 알려진된 장 폐해 기능을 전시 하는 능력을 보여주는 반응을 보였다.
그림 1: 설정 및 마우스 창 자의 준비. 추출 된 내장을 포함 하 여 얼음에 절연의 (A) 그림. (B) 그림 5 mL 주사기 20 G 무뚝뚝한 끝 바늘에 연결 된 지저분한 내용을 플러시합니다. (C) 나무 면봉 (~ 4 cm) DPBS 버퍼에 몸을 담글의 Engineered 끝. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 단계 내장을 청소 하 고 경도 근육/myenteric 총 (LMMP)을 제거 하는 데 사용. (A C) 젖은 나무 막대기에 장 세그먼트를 슬라이딩. (D) 부착 mesentery의 제거. (E) Nicking 면도날으로 소장. (F) 젖은 면봉으로 LMMP를 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: EDTA 외피 후 순차적 흐름-throughs. 표시 인 큐베이 팅 5 mM EDTA/10 mM HEPES DPBS에 다음 triturated를 가진 10 분 동안 20 번 3 7 cm 장 세그먼트를 사용 하 여 4 순차 외피에서 흐름-throughs의 예입니다. 100 µ m 나일론 메쉬 스 트레이너를 통해 쏟아지는 후 대표적인 흐름-throughs 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: EGC 도금 후 24 h 이미지. 도금 후 resuspended 셀 24 h의 가벼운 현미경 검사. (A) 표시 가난한 준비 부동 상피 세포 덩어리 (화살표) 및 파편의 대표적인 예입니다. 아니 점착 EGCs 24 h. 후 관찰 되었다 (B) 표시 셀 분리와 물의 resuspension EGCs의 패치가 PDL/Laminin 준수 코팅 판 후 우수한 준비 24 h의 대표적인 예입니다. 이미지는 디지털 카메라와 함께 거꾸로 형광 현미경에 체포 했다. 스케일 바 = 500 µ m (A-B). EGC 셀의 패치 (C) 고 출력 보기 (녹색) 주변에 셀 라벨의 높은 강도를 보여주는 GFAP 항 체와 스테인드. 여러 셀의 이중 핵 (화살촉, DAPI, 파란색)을 보여주었다. (D) Colocalization의 GFAP (녹색) S100 (빨간색)와 p75NTR (빨간색). 바 규모 = 20 µ m (C-D). 세포는 antifade 시와 DAPI (블루 핵) 탑재 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: cytometry 성인 마우스의 십이지 장 lamina propria에서 고립 된 장의 glial 세포의 흐름. (A) GFAP 면역 형광, S100B 및 Sox10 EGC 문화 3 일 후에. 화살표는 삭스 10 긍정적인 핵을 나타냅니다. 바 규모 = 20 µ m (Sundaresan 그 외 여러분 의 허가 함께 사용 10). GFAP (B) 비율 (형광 강도 (또는 앞으로 분산형, x 축) 쪽 분산형 (y 축) 대 코팅된 판에 도금 하기 전에 긍정적인 세포. GFAP 긍정적인 (D) α-SMA 긍정적인 (E) E-cadherin (F) 양수와 Pgp 9.5 긍정적인 세포 3 daysafter 도금의 (C) 비율. 게이츠는 죽은 세포와 파편을 피하기 위해 건설 되었다. 표시 된 셀 (사이드 분산형) 수를 기준으로 형광 인구 평균 비율이입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
HGFAP-Cre+의 십이지 장 lamina propria에서 고립 된 장의 glial 세포의 그림 6: 식별: tdTomato+ 성인 마우스. 생 tdTomato 형광 (빨간색) 이미지 (A) 내장에서 디지털 카메라와 함께 단계 대비 형광 현미경에 체포 되었다. (삽입) A를 제외 하 고 동일 DAPI 이미지 (파란 핵)와 합병. (B) 콜론 DAPI 병합. (C) Enteric glial 세포 (레드) hGFAP에서 분리-Cre:dtTomato+ 마우스 PDL/Laminin 기판에 3 일 동안 경작 하 고. 스케일 바 = 50 µ m (D) 흐름 cytometric 분석 tdTomato 세포의. 표시 된 GFAP + 셀 ± sem의 3 다른 준비 (3 쥐 준비 당)의 평균 %입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 비디오의 캘리포니아2 + 호르몬 치료 후 플럭스. EGCs 24-잘 PDL에 laminin 코팅 도금 플레이트 3 일에 대 한 폐해 성장 매체에서 경작 했다. 셀-37 ° C에서 20 분의 Fura-2 3 µ M와 로드 고 다음 치료와 (A) 100 nM cholecystokinin (CCK) 또는 (B) 100 nM gastrin. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
| 구성 요소 | 볼륨을 추가할 수 | 최종 농도 |
| DMEM/F12 | 44.5 mL | _ |
| 소 태아 혈 청 (FBS) | 5 mL | 10% |
| 페니실린-스 | 500 Μ L | 100 IU/mL 펜 |
| 스 | 100 µ g/mL Strep | |
| Gentamicin (50 mg/mL 주식) | 20 Μ L | 20 µ g/mL |
표 1: 구성 Glial 세포 물의 Resuspension 미디어의.
| 구성 요소 | 볼륨을 추가할 수 | 최종 농도 |
| DMEM/F12 | 44 mL | _ |
| 소 태아 혈 청 (FBS) | 5 mL | 10% |
| 페니실린-스 (100 x) | 500ΜL | 100 IU/mL (펜) |
| 100 µ g/mL (Strep) | ||
| Gentamicin (50 mg/mL 주식) | 20 Μ L | 20 µ g/mL |
| GDNF (10 µ g/mL 주식) | 50 Μ L | 10 ng/mL |
| L-글루타민 (200 m m 재고) | 500ΜL | 2 mM |
표 2: Glial 세포 성장 매체의 구성.
| 구성 요소 | 면역 형광 검사 희석 | 교류 Cytometry 희석 |
| 치킨 안티 GFAP | 1 ~ 500 | 1 2000 |
| 토끼 반-S100 | 1 ~ 500 | 1 ~ 500 |
| 마우스 안티 p75 NTR | 1 ~ 500 | 1 ~ 500 |
| 염소 안티-E-cadherin | 1 ~ 400 | |
| 마우스 안티-Pgp9.5 | 1 ~ 500 | |
| 염소 안티--부드러운 근육 걸 | 1 ~ 500 | |
| 알 렉 사 Fluor 488 염소 안티 닭 IgY | 1 ~ 1000 | 1 ~ 1000 |
| 알 렉 사 Fluor 568 염소 반대로 마우스 IgG | 1 ~ 1000 | 1 ~ 1000 |
| 알 렉 사 Fluor 594 당나귀-토끼 IgG | 1 ~ 1000 | |
| 알 렉 사 Fluor 488 당나귀 안티 염소 IgG | 1 ~ 1000 |
항 체의 표 3: 목록
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Discussion
EGCs 직감 항상성에 중요 한 역할 그리고 분리 하 고 그들 에 체 외연구 필수적 이다. 이 프로토콜에서 성인 마우스 내장의 lamina propria에서 EGCs를 격리 하기 위한 간단한 방법 장 폐해 기능을 공부 도입 되었다.
면봉으로 부착 mesentery와 LMMP를 제거 경도 원형 근육 사이 있는 간 myenteric 명과의 일부를 제거, 버퍼 submucosal 표면에의 접근성 증가 하 고 많은 큰 모세 혈관을 제거 하는 것은 . 후자는 최종 문화를 오염 혈액 세포의 수를 줄입니다. EDTA 외피의 시리즈 스트립 거리 노출 lamina propria 및 submucosal 명과 수 있는 연약한 chelating 솔루션에 노출 후 상피 점 막. 동요 동요, vortexing 또는 분쇄 (pipetting 위아래로 반복) 하 여 신중 하 게 수행 하 고 셀에 과도 한 손상을 피하기 위해 초과 해야 합니다. 부착, 가능한 glial 세포의 더 일관 된 수익률 귀착되는 기술 때문에 분쇄는 여기 사용 되었다. 흔들어 거품을 소개 하 고 코팅된 판에 세포 부착에 의해 형태학 상으로 평가 하는 세포 생존 능력을 줄일 수 있었습니다. 조직을 조각으로 잘라 해야 합니다 < 5 mL 피 펫과 조직을 효과적으로 triturate을 0.5 c m.
일반적으로, 적어도 3 쥐에서 7 cm 세그먼트는 약 20-30%에서 한 6 잘 플레이트를 충당 하기 위해 충분 한 EGCs를 생성 하기 위해 충분 한 confluency, immunocytochemistry 및 정량에 사용할 수 있습니다. 그러나, 더 많은 세포는 공부 하는 유전자의 표현 수준에 따라 서양 오 점 같은 생 화 확 적인 방법에 필요한 수 있습니다. 있지만, 궁극적으로 다른 세포 유형으로 EGC 문화의 오염 증가 상피 세포 인구의 큰 준수 관찰 되었다 1 콜라겐 입력 또는 Matrigel 짧게 폴 리-D-리/Laminin 기판에 안으로 시험 되었다, . 또한, 1 형 콜라겐 접시에 확고 하 게 고착 하지 않았다 고 쉽게 미디어를 변경할 때 표면에서 제거 했다. Fibronectin은 다른 기판 사용된24되었습니다 하지만 여기 테스트 했다. Laminin 분명히 바인딩을 강화 하 고 신경 크레스트의 파생 셀25. 그러나, 많은 laminin의 변화할 수 있다, 영향을 미치는 세포 부착 및 수익률. 문화의 미생물 오염 시간의 약 5% 발생 하 고 살 균 약, 기술 및 항생제의 사용에 의해 최소한으로 유지 했다. 항진균 약의 사용은 선택 사항.
여기 프로토콜의 주요 한계는 기본 EGCs를 손상 하지 않고 상피를 제거 하는 동요의 표준화 이다. 또한, 코팅 판 셀 준수에 달려 있기 때문에 즉시 준비의 평가 만들 수 없습니다. 문제 해결에 초점을 세 가지 영역: 1)의 신선한 PDL laminin 접시; 코트 사용 2) 도우미;의 수를 증가 하 여 EDTA 외피를 시작 하는 해 부에서 시간을 최소화 3) 계량 시간과 선동 조직 상피 그리고는 EGCs를 효과적으로 제거 하는 데 사용 하는 방법. 이러한 단계 중 하나에 시간을 확장 EGC 취약성과 가능성을 그들은 성장 매체에 도금 할 때 복구 하지 것입니다 증가 합니다. 상피 해리를 분쇄 메서드는 여기 사용 되었다, 비록 떨고와 vortexing 또한 시험 되었다 일관성 없는 결과 아마도 때문에 의존 하 고 계량 하기가 더 연산자. 도금 부착 세포의 수확량 더 셀은 16-24 h에 대 한 방해 하지 했다.
여기에 제시 하는 방법 스미스 그 외 여러분 에 의해 원래 연구 수정 되었습니다. 12, 분리는 LMMP에 초점. 스미스 접근만 제거 하 고는 LMMP 절연 glial 세포의 대부분 submucosa 및 lamina propria에서 발생 한 것을 버리고 여기 사용 되었다. 또한, 효소 소화 하지 않고 myenteric EGCs 되지 않습니다 쉽게 해방된12. 그럼에도 불구 하 고, submucosal 명과 대 myenteric에 대 한 특정 마커 없습니다 있기 때문에, 인터-myenteric 총에서 glial 세포의 존재를 제외할 수 없습니다. 로젠바움 외. 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) hGFAP 발기인에서 표현 하는 EGCs의 흐름 cytometric 분석 보고. 그들은 아주 어린 쥐 (출생 후 7 일)을 사용 하 고 효소 소화19EGCs 전체 창 자에서 분리. 또한, 흐름 cytometric 분석 했다 부동성 neurosphere 형성을 추진 하는 조건을 유지의 2 주 후 수행 됩니다. 저자는 neurospheres를 매우 GFAP와 S100b 표현 보고, 부동 셀 집계는 또한 강력 하 게 α-SMA, myofibroblast 세포 인구의 확장 격려 반면 gliosphere 개발 제안 표현 플랫 시트 같은 형태학에 여기에서 설명합니다. 따라서, 재미, 하는 동안 연구 직접이 프로토콜 비교있지 않습니다. 대조적으로, 세포의 형태에서 훨씬 적은 α와 결합 하 여-SMA + 셀이이 프로토콜에서 설명 하는 EGCs 3-5 일간 문화 기간 동안 3 차원 형태를 전시 하지 않는 것이 좋습니다. 그럼에도 불구 하 고, 프로토콜 여기와 로젠바움 메서드 사용 하 여 형광 기자 식별 하 고 격리 GFAP + 셀 셀 프로 파일링 살고 할 수 사관의 능력을 향상 시킬 것입니다.
결론적으로, 현재 프로토콜 submucosa 비 효소 방식을 사용 하 여에서 장의 glial 세포의 격리를 설명 합니다. 전체 프로토콜 사전 코팅된 조직 문화 접시에 약 3 h 초기 도금을 마우스 해 부에서 걸립니다. 가장 시간 집중적인 단계 프로토콜입니다 제거 및 내장의 첫 번째 EDTA 보육에 대 한 준비. 접시를 준비 하 고 DPBS 저장이 좋습니다. 준비의 성공은 기본 EGCs를 손상 하지 않고 상피의 효율적인 제거에 의존 하 고 24 h. 기본 EGCs 이내 PDL/Laminin 코팅 판에 부착은 생 화 확 적인 분석 등 생체 외에서 연구 하는 데 유용 캘리포니아2 + 용 고 adenoviral transfections10. EGCs는 submucosa 또는 LMMP에서 분리 하는 기능 EGC 성장 속성, 차별화 및 형태학 전체 게놈 접근을 사용 하 여 차이 정의 하기 위해 추가 연구가 허용 것으로 예상 된다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 인정 (JLM)에 R37 DK045729, R01 AR060837 (HX)를 미시간 위장 연구 센터 분자 코어 P30 DK034933의 대학에서 지원 하고자 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D lysine (1 mg/mL stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/mL stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5 M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50 mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 |
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