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Biology

Aislamiento de las células gliales entéricas de la Submucosa y la lámina propia del ratón adulto

doi: 10.3791/57629 Published: August 15, 2018

Summary

Aquí, describimos el aislamiento de las células entéricas glial de la intestinal submucosa con incubaciones secuenciales de EDTA para quelar cationes divalentes y luego de incubación en la solución de recuperación no enzimática de la célula. La suspensión de células resultante de poly-D-lisina y laminina de la galjanoplastia resulta en una cultura altamente enriquecida de las células gliales submucosas de análisis funcional.

Abstract

El sistema nervioso entérico (ENS) consiste en neuronas y células gliales entéricas (EGCs) que residen dentro de la pared de músculo liso, submucosa y lámina propia. EGCs desempeñan papeles importantes en la homeostasis intestinal a través de la liberación de factores tróficos y contribuyan a la integridad de la barrera epitelial. Mayoría de los estudios de cultivos primarios de gliales entéricas usa células aisladas desde el plexo mientérico después de disociación enzimática. Aquí, se describe un método no enzimático para aislar y la cultura EGCs intestinal submucosa y lámina propia. Después de la extracción manual de la capa de músculo longitudinal, EGCs fueron liberados de la lámina propia y submucosa con incubaciones de EDTA tamponado con HEPES secuenciales seguidas por incubación en solución de recuperación de la célula no enzimáticos disponibles en el mercado. Las incubaciones de EDTA fueron suficientes para la mayoría de la mucosa epitelial de la lámina propia, que permite la solución de recuperación de la célula liberar el EGCs submucosas de la tira. Cualquier residual propria de la lámina y del músculo liso fue descartado junto con la glía mientérico. EGCs fueron fácilmente identificados por su capacidad para expresar la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP). Sólo alrededor del 50% de la suspensión de células contienen células GFAP + incubaciones de tejido y antes de revestimiento sobre el sustrato de poly-D-lisina/laminina. Sin embargo, después de 3 días de cultivo de las células de factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF)-que contienen medios de cultivo, conformada por la población de células adheridas a las placas recubiertas de sustrato > 95% de glía entérica. Hemos creado una línea de ratón híbrido por un ratón hGFAP-Cre a la línea de reportero ROSA tdTomato para realizar un seguimiento el porcentaje de células GFAP + usando fluorescencia endógena de la célula de la cría. Así, glía entérica mientérico no puede ser aislado por métodos no enzimáticos y cultivado durante al menos 5 días.

Introduction

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Interés en la función de las células gliales entéricas (EGCs) ha aumentado constantemente debido a sus reconocidas funciones en la tripa integridad y homeostasis1,2. Además, EGCs varían según su localización a lo largo de la longitud del tracto GI3,4. EGCs liberar varios factores tróficos como el factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), contribuyen a intestino motilidad1,5 y responder a los subproductos microbianos6,7. Los estudios han indicado que la población de EGC es heterogénea y que su función varía dependiendo de si son submucosos o residen en el mientérico plexo1,7. Por ejemplo, EGCs dentro de la submucosa contribuyen a ensambladuras apretadas8. Diferencial de expresión de GFAP y fosforilación en EGCs se han relacionado con la enfermedad de Parkinson, lo que sugiere su posible vinculación al fenotipo intestinal de este desorden9. Recientemente, se observó que la pérdida de la proteína nuclear menin en cultivos aislados de EGCs de la submucosa intestinal proximal era suficiente para inducir la expresión de la hormona gastrina10. Como resultado, se propuso que EGCs podrían ser el origen de los gastrinomas duodenales, un tipo de tumor neuroendocrino10. Colectivamente, estos ejemplos ponen de relieve la importancia de estudiar el comportamiento y la función de EGCs aislados en desórdenes neuropáticos y cáncer11.

El desafío en el campo sigue siendo cómo aislar y estudiar uno o ambos EGC poblaciones en vitro. Linaje rastro experimentos demostraron que EGCs en la submucosa y la lámina propia se originan de células progenitoras en el plexo mientérico del7. Aunque existen varios protocolos de aislamiento publicado disponible para generar culturas de mientérico EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, ninguno específicamente objetivos de aislamiento de la población de EGC propria de la lámina submucosa. Los protocolos existentes para el aislamiento de EGC en concreto utilizan una combinación de la separación mecánica o el microdissection del músculo liso combinado con disociación enzimática, desechando finalmente la capa de la célula de la mucosa.

El objetivo de este manuscrito es demostrar los pasos para aislar no enzimático EGCs primarias de la lámina propia para estudios en vitro . Puesto que hay no hay marcadores que distinguen específicamente EGCs mientérico de ésos en la submucosa, la separación espacial de la mucosa epitelial de la musculatura lisa fue explotada para aislar EGCs submucosas. Además, mediante la combinación de quelación de EDTA con disociación no enzimática, EGCs fueron aislados de la submucosa en contraste con el músculo liso, que fue descartado junto con las inter-mientérico asociado EGCs. Más separación de la submucosa y lámina propia EGCs producido por cultivo de las células de glial de la célula-ambiente sustratos, por ejemplo, poly-D-lisina y laminina.

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Protocol

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Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité de la Universidad de Michigan sobre el uso y cuidado de animales.

1. preparación de soluciones de laminina y estéril Poly-D-lisina (PDL)

  1. Al menos un día antes del aislamiento de células, preparar poly-D-lisina (PDL) y laminina revestido de placas.
    Nota: Las placas de 6 pozos y pozo de 12 fueron preparadas dependiendo de los objetivos experimentales. Por lo general, las placas 12-bien fueron utilizadas para el análisis cuantitativo utilizando western blot; Considerando que se utilizaron placas de 6 pocillos para autoclave cubreobjetos (estéril) por inmunohistoquímica. se utilizaron placas de 24 pocillos para cultura EGCs de Ca2 + proyección de imagen del flujo.
  2. Diluir las soluciones madre con el grado de cultura Tejido ultrapura, libre de DNasa y Rnasa-libre agua en una campana de cultivo de tejidos con aire filtrado por HEPA.
  3. Cubreobjetos de vidrio de esterilización
    1. Sostenga el cubreobjetos con pinzas estériles y sumerja el cubreobjetos en un vaso de precipitados de 100% de etanol para permitir que el etanol a evaporar en la campana de cultivo de tejidos y luego colocar en las placas de 6 pozos a 15 minutos.
    2. Como alternativa, colocar cubre-objetos varias individualmente en papel secante grueso de 2 mm en un envase de plástico y autoclave.

2. capa de placas

Nota: Realice estos pasos bajo campana de flujo laminar estéril de cultivo de tejidos.

  1. Descongelar el stock PDL 1 mg/mL y diluir 1:10 con agua de calidad de cultivo de tejido estéril, por lo que la concentración final es 100 μg/mL. Usar 2 mL por pozo para cubrir placas de 6 pocillos, 1 mL para cubrir un pozo de una placa de 12 pozos y 0.5 mL para un pozo en placas de 24 pocillos. Tienda el PDL diluido restante en alícuotas de 12 mL a-20 ° C.
  2. Después de permitir que el PDL cubrir los pocillos durante al menos 1 hora, retirar el PDL con una pipeta estéril. Seque las placas al aire completamente debajo de una campana de flujo laminar de cultivo de tejidos.
    Nota: Después de retirar la solución PDL con una pipeta estéril, puede ser utilizado dos veces más dentro de 1 semana después de pasar por un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C.
  3. Descongelar el stock de laminina en el hielo para evitar la formación de gel.
    Nota: Laminina sin diluir se convierte en sólido cuando se calienta por encima de 8 ° C.
  4. Diluir la laminina stock (0.5 mg/mL) 1:50 con estéril de Dulbecco fosfato tampón salino (DPBS) para obtener una concentración final de 10 μg/mL. Tienda la laminina diluido en alícuotas de 12 mL a-20 ° C.
  5. Añadir laminina diluido a los pocillos que contengan seca PDL. Use hasta 1 mL para cubrir la superficie del pozo 6 y 0,5 mL para cubrir el fondo de las placas 12-bien. Para cubreobjetos, añadir 400 μL de laminina diluido a cubreobjetos para lograr una cobertura de superficie.
  6. Incubar las placas cubiertas a 37 ° C por 2 h, si la placa se utiliza el mismo día (revestimiento rápido). Si no es así, sellar las placas con envoltura de plástico y almacenar durante la noche a 4 ° C (capa de lenta).
    Nota: El sellado es crítico para evitar la sequedad y la contaminación.
  7. Retirar la solución de laminina cuidadosamente con una pipeta para evitar rayar la superficie. Lave suavemente los pocillos tres veces con DPBS estéril.
  8. Agregar medios de crecimiento glial completa a cada uno bien y mantengan las placas a 37 ° C hasta que esté listo para añadir la suspensión de la EGC.
    Nota: D poli lisina y laminina cubierto las placas pueden almacenarse durante 3 días a 4 ° C. Cubrir las placas de varios días de antelación y luego almacenar a 4 ° C, lave las placas con DPBS estériles tres veces. Añadir 2 mL de DPBS estéril a cada pocillo después del último lavado. Sellar la placa con parafilm y almacenar a 4 ° C. Es esencial para asegurar que no se deseque la laminina.

3. preparación de soluciones de aislamiento

  1. Preparar la solución de EDTA/HEPES/DPBS disociación. Para 500 mL de la solución, utilice DPBS estéril (sin calcio y magnesio) para hacer una solución final de 10 mM HEPES y 5 mM EDTA. A 490 mL de la DPBS, añadir 5 mL de tampón de HEPES de 1 M y 5 mL de solución EDTA de 0,5 M. Almacenar a 4 ° C hasta su uso.
  2. Preparar los medios de comunicación de resuspensión de células gliales utilizando los reactivos enumerados en la tabla 1.
  3. Preparar los medios de crecimiento glial utilizando los reactivos enumerados en la tabla 2.
    Nota: Los medios de crecimiento Glial con GDNF pueden conservarse una semana a 4 ° C.

4. eliminación del segmento Intestinal

Nota: Ratones se permitieron libre acceso a la comida y el agua antes de euthanization por el método de caída de isoflurano y extirpación de un órgano vital. Se utilizaron ratones C57BL/6 mayores de 8 semanas de edad. Ambos sexos fueron utilizados sin diferencias notables en la preparación.

  1. Eutanasia el ratón con una sobredosis de isoflurano y colocar decúbito supino en una bandeja de disección. Las extremidades del perno y para esterilizar el abdomen con etanol al 70%. Tienda de la piel con pinzas y luego abrir el abdomen con tijeras.
  2. Levantar el hígado e identificar el estómago/píloro distal. Luego quite 7 cm del intestino proximal. Tenga cuidado de no romper el intestino.
  3. Sostenga el píloro con pinzas mientras recortes lejos del mesenterio.
    1. Realice una disección Roma con el dorso de la tijera para raspar lejos páncreas adherente.
    2. Coloque el segmento intestinal en la helada DPBS sin Ca2 + o Mg2 + (figura 1A).
      Nota: Otros segmentos del intestino o de colon pueden también quitar usando la misma técnica.
  4. Uso una jeringa de 5 o 10 mL conectado a una aguja de 20 G de extremo romo para eliminar el contenido fecal con hielo frío DPBS (figura 1B).
  5. El intestino se dividen en segmentos de 3 cm para extraer el músculo longitudinal utilizando la técnica descrita inicialmente por Smith et al. 12 y como modificado de Sundaresan et al. 10.
    Nota: Se utilizan segmentos de intestino de ratones hasta dos por cada 30 mL de la solución de aislamiento de HEPES/EDTA/DPBS.
  6. Desprenderse de unos 4 cm para separar el palo de madera de la punta de algodón. Sumerja el palillo de madera en DPBS (figura 1).
  7. Deslice uno de los segmentos intestinales suavemente sobre el palillo mojado (figura 2A-C).
  8. Quitar adherente mesenterio todavía sujeto con unas pinzas de punta de aguja (Figura 2D).
  9. Utilice una cuchilla limpia o bisturí para realizar dos muescas longitudinales a lo largo del intestino donde estaba el mesenterio conectado (Figura 2E).
    1. Moje la punta de algodón con DPBS. Frotar la punta de algodón mojadas longitudinalmente a lo largo del músculo para aflojar el músculo longitudinal/mientérico plexo (LMMP). Mueva la punta de algodón horizontalmente para fastidiar a LMMP del músculo circular a lo largo de la longitud del segmento intestinal durante la extracción de LMMP.
    2. Sostener la punta del palillo entre el pulgar y el índice mientras se estabiliza el segmento con el dedo medio y el cuarto (figura 2F). Cuando termine, el LMMP se desprenda fácilmente el segmento intestinal.
  10. Se desea descartar la LMMP despojado del tubo intestinal y unido a la torunda de algodón a menos que la cosecha EGCs desde el plexo mientérico.
  11. Utilice una cuchilla para desollar abrir el segmento intestinal longitudinalmente para extraer el palo de madera.
  12. Guarde el tejido intestinal pelado (predominantemente la mucosa y submucosa más músculo circular) en DPBS en hielo. Repita los pasos 4.4 – 4.11 hasta que todos los segmentos intestinales están preparados.

5. eliminación de la Mucosa epitelial

  1. Corte los intestinos en pedazos más pequeños de ~0.5 cm con las tijeras finas.
  2. Coloque el tejido en un tubo de centrífuga cónico estéril 50 mL que contenga 30 mL de solución de EDTA/HEPES/DPBS helada.
  3. La solución que contiene el tejido en 4 ° C por 10 min a ~ 60 se inclina por minuto de la roca.
  4. Humedecer previamente una pipeta de plástico de 5 mL mediante pipeteo el buffer HEPES/EDTA/DPBS arriba y abajo de una vez y luego utilizar la pipeta previamente humedecida para pipetear el tejido y el tampón de suspensión arriba y abajo (trituración) 20 veces para desalojar la mucosa epitelial.
  5. Recoger el tejido de la incubación del EDTA por verter la mezcla por un colador de celular 100 μm nylon. Deseche la turbia llena de mucosa paso (figura 3).
  6. Coloque el tejido retenido en el tamiz en un nuevo tubo de centrífuga cónico de 50 mL que contenga 30 mL de hielo frío EDTA/HEPES/DPBS con unas pinzas de punta de aguja.
  7. Repita la incubación EDTA/HEPES/DPBS segunda vez meciendo el tejido en 4 ° C por 10 min a ~ 60 se inclina por minuto a la tira de mucosa epitelial adicional.
  8. Humedezca previamente una pipeta de 5 mL con el tampón y luego pipetear la suspensión de tejido arriba y abajo 20 veces para desalojar a las células mucosas.
    Nota: El tejido tiende a pegarse a interior de la pipeta se retira más del epitelio.
  9. Recoger el tejido después de la segunda incubación, vertiendo la mezcla por un colador de célula de nylon de 100 μm y desechar el flujo a través. El segundo paso debe ser perceptiblemente menos turbio que el primero (figura 3).
  10. Repita las incubaciones de EDTA de 10 minutos hasta que la solución es casi claro (incubaciones de 3 a 4 dependiendo de la cantidad de tejido y la efectividad de la trituración) (figura 3).

6. recolección de las células gliales entéricas de la lámina propia y Submucosa

  1. Transferir el tejido de la coladera de nylon a un tubo de centrífuga cónico de 15 mL que contiene 5 mL de la solución de recuperación de celulares disponibles en el mercado y roca para 25-30 min a 4 ° C.
  2. Triturate suavemente 10 x para disociar las células gliales entéricas de la lámina propia.
    1. Filtrar con un filtro de 40 μm y recoger el filtrado en un tubo de 50 mL limpio.
    2. Enjuague el tejido en el filtro de nylon con 1 mL de DPBS.
    3. Deseche el tejido y transferencia ~ 5 – 6 mL del filtrado a un tubo de centrífuga cónico de 15 mL limpio.
    4. Girar el filtrado a 2.000 x g en una centrífuga oscilante de cubo por 5 min a 4 ° C.
  3. Resuspenda el precipitado que contiene la célula glial en por lo menos 1 mL de buffer de resuspensión transfiriendo suavemente el diábolo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 500 μl. Evitar la introducción de burbujas.
    Nota: Ajuste el volumen de resuspensión según sea necesario para el número de pocillos y platos. Por ejemplo, 1,2 mL para una placa de 6 pozos; 2,4 mL para dos placas de 6 pocillos; 2,4 mL para una placa de 12 pozos.
  4. Pipetee 200 μL de la suspensión celular en cada pocillo de la 6-pozo o 100 μL para una 12-bien PDL-laminina cubierto las placas conteniendo medios de crecimiento glial.
  5. No molestes a los platos después de añadir las células a las placas y colocar en la incubadora de 37 ° C para permitir al máximo número de células se adhieran.
    Nota: Una preparación saludable de las células adjuntar dentro de 6 – 8 h pero espere al menos 24 h antes de cambiar los medios de comunicación mediante pipeteo suave de los medios de comunicación junto con las células no adherentes.
  6. Utilizar las células para los experimentos de 3 a 4 días después son puestos en cultivo (figura 4). Cabo análisis inmunofluorescente con anticuerpos de interés para marcadores de proteínas específicas (tabla 3). Por ejemplo, GFAP y p75NTR y S100b, Sox10 fue utilizado aquí. E-cadherina o anticuerpos de la actinia alfa del músculo liso se utilizaron para evaluar el grado de contaminación de otros tipos de células.

7. inmunofluorescente de tinción

  1. Aspire los medios de comunicación de las culturas y enjuague dos veces con PBS.
  2. Fijar las culturas por 20 min a temperatura ambiente con paraformaldehído al 4%.
  3. Retirar el fijador y luego enjuagar 3 veces con PBS.
  4. Permeabilizar las células con PBS conteniendo 0,2% Tritón X-100 a temperatura ambiente.
  5. Incube las células permeabilized con soluciones de bloqueo de anti-pollo IgY, el conejo o anti-ratón IgG por 2 h a temperatura ambiente.
  6. Incubar las células con anticuerpos primarios durante la noche, por ejemplo, GFAP (1:1, 000).
    1. Lavar las células 3 veces con PBS. Si realizar colocalization proceda al paso 7.7.
  7. Incubar el siguiente conjunto de anticuerpos primarios durante al menos 2 h a temperatura ambiente, pero preferiblemente durante la noche a 4 ° C. Utilizar una dilución de 1: 1000 de conejo anti-S100 o una dilución de 1: 500 de ratón anti-p75NTR.
    Nota: Todos los anticuerpos se diluyen en PBS.
  8. Lavar las células 3 veces con PBS para eliminar anticuerpos primarios. Luego Incube las células aclaradas con los anticuerpos secundarios etiquetado fluorescente adecuados por 2 h a temperatura ambiente (tabla 3).
  9. Enjuagar 3 veces con PBS para eliminar los anticuerpos secundarios.
  10. Monte el cubreobjetos sobre el portaobjetos con 1 – 2 gotas de los medios de montaje de DAPI y ve las células bajo un microscopio de fluorescencia.

8. flujo Cytometry

  1. Quitar adherentes células glial para citometría de flujo enjuagando las células una vez con DPBS y luego añada 0.25% tripsina-EDTA según el protocolo del fabricante. Incubar las células en la solución de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 3 minutos termina la digestión por la recogida de las células en medios de crecimiento de células glial completo.
  2. Recogen las células por centrifugación a 400 x g durante 5 min y luego vuelva a suspender las células en PBS.
  3. Fijar las células con paraformaldehído al 4% por 10 min y luego permeabilizar con 0,2% Tritón X-100 en PBS como se describe en paso 7.4.
  4. Bloque de las células con PBS con 1% BSA y la inmunoglobulina específica de tejido de 20 min, por ejemplo, de burro de anti-pollo IgY (IgG) (H + L) (1:1, 000) o burro anti-cabra IgG (H+L) (1:1, 000).
  5. Incubar las células con anticuerpos primarios GFAP (1:2, 000), E-cadherin (1: 400), actina de músculo liso de la α (1: 500) o Pgp9.5 (1: 500) durante la noche a 4 ° C.
  6. Lavar el anticuerpo con PBS.
    1. Incubar el complejo antígeno-anticuerpo con etiquetado fluorescente anticuerpos secundarios que se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    2. Utilizar una alícuota separada de las células que se incubaron con el anticuerpo secundario para servir como control de isotipo. Ambas poblaciones de células son lavados y se resuspendió en PBS antes de la citometría de flujo.
    3. Análisis de las dos poblaciones de células en un citómetro de flujo por que bloquean a las células vivas.

9. preparación de tejidos de ratón de la hGFAP-Cre:tdTomato ratones

Nota: El cDNA de Lox-parada-Lox-tdTomato se expresa de la ROSA locus22,23 (Jackson Labs, #007914) y genera la fluorescencia endógena cuando crían a un ratón expresando el recombinase de Cre (hGFAP-Cre). Análisis in situ se realizan mediante la generación de secciones de tejido congelado.

  1. Fijar el tejido intestinal en paraformaldehído al 4% durante 1 h y luego deshidratar durante la noche en 1 M sacarosa en PBS.
  2. Incrustar el tejido en comercialmente comprada corte óptimo del tejido (OCT) compuesto de 10% de alcohol polivinilo y 4,2% polietilenglicol y luego complemento la congelación en nitrógeno líquido.
  3. Preparar 5 μm cryosections y luego Monte utilizando un montaje multimedia con DAPI de preservador de fluorescencia.
  4. Para citometría de flujo, preparar EGCs de la hGFAP-ratones Cre:tdTomato+ como se describe en los pasos 4.1 – 6,5.
  5. Trypsinize las células de la placa después de 3 días en culturas como en el paso 8.1 y luego solucionar durante 10 min en paraformaldehído al 4%.
  6. Analizar las células aisladas de ratones Cre negativo en paralelo con células aisladas de la hGFAP-Cre:tdTomato+ de ratones en un citómetro de flujo.
    Nota: Gates fueron construidos para evitar la suciedad y células muertas.

10. Ca2 + proyección de imagen del flujo

  1. Incubar EGCs plateados en una placa de 24 pozos con el μm 3 Fluo-4-AM a 37 ° C durante 30 minutos.
  2. Imagen de la señal de Ca2 + en la solución de Tyrode comercialmente comprados usando un microscopio confocal de disco giratorio y una longitud de onda de excitación de 480 nm (F480) después de agregar el CCK o gastrina péptido. Análisis de la imagen fue divulgada en Sundaresan et al. 10 .

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Representative Results

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Preparaciones se consideraron fracasados si células GFAP + no adherirse y difundir dentro de las 24 h (Figura 4A). El número de células gliales no podría ser determinado hasta después de 24 h cuando las células se adhirieron y mostraron pruebas de difusión en planos agregados (Figura 4B). Células en el borde de los grupos tendían a ampliar procesos largos y expresaron marcadores gliales clásico, por ejemplo, GFAP, S100b y p75NTR (figura 4, 4D)10,16. El día 2nd , células gliales firmemente adhirieron a la superficie permitiendo que la población no adherente que enjuaga con PBS. La mayoría de las células flotantes eran epitelial y lámina propia células junto con restos celulares. La presencia de estos grupos de células flotantes reduce el rendimiento de las células gliales adherentes subrayando la importancia de realizar las incubaciones de EDTA hasta que el flujo a través es casi clara, señalando que han eliminado las células epiteliales de la lámina propria de la base. Además, centrifugación a velocidades inferiores a 1.500 x g después de la incubación en la solución de recuperación de la célula no efectivamente recoja todas las células viables en una pelotilla conduce a rendimientos reducidos. Por lo general, 40.000 a 100.000 células morfológicamente consistentes con EGCs se adhirieron firmemente por día 3 en la cultura.

El análisis de immunohistochemical con los anticuerpos gliales asociados, indicó que la célula racimos seguía siendo partidario de día 3 GFAP, S100b y Sox 10 positivo10,16 (figura 5A). En el estudio actual, se observó este mismo grado de pureza por permeabilizing las células y el análisis por citometría de flujo (figura 5B-F). Inmediatamente después de aislar las células glial del propria de la lámina submucosa, citometría de flujo reveló que aproximadamente el 51% de las células GFAP + (figura 5B), sugiriendo la presencia de tipos de células GFAP negativas, por ejemplo, epitelial, hematopoyético, células endoteliales, neuronales, miofibroblastos sabido que existen en el epitelio y lámina propia. Después de 3 días en la cultura, el número de células GFAP + representada sobre 95% de la población celular analizada después de quitar los medios de comunicación original, enjuague suavemente con PBS y luego agregar medio fresco (figura 5). Interesante, el análisis de flujo reveló altas y bajas poblaciones de expresar proteínas GFAP (figura 5). De hecho, el análisis inmunofluorescente de las células reveló que la periferia de los grupos tendía a expresar mayores niveles de GFAP (figura 4, 4D). Tomados juntos, los dos tipos de análisis podrían indicar diferencias en el estado de madurez o diferenciación de EGC. En conjunto, el porcentaje de α-SMA + (marcador de miofibroblastos células), E-cadherin + (marcador de células epiteliales) y Pgp 9.5 + células (marcador de células neuronales) fue menos de 5% (figura 5-F). Estos resultados fueron consistentes con el estudio previo realizado con etiquetado inmunofluorescente de EGCs que alrededor del 93% GFAP + células 10. El análisis de flujo subraya la importancia de permitir a las células a adherirse a las placas ya que permite la eliminación de contaminantes de las poblaciones de la célula que comprende aproximadamente el 5% de los cultivos.

Un objetivo de este estudio era utilizar un reportero GFAP-activado para facilitar la citometría de flujo de las células para su posterior análisis y comparar el grado de enriquecimiento EGC usando un marcador fluorescente endógeno (figura 6). La línea de ratón hGFAP-Cre fue descrita originalmente por Messing y compañeros de trabajo 20. En Resumen, el recombinase de Cre fue colocado bajo el control de 2,2 kb del promotor de la proteína ácida fibrilosa glial humana (hGFAP). Por lo tanto, cualquier célula transcribe este promotor hGFAP expresó el reportero fluorescente rojo tdTomato. La población de la célula con el reportero de tdTomato fue visualizado en situ utilizando secciones congeladas de intestino y colon (figura 6A, 6B) antes de realizar los procedimientos de aislamiento de EGC descritos anteriormente. Después de realizar el aislamiento de la recuperación de EDTA/celular y las células de cultivo durante 3 días, EGCs de estos ratones fueron identificados fácilmente por su fluorescencia endógena (figura 6). Aunque las células GFAP + podría decirse que son más numerosos en el intestino proximal4,21, tdTomato + EGCs también fueron observados en el colon (Figura 6B). También usando el reportero fluorescente tdTomato+ activado por la Cre de hGFAP reveló una población bimodal de hGFAP-tdTomato + células (figura 6) como se observó mediante el análisis inmunofluorescente de GFAP proteína (figura 5). Aunque se ha reportado que EGCs no todos expresan GFAP proteína4, este punto podría reflejar diferencias en el nivel de expresión de GFAP. En promedio, aproximadamente el 66% de las células analizadas exhibieron el mayor nivel de fluorescencia tdTomato. Por lo tanto, el protocolo de recuperación celular EDTA podría utilizarse para aislar subconjuntos de EGCs en todo el intestino delgado y colon por el reportero para examinar las diferencias en la expresión génica.

Este protocolo genera un número suficiente de relativamente puro GFAP + células glial para estudios bioquímicos y análisis de western blot 10. para demostrar la capacidad de respuesta de células gliales, una preparación de células gliales 3 días fue tratado con la colecistoquinina (CCK) de las hormonas o la gastrina para inducir el flujo de Ca2 + (Figura 7A-7B)10. Los resultados mostraron que estas células GFAP + adherentes respondían a agonistas extracelulares demostrando su capacidad para exponer la función glial entérica conocida.

Figure 1
Figura 1: Set up y preparación de intestino de ratón. (A) imagen de aislamiento en hielo incluyendo los intestinos extraídos. (B) fotografía de 5 mL-jeringa conectada a una aguja de extremo romo de 20 G para eliminar el contenido fecal. (C) Ingeniería extremo de un hisopo de madera (~ 4 cm) en el búfer DPBS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: pasos utilizan para limpiar los intestinos y eliminar el músculo longitudinal/mientérico plexo (LMMP). (A-C) Desplazamiento de un segmento intestinal sobre un palo de madera mojado. (D) eliminación del mesentery adherente. (E) mellar el intestino con una cuchilla de afeitar. (F) eliminación de LMMP con un hisopo de algodón húmedo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: flujo secuencial-throughs después de incubaciones EDTA. Se muestran ejemplos de flujo-throughs de 4 incubaciones secuenciales con tres segmentos de intestino 7 cm que se incubaron por 10 min con 5 mM de EDTA / 10mM HEPES en DPBS y después triturada 20 veces. Se muestran maquetas de flujo representativos después de verter a través de un colador de malla de nylon de 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: EGC imágenes 24 h después de la galjanoplastia. Examinación fotomicroscópica de células resuspendidas 24 h después de la galjanoplastia. (A) se muestra es un ejemplo representativo de una pobre preparación muestra flotante grupos de célula epitelial (flecha) y los desechos. No adherente EGCs se observaron después de 24 h. (B) se muestra es un ejemplo representativo de una excelente preparación 24 horas después de que el aislamiento de células y resuspensión en que parches de EGCs se adhirieron a la PDL/laminina recubiertos de placas. Imágenes fueron captadas en un microscopio fluorescente invertido con una cámara digital. Barras de escala = 500 μm (A-B). (C) vista de alta potencia de parches de células EGC teñidas con anticuerpo GFAP (verde) que muestran las células en la periferia con una intensidad mayor de etiquetado. Varias de las células mostraron doble núcleos (azul DAPI, punta de flecha). (D) colocalización de GFAP (verde) con S100 (rojo) o p75NTR (rojo). Barras de escala = 20 μm (C-D). Las células fueron montadas con un reactivo de antifade y DAPI (azul núcleos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: flujo cytometry de las células gliales entéricas aislado de la lámina propia duodenal del ratón adulto. (A) de la inmunofluorescencia de la GFAP, S100B y Sox10 en culturas EGC después de 3 días. Las flechas indican Sox 10 núcleos positivos. Barras de escala = 20 μm (usado con permiso de Sundaresan et al. 10). las células positivas (B) porcentaje de GFAP antes chapado en placas cubiertas (intensidad de fluorescencia (o dispersión hacia delante, eje x) versus dispersión lateral (eje y). (C) porcentaje de Pgp 9.5 las células positivas 3 daysafter galjanoplastia y GFAP positivas (D) α-SMA positivo (E) cadherina-positivo (F). Puertas fueron construidas para evitar la suciedad y células muertas. Se muestra es el porcentaje promedio de la población fluorescente en relación con el número de células, (dispersión de lado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Identificación de las células gliales entéricas aislado de la lámina propia duodenal de la Cre hGFAP+: ratón adulto tdTomato+ . Endógeno tdTomato fluorescente (rojo) imágenes fueron capturadas en un microscopio de fluorescencia de contraste de fase con una cámara digital en el intestino (A). (recuadro) Mismo como una excepción se fusionó con imagen DAPI (núcleos azul). Colon (B) se fusionó con DAPI. (C) entérico células gliales (rojo) de hGFAP-ratones Cre:dtTomato+ y cultivado por 3 días en el substrato PDL/laminina. Barras de escala = 50 μm. (D) análisis cytometric del flujo de células tdTomato. Se muestra es la media de GFAP + células ± SEM de 3 diferentes preparaciones (3 ratones por prep). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Flujos de vídeo de Ca2 + después de tratamiento hormonal. EGCs plateado en PDL de 24 pocillos y laminina recubiertos placas fueron cultivadas en los medios de crecimiento glial durante 3 días. Las células fueron previamente cargadas con el μm 3 de Fura-2-AM por 20 min a 37 ° C y luego fueron tratados con (A) 100 nM colecistoquinina (CCK) o (B) 100 gastrina nM. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Componentes Volumen a agregar Concentración final
DMEM/F12 44,5 mL _
Suero bovino fetal (FBS) 5 mL 10%
Penicilina-estreptomicina 500 ΜL Pluma de 100 UI/mL
Estreptomicina 100 μg/mL estreptococos
Gentamicina (valores de 50 mg/mL) 20 ΜL 20 μg/mL

Tabla 1: Composición del medio de resuspensión de células gliales.

Componentes Volumen a agregar Concentración final
DMEM/F12 44 mL _
Suero bovino fetal (FBS) 5 mL 10%
Penicilina-estreptomicina (100 x) 500ΜL 100 UI/mL (pluma)
100 μg/mL (estreptococos)
Gentamicina (valores de 50 mg/mL) 20 ΜL 20 μg/mL
GDNF (valores de 10 μg/mL) 50 ΜL 10 ng/mL
L-glutamina (stock de 200 mM) 500ΜL 2 mM

Tabla 2: Composición del medio de crecimiento de células gliales.

Componentes Dilución de inmunofluorescencia Dilución de citometría de flujo
Chicken anti-GFAP 1 a 500 1 a 2000
Rabbit anti-S100 1 a 500 1 a 500
Mouse anti-p75 NTR 1 a 500 1 a 500
Cabra anti-E-cadherina 1 al 400
Mouse anti-Pgp9.5 1 a 500
Cabra la actinia del músculo liso de anti 1 a 500
Alexa Fluor 488 cabra anti-pollo IgY 1 a 1000 1 a 1000
IgG de cabra anti-ratón Alexa Fluor 568 1 a 1000 1 a 1000
Alexa Fluor 594 burro anti-conejo IgG 1 a 1000
Alexa Fluor 488 burro anti-cabra IgG 1 a 1000

Tabla 3: Lista de anticuerpos

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Discussion

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EGCs desempeñan papeles importantes en la homeostasis intestinal, y es esencial para aislar y estudiar in vitro. En este protocolo, un método simple para aislar la lámina propia del intestino de ratón adulto EGCs fue introducido para estudiar la función glial entérica.

Quitar adherente mesentery y LMMP con un hisopo de algodón elimina algunos de la glia inter-mientérico que reside entre el músculo longitudinal y circular, aumenta la accesibilidad de buffers a la superficie de la submucosa y elimina gran parte de los capilares mayores . Este último reduce el número de glóbulos rojos, contaminando los cultivos finales. La serie de incubaciones de EDTA tira lejos la mucosa epitelial, exponiendo la lámina propia y submucosa glia, que pueden ser frágiles después de la exposición a las soluciones quelantes. Agitación por agitación, Vortex o trituración (repetidos arriba y abajo de pipeteo) debe ser realizado con cuidado y programada para evitar daño excesivo a las células. Trituración se utiliza aquí porque la técnica dio lugar a un rendimiento más consistente de células gliales adherentes, viables. Agitación tiende a introducir burbujas y reducir la viabilidad de las células evaluada morfológicamente por la adherencia de la célula a las placas cubiertas. El tejido debe ser cortado < 0,5 cm a triturate eficazmente el tejido con la pipeta de 5 mL.

En general, es suficiente para generar suficiente EGCs para cubrir una placa de 6 pozos en 20 – 30% segmentos de 7 cm de al menos 3 ratones confluencia, que puede utilizarse para inmunocitoquímica y qPCR. Sin embargo, las células más podrían necesitar para métodos bioquímicos como manchas blancas /negras occidentales según el nivel de expresión del gen estudiado. Aunque, tipo 1 colágeno Matrigel se examinó brevemente como una alternativa para el sustrato de poly-D-lisina/laminina, una mayor adherencia de la población de células epiteliales se observó o, en última instancia, aumentando la contaminación de las culturas EGC con otros tipos de células . Además, el colágeno tipo 1 no se adhieren firmemente a las placas y fue desalojada fácilmente de la superficie al cambiar los medios de comunicación. Fibronectina es otro sustrato que ha sido usado24, pero no fue probado aquí. Laminin aparentemente aumenta el atascamiento y la diferenciación de la cresta neural deriva células25. Sin embargo, puede variar un montón de laminina, que afectan a la célula de adherencia y rendimiento. Contaminación microbiana de los cultivos ocurrió alrededor del 5% del tiempo y se mantuvo al mínimo por el uso de reactivos estériles, técnica y antibióticos. Uso del reactivo antihongos era opcional.

La principal limitación del protocolo aquí es normalización de la agitación para eliminar el epitelio sin dañar el EGCs subyacentes. Por otra parte, evaluación de la preparación no se hace inmediatamente ya que depende de la adhesión celular a las placas cubiertas. Tres áreas para centrarse en resolver problemas incluyen: 1) uso de fresco PDL y laminin para recubrir las placas; 2) minimizar el tiempo de la disección a partir de las incubaciones de EDTA aumentando el número de asistentes; 3) cuantificar el tiempo y el método utilizado para agitar el tejido para quitar con eficacia el epitelio y luego las EGCs. Extendiendo el tiempo en cualquiera de estos pasos aumenta la fragilidad de la EGC y la probabilidad de que no recuperará al plateado en medios de crecimiento. Aunque aquí se utilizó el método de trituración a disociar el epitelio, sacudiendo y Vortex también probaron con resultados inconsistentes quizás porque es más operador dependiente y difícil de cuantificar. Una vez chapado el rendimiento de las células adherentes fue mayor si las células no se alteraron para 16 a 24 h.

El método presentado aquí fue modificado según el estudio original por Smith et al. 12, que se centró en aislar el LMMP. Aquí se utilizó el criterio de Smith sólo para retirar y desechar la LMMP por lo que la mayoría de las células gliales aisladas se origina de la submucosa y lámina propia. Además, sin la digestión enzimática, el mientérico EGCs no son fácilmente liberados12. Sin embargo, puesto que hay no hay marcadores específicos para mientérico versus glia submucoso, no puede excluirse la presencia de las células gliales de plexo mientérico inter. Rosenbaum et al. divulgó el análisis cytometric del flujo de EGCs expresando mayor proteína verde fluorescente (EGFP) de la promotora hGFAP. Utilizaron ratones muy jóvenes (día postnatal 7) y había aislado EGCs del intestino todo por digestión enzimática19. Además, se realizó análisis cytometric del flujo después de dos semanas de mantenimiento de las condiciones que promueven la formación desarrolló flotante. Aunque los autores informaron que las neuroesferas altamente expresan GFAP y S100b, los agregados de células flotantes también fuertemente expresan a α-SMA, lo que sugiere que la expansión de la población de la célula de miofibroblastos animó en contraste gliosphere desarrollo a la morfología plana hoja-como se describe aquí. Por lo tanto, aunque interesante, el estudio no es directamente comparable a este protocolo. Por el contrario, la morfología de las células junto con significativamente menor α-SMA + células sugieren que el EGCs se describe en este Protocolo no exhiben la morfología 3-dimensional durante el período de cultivo de 3 a 5 días. Sin embargo, aquí el protocolo y el método de Rosenbaum usan un reportero fluorescente para identificar y aislar células GFAP + que mejorarán la capacidad del investigador para vivir células de perfiles.

En conclusión, el protocolo actual describe el aislamiento de las células gliales entéricas de la submucosa usando un acercamiento no-enzimático. El protocolo entero lleva aproximadamente 3 h de disección de ratón a la galjanoplastia inicial en las placas de cultivo tisular prelacado. Más tiempo de paso intensivo en el protocolo es la extracción y preparación de los intestinos para la primera incubación EDTA. Se recomiendan preparar las placas y de almacenamiento en DPBS. El éxito de la preparación depende de la eficiente remoción del epitelio sin dañar el EGCs subyacentes y adherencia a las placas PDL/laminina revestido en 24 h. EGCs primaria son útiles para estudios en vitro análisis bioquímico, Flujos de CA2 + y transfecciones adenoviral10. Se prevé que la capacidad de aislar EGCs de la submucosa o la LMMP permitirá estudios adicionales para definir las diferencias en propiedades de crecimiento, la diferenciación y la morfología usando el enfoque de todo el genoma EGC.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer el apoyo de DK045729 R37 (a JLM), R01 AR060837 (de HX) y la Universidad de Michigan Gastrointestinal investigación de centro de Molecular P30 núcleo de DK034933.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D lysine (1 mg/mL stock) Sigma A-003-E Dilute 1:10
Laminin (0.5 mg/mL stock) Sigma L4544 Dilute to 10 µg/mL on ICE
EDTA (0.5 M) Lonza 51201 Dilute 1:100 in DPBS
HEPES (1 M) Corning 36216004 Dilute 1:100 in DPBS
Cell Recovery Solution Corning 354253
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) HyClone SH30028.02
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 11320033
Penicillin-Streptomycin (100x) Life Technologies 15140-122
Gentamicin (50 mg/mL stock) Life Technologies 15750060
GDNF (10 µg stock) Sigma SRP3200
L-Glutamine (200 mM stock) Life Technologies 25030-081
Chicken anti-GFAP Thermo Fisher Scientific PA1-10004
Goat anti-a-Smooth Muscle Actin  Abcam ab112022
Mouse anti-Pgp9.5  Novus Biologicals NB600-1160
Goat anti-E-cadherin  R&D Systems AF748
Rabbit S100  Abcam ab34686
Mouse p75 NTR  Millipore MAB5592
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY Invitrogen A-11039
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG Invitrogen A-11055
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG Invitrogen A-11004
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG Invitrogen R-37119
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI Thermo Fisher Scientific P36931
Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/mL Life Technologies 15290-018
L-Fura-2-AM Invitrogen F-14201
CCK peptide Anaspec, Fremont, CA AS-20741
Gastrin peptide (Gastrin-17) Abbiotec, Bloomington, IN 350188
Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) Fisher Scientific 22363549
Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) Fisher Scientific 22363547
Disposable Serologic Pipet 5 mL Fisher Scientific 13-678-11D
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 25200-056

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References

  1. Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595, (2), 557-570 (2017).
  2. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9, (11), 625-632 (2012).
  3. Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153, (4), 1068-1081 (2017).
  4. Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. (2015).
  5. McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146, (2), 497-507 (2014).
  6. Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
  7. Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85, (2), 289-295 (2015).
  8. Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20, (32), 11273-11280 (2014).
  9. Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 130, (6), 805-815 (2014).
  10. Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
  11. Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas? Gastroenterology. (2017).
  12. Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  13. Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
  14. Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12, (2), 108-116 (1994).
  15. Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5, (4), 223-232 (1995).
  16. Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56, (4), 489-496 (2007).
  17. Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13, (1), 95-106 (2001).
  18. Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
  19. Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11, (3), e0151335 (2016).
  20. Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31, (2), 85-94 (2001).
  21. Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63, (2), 229-241 (2015).
  22. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22, (12), 1567-1572 (2004).
  23. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, (1), 133-140 (2010).
  24. Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6, (6), 398-403 (2015).
  25. Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313, (4), 625-642 (1991).
Aislamiento de las células gliales entéricas de la Submucosa y la lámina propia del ratón adulto
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Wang, Z., Ocadiz-Ruiz, R., Sundaresan, S., Ding, L., Hayes, M., Sahoo, N., Xu, H., Merchant, J. L. Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (138), e57629, doi:10.3791/57629 (2018).More

Wang, Z., Ocadiz-Ruiz, R., Sundaresan, S., Ding, L., Hayes, M., Sahoo, N., Xu, H., Merchant, J. L. Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (138), e57629, doi:10.3791/57629 (2018).

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