Summary
现场微生物富集或原位栽培技术可以促进分离难培养的微生物群, 尤其是低生物量或地球化学极端环境。在这里, 我们描述了一个电化学设置不使用外部的电源, 以丰富微生物菌株, 有能力的细胞外电子运输 (EET)。
Abstract
厌氧呼吸耦合电子运输到不溶性矿物 (称为胞外电子传输 [EET]) 被认为是关键的微生物能源生产和持久性在许多地下环境, 特别是那些缺乏可溶性终端电子受体。虽然 EET 的微生物已成功地从不同的环境中分离出来, 但 EET 的细菌多样性仍然不太清楚, 特别是在难以取样、低能或极端环境下, 如许多地下生态。在这里, 我们描述了一个现场电化学系统, 以丰富的 EET 能力的细菌使用阳极作为呼吸终端电子受体。这个阳极连接到能够催化非生物氧还原的阴极。将此方法与使用恒电位仪中毒电极电位的 electrocultivation 方法进行比较, 双电极系统不需要外部电源。我们提供了一个例子, 我们的现场浓缩利用在一个碱性池塘在雪松, 一个地面 serpentinization 遗址在加利福尼亚州北部。以前试图培养的矿物质还原菌是不成功的, 这可能是由于该网站的低生物量的性质和/或低相对丰度的金属还原微生物。在实现双电极富集之前, 我们测量了溶解氧浓度的垂直剖面。这使我们能够将碳毡阳极和铂电镀碳毡阴极放在深度, 以支持厌氧和有氧过程, 分别。在现场孵化之后, 我们进一步丰富了实验室中的阳极电极, 并证实了与通常在雪松上观察到的表面附着或生物膜群落相比, 有明显的微生物群落。这种浓缩后来导致了从雪松中分离出的第一 electrogenic 微生物。这种现场微生物富集的方法有可能极大地增强从低生物量或难以取样生境的 EET 细菌的分离。
Introduction
一些矿物还原微生物被证明利用固相矿物作为终端电子受体, 通过细胞外电子传输 (EET) 过程, 通过氧化还原酶1将电子传导到细胞的外部。EET 是关键, 不仅对微生物矿物过程, 但也应用能源和环境技术, 如微生物燃料电池2, 电极合成3, 和生物修复4。新的 EET 细菌是高度追求, 并已广泛研究从基本或应用的角度5。然而, 我们对这些细菌的生态或生物地球化学意义的洞察力有限。大多数 EET 的微生物是从水, 沉淀物, 或厌氧的消化器, 利用固体电子受体, 如 MnO2, Fe2O3或准备电极在实验室6,分离出来的,7,8. 然而, 这些方法往往产生类似的联营集团, 可能会错过可能主宰低能量或低生物量系统的更敏感分类群, 从而使这些微生物适应实验室或无菌文化环境的能力降低9.通常对于低生物量环境, 大量的水从一个地点被过滤, 以集中细菌细胞。然而, EET 的细菌往往表现出厌氧代谢, 因此氧气暴露可能进一步抑制或阻止他们的耕种。替代的现场方法, 以集中细胞而不暴露于氧气, 可以促进分离 EET 细菌。在这里, 我们报告的安装细节的现场电化学技术, 以丰富 EET 能力的微生物在很长一段时间内, 而不需要外部电源。
使用我们的 electrocultivation 实验从一个高碱性的春天在加利福尼亚北部, 雪松10, 我们描述这种现场电化学技术。serpentinization 在雪松中的地球化学特征受到地下的影响。弹簧高度还原, 氧气浓度低于在空气水界面下检测的限度, 突出了在这个功能性缺氧环境11通过 EET 微生物能源生产的潜力。然而, 没有证据支持 EET 的微生物从雪松 (在 16S rRNA 或宏基因组分析)。尽管这种环境被认为是电子受体有限的, 但利用不溶性矿物作为终端电子受体的潜力, 包括矿物, 如由 serpentinization 产生的铁霸矿物 (即,磁铁矿), 尚未广泛调查12。因此, 我们部署了我们的电化学系统在营地春天, 在雪松高 pH 值的春天, 以丰富的 EET 微生物 (图1)13。
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Protocol
1. 环境孵化用双电极系统的构建
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阳极材料的制备和碳毡电极的处理 (图 2)。
- 根据期望的生物量富集, 将碳毡切割成相等的尺寸。将每个电极浸泡在90% 乙醇中30分钟, 然后用去离子水冲洗至少8次, 每次冲洗后 sonicating 1 分钟。
- 在1米 HCl 中清洗两次电极, 每洗一次至少搅拌12小时。
- 在温暖的 (37 °c) 的烤箱中干燥电极 6–12 h 或直到没有液体。
- 在聚四氟乙烯板 (不粘表面) 上, 用石墨环氧树脂将电极连接到钛丝上。
注: 我们使用钛线, 因为它的高耐受性好氧腐蚀。 - 烘烤电极在120°c 为6小时。
- 用欧姆计测试钛线和碳毡之间的电阻, 并确认导线和毡电极之间的电阻小于5欧姆。
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铂对阴极材料制备碳毡电极的电镀
- 浸没碳毡电极, 在步骤1.1 中制备, 在2米的 KOH, 在一个玻璃容器中至少12小时。
- 电化学清洗时, 将电极作为工作电极 (我们) 放置在三电极反应器中, 同时还可容纳参考 (RE) 和反电极 (CE)。用鳄鱼夹子把我们、恒电位仪和 CE 连接起来。确认所有与欧姆计的连接。
注: 我们使用了银/AgCl (氯化钾饱和) 电极和铂丝作为 RE 和 CE, 分别。 - 使电极在 1.0 V 与含2米的电解质溶液中600s 的银/AgCl (使用足够的量淹没整个电极)。从电化学反应器中取出电极 (由玻璃制成)。将电极在去离子水中冲洗至少8次, 每次冲洗后 sonicating 1 分钟。干电极在100°c 至少12小时。
- 要准备电镀溶液, 加入100克柠檬酸, 5 克硫酸钠, 2 克的 hexachloroplatinate (IV) 六水合物到1升的2米硫酸。
- 在步骤 1.2. 1–1.2 2 中制备的重量清洗和干电极, 然后覆盖在电镀溶液中的电极, 如步骤1.2.3 中所准备。油脂实验在电镀溶液中的电极每三十年代三次。
- 电镀电极通过中毒电极电位在-0.2 V 对 Ag/AgCl 为460s 在镀液。在去离子水中漂洗两次电极, 并丢弃铂废料。
- 在去离子水中冲洗电极至少3次, 每次冲洗后 sonicating 二十年代。无需超声波冲洗至少三次。
- 干电极在100°c 至少12小时的重量电极, 以量化电镀铂的碳毡电极。
2. 双电极系统的施工与安装
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对自然环境中每个电极的安装部位进行了调查。
- 使用溶解氧探针测定氧浓度。
- 检查现场的深度配置文件。
注: 所需的阳极环境条件是一致的水合和缺氧。如果需要, 消除氧光合作用的影响, 屏蔽阳极从光。阴极放置的理想条件是持续的水合, 并接近地表水的好氧。如有必要, 附加浮子以保持阴极表面接触。
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燃料电池型2电极孵化系统的构建
- 通过扭曲两条线, 将所需长度的绝缘导线与电极 (一个阳极和一个铂电镀阴极) 的引线连接起来。覆盖与防水蜡的连接和进一步保护使用船舶级热收缩管。
- 用已知电阻的电阻器将两根导线与阴极和阳极连接。
注: 对于生物系统, 较低的电阻 (10 到1000Ω) 导致更一致的生物活动。如果需要, 高电阻电阻将防止生物活动, 作为一个负控制。为了防止电阻和引线之间的任何连接受到腐蚀, 我们用热收缩管保护它们。
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随着时间的推移, 电压和温度测井的测量。
- 检查电阻两端之间的电压, 以从燃料电池反应中估算出当前的产量。
- 使用数据记录电压表测量与阳极和阴极相关的连接 (请参阅制造商协议), 以此衡量电压差。
注意: 同时进行温度数据记录是可选的, 但是这些信息可以帮助将当前的变化与非生物相关, 而不是生物学上的波动。
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数据记录器和电气连接的保护
- 使用固定和/或塑料袋, 以保护记录器和所有的电气连接从雨中。
- 拧紧塑料袋和电缆, 以防止强风。如图 1所示。
3. 从自然环境中采集电极样品
- 为防止阳极试样因氧污染而损坏, 在厌氧条件下采集电极。
- 在收集电极样品前至少30分钟, 将试管放在厌氧位置。例如, 将试管和盖子分别放在池塘底部, 使瓶子内无氧。
- 用线切割机从电极上切割钛铅, 将电极样品轻轻地收集到试管中, 并将其密封在厌氧水区。为了保持样品新鲜, 样品收集后立即将样品保存在4摄氏度。
注: 或者, 电极可以直接转移到缺氧 (N2清除) 介质。我们用的是雪松培养基 (铃木等。11) 这是从现场测量的水地球化学设计的, 经修订, 为微生物生长提供足够的养分。这一媒体被修改为不同的实验室实验。
4. 对目前生产和 DNA 分析的实验室确认
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电极上附着的微生物联营集团目前生产能力的电化学确认。
- 构造一个电化学反应器14,15与取样电极, 铂导线, 和 Ag/AgCl (氯化钾饱和) 电极作为我们, CE, 和重新, 分别在一个厌氧室。用含有可溶性碳水化合物电子捐献者的雪松培养基填充电化学反应器。
- 平衡电极电位在 +0.2 V 与 Ag/AgCl 和测量当前生产。
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用微生物 dna 试剂盒从电极样品中提取 dna (见材料表)。
- 用70% 乙醇清洗厌氧手套箱内, 在铝箔上放一盘消毒皿。
注: 厌氧室保持氧气浓度低于 1 ppm, 维持一个氢气氛在周围〜 2–3%, 以清除氧气存在钯催化剂。 - 在手套盒中打开电化学反应器, 将样品电极放在盘子上, 然后切到一个尺寸, 以适合在 DNA 套件中使用的管子。继续执行制造商的协议。
- 用70% 乙醇清洗厌氧手套箱内, 在铝箔上放一盘消毒皿。
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Representative Results
使用电压数据记录器成功地测量了当前生产的大约3月, 如图 3所示。这次被选择了, 因为它是春天的最长的稳定的潜伏期, 由于强的秋天降雨影响春天。较短的时期可能是充足的, 虽然一个更长的时期可能提供更强的生物量的丰富。在电化学孵化后, 我们确认了双电极系统的连接, 没有发现系统存在腐蚀的迹象。在低电阻 (1000 Ω) 的双电极系统中, 相对于负控制和 100 kΩ电阻, 观察到了较高电流的产生。在第一个月的逐步生产增长可能表明, 在稳定的电流生产后, 在另一个两个月的电极表面微生物的增长, 积累或住宿。有趣的是, 目前的生产振荡在一个大约24小时的周期, 通过整个周期的电化学浓缩。
为了确认目前微生物联营集团在电极上的生产能力, 我们用3电极电化学反应器在实验室采集的阳极上进行 chronoamperometry。我们在各种碳水化合物电子捐助者的存在下, 将电极电位在 +0.4 V 和标准氢电极 (她) 上。在实验室中孵化时, 阳极上的日振荡不再被观察到。这表明环境因素影响了微生物的当前生产, 并可能导致观察到的振荡。
比较了在富集电极上观察到的微生物群落与附着和浮游非电极群落, 我们观察到过拱结构的明显差异 (图 4)。电极微生物群落在落后血统的操作分类学单元 (OTUs) 中高度丰富, 以及芽孢杆菌的Firmicute血统。还观察到了Proteobacteria的组成变化;具体地说, Betaproteobacteria (主要Serpentinamonas sp) 控制了环境方解石和浮游样品, Gammaproteobacteria控制了电极样品10。微生物菌株在环境和电极样品间的差异富集, 为进行观察实验的微生物活动提供了支持。这是进一步支持通过最终隔离的电化学活性菌株从丰富的Firmictutes OTUs 的雪松9。
图 1: 电化学系统.(a) 现场电化学系统的示意图图象, 以丰富环境中 EET 的细菌。碳毡阳极接受来自微生物的呼吸电子, 铂电镀碳毡的阴极催化氧还原。目前的生产由数据记录器 V 与电阻器的两端平行连接在一起进行监测. (b) 在雪松弹簧上设置例子, 阳极放在泉水底部和阴极附近的水表面。(c) 用塑料袋和岩石保护数据记录器和电阻。阳极的大小与图 2中所示的相同。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 与钛丝连接的碳毡电极.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 目前在双电极系统中观察到的生产周期为三月.使用 100 kΩ和1000Ω电阻的系统的数据显示在 (a) 中。将背景电流减去到初始当前值的零。面板 (b) 对应于面板 (a) 中的正方形。在面板 (a) 中所示的实验中观察到每日电流振荡。
图 4:营地泉区微生物群落序列分布。从滤水中提取的 dna (CampsiteSpring 浮游物) 或从池底抽取的1克方解石 (CampsiteSpring 方解石) 与从碳毡电极 (附着电极) 中提取的 dna 和从液相中的细胞中的 dna 相比较。电化学反应器 (电极浮游)。序列指定基于门Firmicutes和Proteobacteria的门级或类级标识。丰度基于总读取百分比。Proteobacterial血统的变化用虚线勾勒出来。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在本文的研究中, 我们展示了一个微生物联合体的富集, 与原位电流的生产联系在一起。目前, 该系统在短期和长期的时间尺度上支持微生物活性的观察模式。构建功能性双电极 (燃料电池型) 系统的关键步骤是识别和利用环境中具有稳定水位和氧浓度的位置。阴极在空气水界面接触氧气, 而阳极则保持在厌氧条件下, 电极电位差促进 EET 细菌的厌氧呼吸。
我们观察了环境电化学系统中的每日电流振荡, 而不是实验室反应器。因为在白天观察到了电流的波动--在黎明和黄昏之间观测到的最大和最小电流--阳光和/或温度的影响可以解释微生物电流产生的变化。测量温度、日照和/或其他环境变量可以进一步扩大对环境系统中微生物电子流量的控制和驱动因素的理解。另外, 添加元素来遮挡阳光可以帮助消除或减轻氧光合作用和/或潜在 photoreactions 对电极的影响, 这有助于更好地刺激最佳 EET 条件。然而, 其他环境因素的测量可以更好地阐明 EET 微生物的生态环境, 包括潜在的微生物群落相互作用, 以及微生物与环境之间的关系。
我们的双电极系统可能不仅丰富了阳极 respiring 细菌, 而且还有氧还原细菌, 从电子吸收中获得能量。虽然我们没有对阴极进行社区分析, 但在实验室三电极反应器中, 它们的微生物电子吸收能力是可测试的, 在氧气存在的情况下, 对所收集的阴极电极有负中毒。从阴极到阳极的电子受体的稳定浓度梯度使我们的方法在理论上也丰富了阴极 respiring 细菌。respiring 细菌的另一种富集方法是使用 Fe (0) 粒子或赠券作为固体电子捐助者5。虽然氢的产生也可能发生在表面, 成功的分离细菌, 可以直接从电极表面提取电子已报告5,16。
总之, 我们的方法成功地丰富了 EET 的联营集团使用一个自我维持的电化学系统在低生物量的环境。以前的几种耕作方法都不成功, 这促使我们制定了现场浓缩计划。在我们的系统中, 电流的输出反映了微生物的活性, 并导致了对该系统的微生物生态学的进一步假说。扩大 EET 微生物的分离以及环境的多样性, 将增强我们对 EET 机制的认识, 以及电子运输在环境微生物学中的作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们想感谢罗杰 Raiche 和大卫 McCrory 允许我们进入雪松和咨询的地点, 长期孵化。我们还感谢雪松现场船员在2013-2014 赛季: 四野铃木, 俊一, 格雷格 Wanger, 格雷森, 柏林和马修 Schechter。另外多亏了四野铃木和赫斯·贝克 Kuenen 的深入研究和培养支持。这项工作是通过向日本促进科学学会 (jsp) KAKENHI 赠款编号17H04969 和26810085的年轻科学家 a 和 B 资助的, 以及日本医学研究和发展局 (17gm6010002h0002) 提供的。美国提供的资金由美国全球海军研究办公室 (N62909-17-1-2038) 和黑暗能源生物圈调查中心 (德碧) (OCE0939564) 和美国宇航局天体生物学研究所-生活地下 (泥路) (NNA13AA92A)。这项工作的一部分是作为日本促进科学学会的一部分进行的: Kazuhito 桥本实验室的东京大学 PE15019 的短期博士后奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon felt sheet | n/a | n/a | Used for anode and cathode |
| Titanium wire | The Nilaco Cooporation | TI-451485 | Used to construct fuel cell system |
| Graphite epoxy | Electrolytica lnc. | n/a | Used to connect the electrodes and Ti wire |
| Drying oven | Yamato | DY300 | bake the electrode to solidify conductive graphite epoxy |
| Digital multi meter | Fluke | 616-1454 | to check the ohmic value of resistance |
| Dissolved oxygen probe | Sper Science | # 850045 | to check the oxygen concentration in the environments |
| Resistor | Sodial | Used to construct fuel cell system |
|
| Conducting wire | Pico | 81141s | Used to construct fuel cell system |
| Voltmeter and Data logger | T&D corporation | VR-71 | Used for data recording |
| Hydrogen Hexachloroplatinate(IV) Hexahydrate | wako | 18497-13-7 | Used for electropolation |
| Citric acid | Wako | 038-06925 | Used for electropolation |
| Sulfuric acid | Wako | 192-04696 | Used for electropolation |
| HCl | Wako | 083-01095 | Used for electrode washing |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for The Cedars Media (CMS) |
| CaCO3 | Wako | 030-00385 | Used for CMS |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for CMS |
| MgCl2 • 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for CMS |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Used for CMS |
| Na2SO4 | Wako | 194-03355 | Used for CMS |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | Used for CMS |
| CABS | SANTA CRUZ | SC-285279 | Used for CMS |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
| Anaerobic Chamber | COY | TypeB (Vinyl) | TO conduct experiments under anaerobic condition |
| Ultraclean DNA Extraction kit | MoBio |
References
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