Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Isolamento de células gliais entéricas da Submucosa e Propria do Lamina do rato adulto

doi: 10.3791/57629 Published: August 15, 2018

Summary

Aqui, descrevemos o isolamento de células gliais-entérico da submucosa intestinal-usando sequencial incubação do EDTA para quelato cátions divalentes e, em seguida, incubação em solução de recuperação de célula não enzimáticos. Chapeamento da suspensão de células resultante na poli-D-lisina e laminina resulta em uma cultura altamente enriquecida de células gliais submucosas para análise funcional.

Abstract

O sistema nervoso entérico (ENS) consiste de neurônios e células gliais entéricas (EGCs) que residem dentro da parede músculo liso, a submucosa e a propria do lamina. EGCs desempenham um papel importante na homeostase do intestino através da liberação de vários fatores tróficos e contribuam para a integridade da barreira epitelial. A maioria dos estudos de culturas primárias de gliais entéricas usar células isoladas do Plexo mioentérico após dissociação enzimática. Aqui, um método não-enzimática para isolar e cultura EGCs da lâmina própria e submucosa intestinal é descrito. Após a remoção manual da camada muscular longitudinal, EGCs foram libertados da lâmina própria e submucosa usando sequencial incubação do tampão HEPES EDTA seguida de incubação em solução de recuperação de célula não enzimáticos comercialmente disponível. A incubação do EDTA foram suficientes para tirar a maioria da mucosa epitelial da lâmina própria, permitindo que a solução de recuperação de célula libertar os EGCs submucosas. Qualquer residual propria do lamina e músculo liso foi descartada juntamente com a mioentérico glia. EGCs foram facilmente identificados pela sua capacidade de expressar a proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Apenas cerca de 50% de suspensão de célula continha células GFAP + depois de completar a incubação do tecido e antes do revestimento sobre o substrato de poli-D-lisina/laminina. No entanto, após 3 dias de cultivo as células no fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF)-contendo meios de cultura, a população de células aderindo ao substrato revestido placas composta de > 95% entérica glia. Criamos uma linha de rato híbrido criando um mouse hGFAP-Cre para a linha de repórter ROSA-tdTomato acompanhe a porcentagem de células GFAP + usando fluorescência da célula endógena. Assim, não-mioentérico entérica glia pode ser isolado por meio de métodos não enzimáticos e cultivada pelo menos 5 dias.

Introduction

Interesse na função de células gliais entéricas (EGCs) aumentou constantemente devido a seus papéis reconhecidos no intestino integridade e homeostase1,2. Além disso, o EGCs variam de acordo com sua localização ao longo do comprimento do trato GI3,4. EGCs liberar vários fatores tróficos, incluindo o fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF), contribuem para estripar motilidade1,5 e responder a subprodutos microbiana6,7. Estudos têm indicado que a população de EGC é heterogênea e que sua função varia dependendo se eles são submucosos ou residam dentro a mioentérico plexo1,7. Por exemplo, EGCs dentro da submucosa contribuam para junções apertadas8. Expressão de GFAP e fosforilação em EGCs diferencial têm sido associados à doença de Parkinson, sugerindo sua possível ligação com o fenótipo de intestino desta desordem9. Recentemente, observou-se que a perda de proteína nuclear oshomens em culturas isoladas de EGCs da submucosa intestinal proximal foi suficiente para induzir a expressão do hormônio gastrina10. Como resultado, foi proposto que o EGCs podem ser a origem dos gastrinomas duodenais, um tipo de tumor neuroendócrino10. Coletivamente, estes exemplos ressaltam a relevância de estudar o comportamento e a função do EGCs isolados em transtornos neuropáticas e câncer11.

O desafio no campo permanece como isolar e estudar um ou ambos os EGC populações em vitro. Experimentos de rastreamento de linhagem demonstrado que EGCs na lâmina própria e submucosa se originam de células progenitoras no Plexo mioentérico7. Embora existam vários protocolos de isolamento publicado disponível para gerar culturas de mioentérico EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, nenhum especificamente destinos isolamento da população de EGC submucosa/lamina propria. Protocolos existentes para isolamento de EGC especificamente usam uma combinação da separação mecânica ou o microdissection do músculo liso combinado com dissociação enzimática, eventualmente, descartando a camada de células da mucosa.

O objetivo deste manuscrito é demonstrar as etapas para isolar não-enzimaticamente EGCs primários da propria do lamina para estudos em vitro . Uma vez que não há marcadores que especificamente distinguem a mioentérico EGCs na submucosa, a separação espacial da mucosa epitelial de musculatura lisa foi explorada para isolar o EGCs submucosas. Além disso, através da combinação de EDTA com dissociação não enzimáticos, EGCs foram isolados da submucosa em contraste com o músculo liso, que foi descartado junto com os EGCs intermioentérico associado. Mais separação da submucosa e propria do lamina EGCs ocorreu por cultivo as células gliais substratos de célula-amigável, por exemplo, poli-D-lisina e laminina.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todas as experiências com animais descritas foram aprovadas pelo Comitê da Universidade de Michigan sobre o uso e cuidado dos animais.

1. preparação de soluções de laminina e estéril poli-D-lisina (PDL)

  1. Pelo menos um dia antes do isolamento de célula, prepare poli-D-lisina (PDL) e laminina revestida de placas.
    Nota: Placas tanto 6-poços e 12 poços foram preparadas dependendo os objetivos experimentais. Normalmente, 12-poços chapas foram utilizadas para a análise quantitativa usando borrões ocidentais; Considerando que, a 6-poços chapas foram usadas para segurar autoclavadas lamelas (estéril) para imuno-histoquímica. placas de 24 poços foram usadas para cultura EGCs para Ca2 + fluxo de imagem.
  2. Dilua as soluções com grau ultrapura de cultura de tecidos, livre de DNase e RNase-livre de água em uma capa de cultura de tecidos com ar filtrado HEPA.
  3. Esterilizar as lamelas de vidro
    1. Segure a lamínula com pinça estéril e mergulhe as lamelas num copo de 100% de etanol de 15 min. permitir o etanol para evaporar o capuz de cultura de tecido e coloque nas placas de 6-poços.
    2. Como alternativa, coloque várias lamelas individualmente em 2 mm espessura toalhete de papel em um recipiente plástico e, depois, autoclave.

2. placas de revestimento

Nota: execute estas etapas sob uma capa de fluxo laminar estéril de cultura de tecidos.

  1. Descongelar o estoque PDL 1 mg/mL e diluir 01:10 com água estéril, de grau de cultura de tecidos, para que a concentração final é 100 µ g/mL. Use 2 mL por alvéolo para revestir chapas de 6-poços, 1 mL para cobrir um poço de uma placa de 12 e 0,5 mL para um poço nas placas de 24 poços. Armazenar o restante PDL diluído em alíquotas de 12 mL a-20 ° C.
  2. Após permitir o PDL revestir os poços pelo menos 1 h, remova o PDL com uma pipeta estéril. As placas ao ar deixe secar completamente, sob uma capa de fluxo laminar de cultura de tecidos.
    Nota: Depois de remover a solução PDL com uma pipeta estéril, pode ser usado duas vezes mais dentro de 1 semana, depois de passar através de um filtro de 0,22 µm e armazenando a 4 ° C.
  3. Descongele o estoque de laminina no gelo para evitar a formação de gel.
    Nota: Não diluída laminina torna-se sólido quando aquecido acima de 8 ° C.
  4. Dilua a laminina estoque (0,5 mg/mL) 01:50 com de estéril Dulbecco fosfato Buffered Saline (DPBS) para obter uma concentração final de 10 µ g/mL. Loja da laminina diluída em alíquotas de 12 mL a-20 ° C.
  5. Adicione laminina diluída nos poços contendo secas PDL. Use 1 mL para cobrir a superfície 6-poços e 0,5 mL para cobrir a parte inferior das placas 12-poços. Para lamelas, adicione 400 µ l de laminina diluída para as lamelas para atingir a cobertura de superfície.
  6. Incube as placas revestidas a 37 ° C por 2 h, se a placa for usada no mesmo dia (revestimento rápido). Se não, selar as placas com o envoltório plástico e armazenar, durante a noite, a 4 ° C (revestimento lento).
    Nota: A vedação é fundamental para evitar a secagem e contaminação.
  7. Remova a solução de laminina cuidadosamente com uma pipeta para evitar riscar a superfície. Delicadamente lave os poços três vezes com DPBS estéril.
  8. Adicione mídia crescimento glial completa a cada bem e manter as placas a 37 ° C até que esteja pronto para adicionar a suspensão EGC.
    Nota: D poli lisina e laminina revestido placas podem ser armazenadas por 3 dias a 4 ° C. Revestir as placas de vários dias à frente e em seguida armazenar a 4 ° C, lavar os pratos com estéril DPBS três vezes. Adicione 2 mL de DPBS estéril para cada poço após a lavagem final. Selar a placa com parafilm e em 4 ° C. É essencial para garantir que a laminina não secar.

3. preparação de soluções de isolamento

  1. Prepare a solução de EDTA/HEPES/DPBS dissociação. Para 500 mL da solução, use DPBS estéril (sem cálcio e magnésio) para fazer uma solução final de 10 mM HEPES e 5 mM EDTA. A 490 mL do DPBS, adicione 5 mL de tampão HEPES de 1m e 5 mL de solução estoque de EDTA 0,5 M. Armazenar a 4 ° C até o uso.
  2. Prepare a mídia de ressuspensão de célula glial usando os reagentes listados na tabela 1.
  3. Prepare a mídia de crescimento glial usando os reagentes listados na tabela 2.
    Nota: A mídia de crescimento Glial contendo GDNF pode ser armazenada durante uma semana a 4 ° C.

4. remoção do segmento Intestinal

Nota: Os ratos foram autorizados acesso livre à comida e água antes da eutanásia pelo método de gota de isoflurano e remoção de um órgão vital. Foram utilizados camundongos C57Bl/6 maiores que 8 semanas de idade. Ambos os sexos foram usados sem diferenças perceptíveis na preparação.

  1. Eutanásia o mouse com uma overdose de isoflurano e colocar em decúbito dorsal em uma bandeja de dissecação. Fixar as extremidades e esterilizar o abdômen com etanol a 70%. A pele da barraca com fórceps e em seguida, abrir o abdômen com uma tesoura.
  2. Levantar o fígado e identificar o estômago/piloro distal. Em seguida retire a 7 cm do intestino proximal. Tenha cuidado para não rasgar o intestino.
  3. Mantenha o piloro com fórceps, enquanto cortando fora o mesentério.
    1. Use dissecção romba com as costas da tesoura para raspar fora pâncreas aderentes.
    2. Coloque o segmento intestinal DPBS gelada sem Ca2 + ou Mg2 + (figura 1A).
      Nota: Outros segmentos do intestino ou cólon também podem ser removidos usando a mesma técnica.
  4. Uso uma seringa de 5 ou 10 mL anexado a uma agulha de 20 G de fim brusco para expulsar o conteúdo fecal com gelo frio DPBS (figura 1B).
  5. Divida o intestino em segmentos de 3 cm para remover o músculo longitudinal, usando a técnica descrita inicialmente por Smith et al. 12 e como modificado em juliana et al 10.
    Nota: Segmentos intestinais de ratos até dois são usados por 30 mL da solução de isolamento de HEPES/EDTA/DPBS.
  6. Quebre a cerca de 4 cm para separar a vara de madeira com a ponta de algodão. Mergulhe o bastão de madeira em DPBS (Figura 1).
  7. Deslize um dos segmentos intestinais suavemente para a vara de imersão (Fig. 2A-C).
  8. Remova o mesentério aderente ainda ligado usando fórceps de agulha-nariz (Figura 2D).
  9. Use uma lâmina de barbear limpa ou bisturi para fazer dois cortes longitudinais ao longo do intestino onde o mesentério foi anexado (Figura 2E).
    1. Molhe a ponta de algodão com DPBS. Esfregue a ponta de algodão umedecida longitudinalmente ao longo do músculo para soltar o músculo longitudinal/mioentérico plexo (LMMP). Em seguida, mova a ponta de algodão horizontalmente para arreliar fora o LMMP do músculo circular ao longo do comprimento do segmento intestinal durante a remoção de LMMP.
    2. Mantenha a ponta da vara entre o polegar e o indicador enquanto estabilizar o segmento com o dedo médio e o quarto (Figura 2F). Quando estiver completa, o LMMP facilmente vai descascar fora o segmento intestinal.
  10. Descarte o LMMP despojado do tubo intestinal e anexado para o cotonete, a menos que a colheita EGCs do Plexo mioentérico é desejado.
  11. Use uma lâmina de barbear para esfolar abrir o segmento intestinal longitudinalmente para remover a vara de madeira.
  12. Armazene o tecido intestinal despojado (predominantemente mucosa e submucosa mais músculo circular) em DPBS no gelo. Repita as etapas 4.4 – 4.11 até que todos os segmentos intestinais são preparados.

5. remoção da Mucosa epitelial

  1. Corte os intestinos em pedaços menores de ~0.5 cm com uma tesoura bem.
  2. Coloque o tecido em um tubo de centrifuga conico estéril 50 mL contendo 30 mL de solução de EDTA/HEPES/DPBS gelada.
  3. Rocha, a solução contendo tecido a 4 ° C por 10 min a 60 ~ inclina-se por min.
  4. Pre-umedeça uma pipeta plástico 5ml pipetando o buffer de EDTA/HEPES/DPBS e descer uma vez e então usar a pipeta pré-umedecidos para pipetar o tecido e amortecedor suspensão acima e para baixo (trituração) 20 vezes para desalojar a mucosa epitelial.
  5. Colete o tecido de incubação o EDTA derramando a mistura através de um filtro de célula de nylon µm 100. Descarte o turva cheias de muco por escoamento (Figura 3).
  6. Coloque o tecido retido no filtro em um novo tubo de centrifuga conico de 50 mL contendo 30 mL de gelo frio EDTA/HEPES/DPBS usando pinça agulha-nariz.
  7. Repita a incubação de EDTA/HEPES/DPBS uma segunda vez pelo balanço do tecido a 4 ° C por 10 min a 60 ~ inclina-se por min para tirar a mucosa epitelial adicional.
  8. Previamente, umedeça uma pipeta de 5 mL com o buffer e depois Pipetar a suspensão de tecido e descer 20 vezes para desalojar as células mucosas.
    Nota: O tecido tendem a ficar para dentro da pipeta, pois mais do epitélio é removido.
  9. Recolher o tecido após a segunda incubação derramando a mistura através de um filtro de célula de nylon de 100 µm e descartar o fluxo através de. A segunda passagem deve ser visivelmente menos turva do que o primeiro (Figura 3).
  10. Repita a incubação do EDTA 10 min até que a solução é quase claro (cerca de 3 a 4 incubação do dependendo da quantidade de tecido e a eficácia da trituração) (Figura 3).

6. coleção de células gliais entéricas da lâmina própria e Submucosa

  1. Transferir o tecido do filtro de nylon para um tubo de centrifuga conico de 15 mL contendo 5 mL da solução de recuperação de célula comercialmente disponível e rocha para 25 – 30 min a 4 ° C.
  2. Triture suavemente 10x para dissociar as células gliais entéricas da propria do lamina.
    1. Filtrar com um filtro de 40 µm e recolher o filtrado em um tubo de 50ml limpo.
    2. Lave o tecido sobre o filtro de nylon com 1 mL de DPBS.
    3. Descartar o tecido e transferir o ~ 5 – 6 mL do filtrado para um tubo de centrifuga conico limpo 15 mL.
    4. Girar o filtrado a 2.000 x g em uma centrífuga de balde balançando por 5 min a 4 ° C.
  3. Ressuspender o sedimento contendo células glia pelo menos 1 mL de tampão de ressuspensão pipetando suavemente a pelota acima e para baixo com uma ponta de pipeta 500 µ l. Evite a introdução de bolhas.
    Nota: Ajuste o volume de ressuspensão conforme necessário para o número de poços e placas. Por exemplo, 1,2 mL para uma placa de 6; 2,4 mL para duas placas de alvéolos 6; 2,4 mL para uma placa de 12.
  4. Pipete 200 µ l de suspensão de célula para cada poço da 6-poços ou 100 µ l para placas de PDL-laminina revestido um 12-bem que contém a mídia de crescimento glial.
  5. Não perturbe os pratos depois de adicionar as células para as placas e colocar na incubadora 37 ° C para permitir que o número máximo de células para aderir.
    Nota: Uma preparação saudável das células anexar dentro de 6-8 h... mas esperar pelo menos 24 h antes de alterar a mídia pipetando delicadamente fora da mídia juntamente com células não-aderentes.
  6. Use as células para experimentos de 3 – 4 dias depois que eles são colocados em cultura (Figura 4). Realizar análise de imunofluorescência usando anticorpos de interesse para marcadores de proteína específica (tabela 3). Por exemplo, GFAP, S100b e p75NTR ou Sox10 foi usado aqui. E-caderina ou anticorpos de actina alfa músculo liso foram utilizados para avaliar o grau de contaminação por outros tipos de células.

7. imunofluorescência coloração

  1. Aspirar a mídia fora das culturas e lavar duas vezes com PBS.
  2. Corrigi as culturas por 20 min em temperatura ambiente com paraformaldeído 4%.
  3. Retire o fixador e depois lavar 3 vezes com PBS.
  4. Permeabilize as células com PBS contendo 0,2% Triton X-100 à temperatura ambiente.
  5. Incube as celulas permeabilized com bloqueio soluções compostas anti-chicken IgY, anticoelho ou anti-mouse IgG para 2 h à temperatura ambiente.
  6. Incube as células com anticorpos primários durante a noite, por exemplo, GFAP (1:1, 000).
    1. Enxague as células 3 vezes com PBS. Se executar o colocalization proceder à etapa 7,7.
  7. Incubar o próximo conjunto de anticorpos primários pelo menos 2 h à temperatura ambiente, mas de preferência durante a noite a 4 ° C. Use uma diluição de 1: 1000 de coelho anti-S100 ou uma diluição de 1: 500 de rato anti-p75NTR.
    Nota: Todos os anticorpos são diluídos em PBS.
  8. Enxague as células 3 vezes com PBS para retirar os anticorpos primários. Então Incube as células enxaguadas com os apropriado fluorescente etiquetado anticorpos secundários para 2 h à temperatura ambiente (tabela 3).
  9. Lavar 3 vezes com PBS para remover os anticorpos secundários.
  10. Montar as lamelas em slides usando 1 – 2 gotas da mídia montagem com DAPI e exibir as células sob um microscópio fluorescente.

8. fluxo Cytometry

  1. Remover células gliais aderentes por citometria de fluxo, enxaguando as células uma vez com DPBS e adicione 0,25% do trypsin-EDTA por protocolo do fabricante. Incube as celulas na solução do trypsin-EDTA a 37 ° C por 3 min. Terminate a digestão através da recolha de células em meio de crescimento de célula glial completa.
  2. Coletar as células por centrifugação a 400 x g por 5 min e então re-suspender as células em PBS.
  3. Consertar as células com paraformaldeído 4% por 10 min e depois permeabilize com 0,2% Triton X-100 em PBS conforme descrito no ponto 7.4 do passo.
  4. Bloquear as células com PBS contendo 1% de BSA e a imunoglobulina específica de tecido por 20 min, por exemplo, burro anti-chicken IgY (IgG) (H + L) (1:1, 000) ou burro anticabra IgG (H + L) (1:1, 000).
  5. Incubar as células com os anticorpos primários GFAP (1:2, 000), E-caderina (1: 400), actina de músculo liso-α (1: 500) ou Pgp9.5 (1: 500), durante a noite a 4 ° C.
  6. Lave o anticorpo com PBS.
    1. Incube o complexo antígeno-anticorpo com anticorpos secundários marcados fluorescentemente incubados à temperatura ambiente por 30 min.
    2. Use uma alíquota separada das células incubadas com anticorpo secundário para servir como o isotipo controle. Ambas as populações de células são lavadas e resuspended em PBS antes da citometria de fluxo.
    3. Analise as duas populações de células em um citômetro de fluxo pelo gating nas células vivas.

9. preparando os tecidos de Mouse da hGFAP-Cre:tdTomato de ratos

Nota: O cDNA Lox-STOP-Lox-tdTomato é expressa de ROSA locus22,23 (Jackson Labs, #007914) e gera endógena fluorescência quando criados para um rato que expressam a recombinase Cre (hGFAP-Cre). Análise in situ é realizada através da geração de seções congeladas do tecido.

  1. Reparar o tecido intestinal em paraformaldeído 4% por 1h e depois desidrata-se durante a noite em 1 M de sacarose em PBS.
  2. Incorporar o tecido em adquiridos comercialmente ideal corte tecido (OCT) composto composto de 10% de álcool polivinílico e 4,2% polietileno glicol e em seguida snap freeze em nitrogênio líquido.
  3. Prepare-se 5 µm cryosections e montar usando uma media mídia com DAPI de montagem.
  4. Por citometria de fluxo, EGCs preparar, a partir da hGFAP-Cre:tdTomato+ ratos, conforme descrito nas etapas 4.1 – 6,5.
  5. Trypsinize as células da placa depois de 3 dias em culturas como no passo 8.1 e em seguida fixar por 10 min em paraformaldeído 4%.
  6. Analisar as células isoladas de ratos Cre negativo em paralelo com células isoladas do hGFAP-Cre:tdTomato+ de ratos em um citômetro de fluxo.
    Nota: Os portões foram construídos para evitar resíduos e células mortas.

10. Ca2 + fluxo de imagem

  1. Incubar o EGCs banhados em uma placa de 24 com 3 µM Fluo-4-AM a 37 ° C por 30 min.
  2. Imagem do sinal de Ca2 + em solução de Tyrode comercialmente adquirido usando um microscópio confocal de disco girando e um comprimento de onda de excitação de 480 nm (F480) após a adição do peptide CCK ou gastrina. Análise de imagem foi relatado em juliana et al 10 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Preparações foram consideradas mal sucedidas se GFAP + células não aderir e espalhar dentro de 24 h (Figura 4A). Não foi possível determinar o número de células gliais até após 24 h quando as células se adere e mostraram evidências de propagação em agregados planos (Figura 4B). Células na borda dos clusters tendiam a estender os processos longos e expressaram clássicos marcadores gliais, por exemplo, GFAP, S100b e p75NTR (Figura 4, 4D)10,16. No dia 2nd , células gliais firmemente aderiram à superfície, permitindo que a população não-aderente ser lavado afastado com PBS. A maioria das células flutuantes eram epiteliais e propria do lamina células junto com os restos da célula. A presença destes grupos de célula flutuante reduziu o rendimento de células gliais aderentes, ressaltando a importância de realizar a incubação do EDTA até a passagem está quase claro, sinalizando que foram removidas as células epiteliais da lâmina núcleo da propria. Além disso, centrifugação a velocidades inferiores a 1.500 x g após incubação em solução de recuperação da célula não efetivamente coletar todas as células viáveis em uma pelota, levando à redução de rendimentos. Normalmente, 40.000 a 100.000 células morfologicamente consistentes com EGCs firmemente aderiram por dia 3 em cultura.

Análise imuno-histoquímica com anticorpos gliais associadas, indicou que a célula aglomerados aderentes que permaneceram por dia 3 foram 10 Sox, S100b e GFAP positivo10,16 (Figura 5A). No estudo atual, observou-se este mesmo grau de pureza permeabilizing as células e analisando por citometria de fluxo (Figura 5B-F). Imediatamente depois de isolar as células da glia submucosa/Lamina propria, citometria de fluxo revelou que cerca de 51% das células foram GFAP + (Figura 5B), sugerindo a presença de tipos de células GFAP-negativo, por exemplo, epiteliais, hematopoiéticas, células endoteliais, neuronais, miofibroblastos existentes no epitélio e lâmina própria. Depois de 3 dias na cultura, o número de células GFAP + representava mais de 95% da população celular analisada depois de remover a mídia original, gentilmente lavagem com PBS e adicionando mídia fresca (Figura 5). Curiosamente, a análise de fluxo de alta e baixa revelou GFAP proteína-expressando as populações (Figura 5). Com efeito, imunofluorescência análise das células revelou que a periferia dos aglomerados tende a expressar níveis mais elevados de GFAP (Figura 4, 4-D). Tomados em conjunto, os dois tipos de análise podem indicar diferenças em status de maturidade ou diferenciação do EGC. Coletivamente, a percentagem de α-SMA + (marcador de célula Miofibroblasto), E-caderina + (marcador de células epiteliais) e Pgp 9.5 + células (marcador de célula neuronal) foi inferior a 5% (Figura 5-F). Esses resultados foram consistentes com o estudo prévio realizado utilizando imunofluorescência rotulagem do EGCs mostrando cerca de 93% GFAP + pilhas 10. A análise dos fluxos ressalta a importância de permitir que as células a aderir às placas, uma vez que permite a remoção de populações de células contaminantes que compreende aproximadamente 5% das culturas.

Um objetivo neste estudo foi usar um repórter GFAP-ativado para facilitar a citometria de fluxo das células para posterior análise e comparar o grau de enriquecimento EGC usando um marcador fluorescente endógeno (Figura 6). A linha de rato hGFAP-Cre foi originalmente descrita por Messing e colegas de trabalho de 20. Em breve, o Cre recombinase foi colocado sob o controle de 2,2 kb do promotor humano proteína ácida fibrilar glial (hGFAP). Assim, qualquer celular transcrever este promotor hGFAP expressa o repórter fluorescente vermelha tdTomato. População celular rotulada com o repórter tdTomato foi visualizada em situ usando seções congeladas do intestino e do cólon (figura 6A, 6B) antes de executar os procedimentos de isolamento de EGC descritos acima. Depois de executar o isolamento de recuperação celular/EDTA e cultivo das células durante 3 dias, EGCs destes ratos eram facilmente identificadas por sua fluorescência endógena (Figura 6). Embora GFAP + células, indiscutivelmente, são mais numerosos no intestino proximal4,21, tdTomato + EGCs foram também observados no cólon (Figura 6B). Usar o repórter fluorescentes tdTomato+ ativado pelo hGFAP-Cre também revelou uma população bimodal de hGFAP-tdTomato + pilhas (Figura 6) como observado através da análise de imunofluorescência de GFAP proteína (Figura 5). Embora tem sido relatado que nem todas EGCs expressam GFAP proteína4, este ponto pode refletir diferenças no nível de expressão de GFAP. Em média, cerca de 66% das células analisadas exibiu o maior nível de fluorescência tdTomato. Portanto, o protocolo de recuperação do EDTA/célula poderia ser usado para isolar subconjuntos do EGCs, ao longo do intestino delgado e cólon rotulado pelo repórter para examinar as diferenças na expressão do gene.

Este protocolo gerado um número suficiente de relativamente puro GFAP + células gliais para estudos bioquímicos e análise ocidental do borrão 10. para demonstrar a capacidade de resposta célula glial, uma preparação de célula glial 3 dias foi tratada com a colecistocinina hormônios (CCK) ou gastrina para induzir o fluxo de Ca2 + (Figura 7A-7B)10. Os resultados mostraram que estas células aderentes GFAP + responderam aos agonistas extracelulares, demonstrando a sua capacidade para expor a função glia entérica conhecida.

Figure 1
Figura 1: Set up e preparação de intestino de rato. Imagens do (A) de isolamento configurado no gelo incluindo intestinos extraídos. (B) imagens de 5 mL-seringa anexado a uma agulha de ponta romba de 20g para retirar o conteúdo fecal. (C) final projetado de um cotonete de algodão de madeira (~ 4 cm) imersão no buffer de DPBS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: passos usados para limpar os intestinos e remover o músculo longitudinal/mioentérico plexo (LMMP). (A-C) Deslizamento de um segmento intestinal para uma vara de madeira molhada. (D) remoção do mesentério aderente. (E) roubando o intestino com uma lâmina de barbear. (F) removendo o LMMP com um cotonete úmido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: fluxo sequenciais-throughs após incubação do EDTA. São mostrados exemplos do fluxo de passagem de 4 incubação do sequencial usando três segmentos intestinais 7cm incubados durante 10 min com 5 mM de EDTA / 10mM HEPES em DPBS e em seguida o triturado 20 vezes. Fluxo-throughs representante depois de derramar através de um filtro de malha de nylon de 100 µm são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: EGC imagens 24 h após chapeamento. Leve exame microscópico das células ressuspensão 24h depois do chapeamento. (A) mostrado é um exemplo representativo de um pobre preparação mostrando flutuante aglomerados de células epiteliais (seta) e detritos. Não aderente EGCs foram observados após 24 h. (B) mostrado é um exemplo representativo de uma excelente preparação 24 h após o isolamento de célula e ressuspensão em que manchas de EGCs aderiram a PDL/laminina revestido de placas. Imagens foram capturadas em um microscópio fluorescente invertido com uma câmera digital. Escala de barras = 500 µm (A-B). (C) exibição de alta potência de um patch de células EGC manchado com anticorpo GFAP (verde) mostrando células na periferia, com uma intensidade mais elevada de rotulagem. Várias das células mostraram núcleos duplos (azul de ponta de flecha, DAPI,). (D) Colocalization de GFAP (verde) com S100 (vermelho) ou p75NTR (vermelho). Escala de barras = 20 µm (C-D). As células foram montadas com um reagente antidesgaste e DAPI (núcleos azuis). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: fluxo cytometry de células gliais entéricas, isolado da propria do lamina duodenal do rato adulto. (A) imunofluorescência de GFAP, S100B e Sox10 em culturas EGC após 3 dias. As setas indicam a Sox 10 núcleos positivos. Escala de barras = 20 µm (usado com permissão da Sandra et al . 10). células positivas (B) percentagem de GFAP antes chapeamento em placas revestidas (intensidade de fluorescência (ou dispersão para a frente, o eixo x) versus dispersão lateral (eixo y). (C) percentagem de chapeamento de dias depois de células positivas 3 Pgp 9.5 e GFAP positivo (D) α-SMA positiva (E) E-caderina positiva (F). Portões foram construídos para evitar resíduos e células mortas. Mostrada é a porcentagem média da população fluorescente em relação ao número de células (dispersão de lado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Identificação de células gliais entéricas, isolado da propria do lamina duodenal do Cre-hGFAP+: rato adulto tdTomato+ . TdTomato endógena fluorescente (vermelho) imagens foram capturadas em um microscópio fluorescente de contraste de fase com uma câmera digital no intestino (A). (inserir) Igual A, exceto fundiu-se com a imagem DAPI (núcleos azuis). (B) cólon fundiu-se com DAPI. (C) devido células gliais (vermelho) isoladas de hGFAP-Cre:dtTomato+ ratos e cultivadas por 3 dias no substrato PDL/laminina. Barras de escala = 50 µm. (D) fluxo cytometric análise de células tdTomato. É mostrado a % média de GFAP + células ± SEM para 3 diferentes preparações (3 ratos por prep). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Fluxos de vídeo de Ca2 + após tratamento hormonal. EGCs chapeado em 24-bem PDL e laminina revestido placas foram cultivadas na mídia crescimento glial durante 3 dias. As células foram pré-carregadas com 3 µM de Fura-2-AM por 20 min a 37 ° C e em seguida, foram tratados com o (A) 100 nM colecistoquinina (CCK) ou (B) 100 gastrina nM. Clique aqui para baixar este arquivo.

Componentes Volume a ser adicionado. Concentração final
DMEM/F12 44,5 mL _
Soro fetal bovino (FBS) 5 mL 10%
Penicilina-estreptomicina 500 Μ l Caneta de 100 UI/mL
Estreptomicina Strep de 100 µ g/mL
Gentamicina (estoque de 50 mg/mL) 20 Μ l 20 µ g/mL

Tabela 1: Composição da célula Glial ressuspensão de mídia.

Componentes Volume a ser adicionado. Concentração final
DMEM/F12 44 mL _
Soro fetal bovino (FBS) 5 mL 10%
Penicilina-estreptomicina (100 x) 500 Μ l 100 UI/mL (caneta)
100 µ g/mL (Strep)
Gentamicina (estoque de 50 mg/mL) 20 Μ l 20 µ g/mL
GDNF (estoque de 10 µ g/mL) 50 Μ l 10 ng/mL
L-glutamina (estoque de 200 mM) 500 Μ l 2 mM

Tabela 2: Composição dos meios de crescimento de célula Glial.

Componentes Diluição de imunofluorescência Diluição de citometria de fluxo
Frango anti-GFAP 1 a 500 1 a 2000
Coelho anti-S100 1 a 500 1 a 500
Mouse anti-p75 NTR 1 a 500 1 a 500
Cabra anti-E-caderina 1 a 400
Mouse anti-Pgp9.5 1 a 500
Actina de músculo liso-antium bode 1 a 500
Alexa Fluor 488 cabra anti-Chicken IgY 1 a 1000 1 a 1000
Alexa Fluor 568 cabra anti-Mouse IgG 1 a 1000 1 a 1000
Alexa Fluor 594 burro anti-coelho IgG 1 a 1000
Alexa Fluor 488 burro de anti-cabra IgG 1 a 1000

Tabela 3: Lista de anticorpos

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

EGCs desempenham um papel importante na homeostase do intestino, e é essencial para isolar e estudá-los em vitro. Neste protocolo, um método simples para isolar o EGCs partir a lâmina própria do intestino rato adulto foi introduzido para estudar a função glia entérica.

Removendo o mesentério aderente e LMMP com um cotonete de algodão remove alguns da mioentérico inter glia que residem entre o músculo longitudinal e circular, aumenta a acessibilidade de buffers para a superfície submucosa e remove grande parte dos capilares maiores . Este último reduz o número de glóbulos vermelhos, contaminando as culturas finais. A série de incubação do EDTA tira a mucosa epitelial expondo a lâmina própria e submucosa glia, que pode ser frágil após exposição às soluções de quelante. Agitação por agitação, num Vortex ou moer (repetitivas e descer de pipetagem) deve ser realizada com cuidado e cronometrada para evitar danos excessivos para as células. Trituração foi usada aqui porque a técnica resultou em um rendimento mais consistente de células gliais aderentes, viáveis. Tremendo tendia a apresentar bolhas e reduzir a viabilidade celular avaliada morfologicamente pela aderência de célula para as placas revestidas. O tecido deve ser cortado em pedaços < 0,5 cm para efetivamente triture o tecido com a pipeta de 5 mL.

Geralmente, os segmentos de 7 cm pelo menos 3 ratos é suficiente para gerar suficiente EGCs para cobrir uma placa de 6 a cerca de 20 a 30% confluência, que pode ser usada por imunocitoquímica e qPCR. No entanto, mais células podem ser necessárias para métodos bioquímicos como borrões ocidentais, dependendo do nível de expressão do gene estudado. Embora, 1 colágeno tipo ou Matrigel examinou-se brevemente como uma alternativa ao substrato de poli-D-lisina/laminina, maior aderência da população de células epiteliais observou-se, em última análise, aumentar a contaminação das culturas EGC com outros tipos de células . Além disso, o colágeno tipo 1 não se adere firmemente às placas e facilmente foi desalojado da superfície quando mudar os meios de comunicação. Fibronectina é outro substrato que tem sido usado24, mas não foi testado aqui. Laminina aparentemente melhora a ligação e diferenciação da crista neural derivado de células25. No entanto, lotes de laminina podem variar, impactando celular aderência e rendimentos. Contaminação microbiana das culturas ocorreu cerca de 5% do tempo e foi mantida a um mínimo, pelo uso de reagentes estéril, técnica e antibióticos. Uso de antifúngico reagente era opcional.

A principal limitação do protocolo aqui é padronização de agitação para remover o epitélio sem danificar os EGCs subjacentes. Além disso, a avaliação da preparação não pode ser feita imediatamente, uma vez que depende de aderência de célula para as placas revestidas. Três áreas para focar quando solução de problemas incluem: 1) uso de PDL e laminina fresco para revestir as placas; 2) minimizar o tempo de dissecação para começar a incubação do EDTA, aumentando o número de assistentes; 3) quantificar o tempo e o método usado para agitar o tecido para remover eficazmente o epitélio e, em seguida, os EGCs. Estender-se o tempo em qualquer um destes passos aumenta a fragilidade do EGC e a probabilidade de que não irão se recuperar quando banhado em meios de crescimento. Embora aqui, foi utilizado o método de trituração para dissociar o epitélio, tremendo e num Vortex foram também testados com resultados inconsistentes talvez porque é o operador mais dependente e difícil de quantificar. Uma vez chapeou o rendimento das células aderentes era maior se as células não foram perturbadas por 16 – 24 h.

O método apresentado aqui foi modificado de acordo com o estudo original por Smith et al. 12, que se concentrou em isolar o LMMP. A abordagem de Smith foi usada aqui apenas para remover e descartar o LMMP para que a maioria das células gliais isoladas que se originam da lâmina própria e submucosa. Além disso, sem digestão enzimática, as mioentérico EGCs não são prontamente liberado12. No entanto, uma vez que não há marcadores específicos para a mioentérico contra glia submucosa, a presença de células gliais do Plexo mioentérico-inter não pode ser excluída. Rosenbaum et al relataram a análise de fluxo cytometric do EGCs expressando avançada proteína verde fluorescente (EGFP) o promotor de hGFAP. Eles usaram ratos muito jovens (7º dia pós-parto) e isolaram EGCs no intestino inteiro por digestão enzimática19. Além disso, realizou-se análise de fluxo cytometric, após duas semanas de manutenção de condições que promoveu a formação de neurosphere flutuante. Embora os autores relataram que o neurospheres altamente expressa tanto GFAP e S100b, os agregados de células flutuante também fortemente expressaram α-SMA, sugerindo que a expansão da população celular Miofibroblasto encorajou o desenvolvimento de gliosphere em contraste para a morfologia da folha plana, como descrito aqui. Portanto, ao mesmo tempo interessante, o estudo não é directamente comparável ao presente protocolo. Por outro lado, a morfologia das células juntamente com significativamente menos α-SMA + células sugerem que o EGCs descritos neste protocolo não apresentam a morfologia 3-dimensional durante o período de cultura de 3 a 5 dias. No entanto, o protocolo aqui e o método de Rosenbaum usam um repórter fluorescente para identificar e isolar células GFAP + que irão melhorar a capacidade do investigador para viver a célula de criação de perfil.

Em conclusão, o atual protocolo descreve o isolamento de células gliais entéricos da submucosa usando uma abordagem não-enzimática. O protocolo inteiro leva cerca de 3 h de dissecação do mouse para chapeamento inicial sobre as placas de cultura de tecidos revestidos. O maior passo de tempo intensivo no protocolo é a remoção e preparação do intestino para a primeira incubação de EDTA. Recomenda-se preparar os pratos e armazenar em DPBS. O sucesso da preparação depende a eficiente remoção do epitélio, sem danificar os EGCs subjacentes e aderência ao PDL/laminina revestida placas dentro de 24 h. EGCs primária são úteis para estudos em vitro como análise bioquímica, Fluxos de CA2 + e adenovírus transfections10. Prevê-se que a capacidade de isolar o EGCs partir da submucosa ou o LMMP permitirá mais estudos para definir as diferenças em EGC Propriedades de crescimento, diferenciação e morfologia usando abordagens de genoma inteiro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores desejam reconhecer o apoio da DK045729 R37 (a JLM), R01 AR060837 (para HX) e a Universidade de Michigan Gastrointestinal Research Center Molecular Core DK034933 P30.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D lysine (1 mg/mL stock) Sigma A-003-E Dilute 1:10
Laminin (0.5 mg/mL stock) Sigma L4544 Dilute to 10 µg/mL on ICE
EDTA (0.5 M) Lonza 51201 Dilute 1:100 in DPBS
HEPES (1 M) Corning 36216004 Dilute 1:100 in DPBS
Cell Recovery Solution Corning 354253
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) HyClone SH30028.02
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 11320033
Penicillin-Streptomycin (100x) Life Technologies 15140-122
Gentamicin (50 mg/mL stock) Life Technologies 15750060
GDNF (10 µg stock) Sigma SRP3200
L-Glutamine (200 mM stock) Life Technologies 25030-081
Chicken anti-GFAP Thermo Fisher Scientific PA1-10004
Goat anti-a-Smooth Muscle Actin  Abcam ab112022
Mouse anti-Pgp9.5  Novus Biologicals NB600-1160
Goat anti-E-cadherin  R&D Systems AF748
Rabbit S100  Abcam ab34686
Mouse p75 NTR  Millipore MAB5592
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY Invitrogen A-11039
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG Invitrogen A-11055
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG Invitrogen A-11004
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG Invitrogen R-37119
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI Thermo Fisher Scientific P36931
Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/mL Life Technologies 15290-018
L-Fura-2-AM Invitrogen F-14201
CCK peptide Anaspec, Fremont, CA AS-20741
Gastrin peptide (Gastrin-17) Abbiotec, Bloomington, IN 350188
Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) Fisher Scientific 22363549
Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) Fisher Scientific 22363547
Disposable Serologic Pipet 5 mL Fisher Scientific 13-678-11D
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 25200-056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595, (2), 557-570 (2017).
  2. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9, (11), 625-632 (2012).
  3. Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153, (4), 1068-1081 (2017).
  4. Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. (2015).
  5. McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146, (2), 497-507 (2014).
  6. Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
  7. Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85, (2), 289-295 (2015).
  8. Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20, (32), 11273-11280 (2014).
  9. Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 130, (6), 805-815 (2014).
  10. Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
  11. Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas? Gastroenterology. (2017).
  12. Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  13. Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
  14. Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12, (2), 108-116 (1994).
  15. Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5, (4), 223-232 (1995).
  16. Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56, (4), 489-496 (2007).
  17. Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13, (1), 95-106 (2001).
  18. Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
  19. Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11, (3), e0151335 (2016).
  20. Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31, (2), 85-94 (2001).
  21. Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63, (2), 229-241 (2015).
  22. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22, (12), 1567-1572 (2004).
  23. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, (1), 133-140 (2010).
  24. Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6, (6), 398-403 (2015).
  25. Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313, (4), 625-642 (1991).
Isolamento de células gliais entéricas da Submucosa e Propria do Lamina do rato adulto
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Wang, Z., Ocadiz-Ruiz, R., Sundaresan, S., Ding, L., Hayes, M., Sahoo, N., Xu, H., Merchant, J. L. Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (138), e57629, doi:10.3791/57629 (2018).More

Wang, Z., Ocadiz-Ruiz, R., Sundaresan, S., Ding, L., Hayes, M., Sahoo, N., Xu, H., Merchant, J. L. Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (138), e57629, doi:10.3791/57629 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter