Summary
敷地内の微生物濃縮またはその場で栽培技術は培養困難な微生物イチイ、特に低バイオマスまたは砂岩極端な環境からの分離を実現できます。ここでは、細胞外の電子輸送 (EET) ことができる微生物の系統を豊かにするための外部電源を使用せず電気化学のセットアップを説明します。
Abstract
嫌気性の呼吸 (細胞外の電子輸送 [EET] と呼ばれる) 不溶性の鉱物への電子輸送と相まって微生物のエネルギーの生産と特に多くの地下環境の持続性にとって重要と考えられています。水溶性ターミナル電子アクセプターを欠けています。EET-ことができる微生物は様々 な環境から分離されている、EET の細菌の多様性はまだ不十分な理解、特にサンプル困難な低エネルギーや地下などの極端な環境生態系。ここでは、ターミナルの呼吸系の電子受容体として、陽極を用いた EET できる細菌を豊かにするオンサイト電気化学システムについて述べる.この負極は、非生物的酸素還元反応を触媒できる陰極に接続されます。電極電位を安定させるため、ポテンシオスタットを使用する electrocultivation メソッドを使ってこの方法を比較すると、2 電極方式には、外部電源は不要です。ヒマラヤ スギ、カリフォルニア州北部の地上蛇紋岩化サイトのアルカリ池で利用当社敷地内の濃縮の例を提示します。ミネラル還元菌を育成しようとする前、成功しなかった可能性がありますこのサイトの低バイオマスの性質や微生物を減らす金属の低いの相対的な豊かさであります。私たち 2 電極濃縮を実装する前に、溶存酸素濃度の鉛直分布を測定しました。カーボンを配置することができましたこれを感じた陽極とプラチナめっき炭素水深嫌気性と好気性をサポートする陰極処理、それぞれ。敷地内のインキュベーション後我々 はさらに研究室では、陽極の電極を濃縮し、表面接続型と比較して明確な群集または通常杉で観測されたバイオ フィルムのコミュニティを確認しました。この強化はその後杉から最初無k 微生物の分離をもたらした。この敷地内の微生物濃縮法低バイオマスからまたはサンプルの生息地が困難な EET 対応の細菌の分離が向上する可能性があります。
Introduction
酸化還元酵素1を介した細胞の外側に電子を行う細胞の電子輸送 (EET) プロセスによって、ターミナル電子アクセプターとして固相鉱物を利用するいくつかのミネラルを減少させる微生物を示されています。EET は、微生物と無機物プロセスはまたエネルギー応用と微生物燃料電池2、電極合成3バイオレメディエーション4などの環境技術だけではなく、重要です。新しい EET できる細菌は非常に後に求められて、5の基礎または応用の観点から広く研究されています。ただし、のみこれらの細菌の生態学や生物地球化学的意義への洞察力は制限があります。EET-ことができる微生物の大半はアクア、堆積物、または嫌気性消化研究室6,の固体電子アクセプター MnO2Fe2O3構え電極などを使用してから次の濃縮分離されています。7,8しますただし、これらのメソッドは、しばしば似たようなコンソーシアムを生成し潜在的低エネルギーや低バイオマス システム、研究室や培養環境9に適応するこれらの微生物の能力をバイアスに支配する可能性がありますより敏感のイチイを欠場。.通常低いバイオマス環境で大量のサイトから水は細菌細胞を集中フィルターします。ただし、EET できる細菌はしばしば嫌気性代謝を展示し、酸素暴露がさらに阻害するまたはその栽培を防ぐためしたがって。酸素にさらすことがなく細胞を集中するオンサイト方法論代替 EET できる細菌の単離を促進できます。ここでは、外部電源を必要とせず、長期間以上 EET できる微生物を豊かにするための敷地内電気化学的手法のセットアップの詳細を報告します。
杉10、カリフォルニア州北部で高アルカリ性泉から electrocultivation 実験を使用してこの敷地内の電気化学的手法について述べる.ヒマラヤ スギのばねの地球化学は地下に蛇紋岩化作用の影響を受けます。温泉は、この機能的無酸素環境11EET を介して微生物のエネルギー生産の可能性を強調表示空気水インターフェイスの下で検出限界以下の酸素濃度と、高還元。ただし、(16 s rRNA またはメタゲノム解析) 杉から EET できる微生物をサポートする証拠はないです。この環境は、電子受容体、限られた端末電子アクセプター、ベア鉱物 (はすなわち、蛇紋岩化作用に起因する鉄などのミネラルを含む不溶性ミネラルを使用しての可能性として特徴づけられているにもかかわらず磁鉄鉱) に広範囲にわたって調査12されていません。我々 は、したがって、EET できる微生物 (図1)13を豊かにする、ヒマラヤ スギの高 pH 春キャンプ場春の電気化学的体制を展開しました。
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Protocol
1. 環境培養の 2 電極システムの構築
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陽極材料の調製と炭素の治療は、電極 (図 2) を感じた。
- 必要なバイオマス濃縮によって次元が同じに感じたカーボンをカットします。30 分 90% エタノールで各電極を浸す、少なくとも 8 回を各洗浄後 1 分間 sonicating、脱イオン水ですすぐ。
- 1 M HCl、各洗浄のため 12 時間の最小の攪拌で 2 回電極を洗浄します。
- 6-12 h または液体がなくなるまで暖かい (37 ° C) オーブンで電極を乾燥させます。
- ポリテトラフルオロ エチレン平板 (非粘着面) の製造元のプロトコルごとのグラファイトのエポキシを使用してチタン線に電極を接続します。
注: 好気性の腐食への高い耐性のためチタン線を使いました。 - 120 ° C 6 h で電極を焼きます。
- チタン線間の抵抗をテストし、炭素オーム計で感じ、ワイヤーとフェルト電極間抵抗は 5 ω 未満であることを確認します。
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炭素上の白金の electroplation を感じた陰極材料の調製用電極
- カーボン フェルト電極、ガラス容器で 12 h 最低 2 M コで 1.1 の手順で準備が水没します。
- 電気化学的洗浄も参照 (RE) と対向電極 (CE) を収容する 3 電極反応電極 (WE) を作業として電極を配置します。我々 は、接続日時、および CE ワニ口クリップでポテンシオスタットを。オーム計ですべての接続を確認します。
注意: Ag/agcl (飽和 KCl) を使用して電極と白金線として日時と CE、それぞれ。 - 身のこなしで 1.0 V 対.電極銀/塩化銀 600 の 2 M (全体の電極が水没する十分な量を使用して) 島を含む電解質溶液で s。(これはガラス製) 電気化学リアクターから電極を取り出します。脱イオン水で電極を各洗浄後 1 分間 sonicating 少なくとも 8 回すすぎます。少なくとも 12 時間の 100 ° C で電極を乾燥させます。
- めっき液を準備するには、2 M 硫酸の 1 L にクエン酸 100 g、硫酸ナトリウムの 5 g、リン酸二水素ヘキサクロロ白金酸 (IV) 六水和物 2 g を追加します。
- 重量を量る掃除手順 1.2.1–1.2.2 の準備として電極を乾燥し、1.2.3 のステップで準備としてめっき液で電極をカバーします。3 回 30 のめっき液で電極を超音波それぞれ秒。
- -0.2 で電極の電位を投げかけてによって電極を電気メッキ V vs. Ag/agcl 460 のめっき液で s。脱イオン水で 2 回電極を洗い、プラチナの廃棄物を破棄します。
- 20 sonicating に少なくとも 3 回、脱イオン水に電極を洗浄後各リンス s。さらに少なくとも 3 回の超音波処理なしをすすいでください。
- 少なくとも 12 h. 重量を量る電極炭素めっきプラチナを定量化する 100 ° C で乾燥の電極は、電極を感じた。
2. 建設および 2 電極システムの設置
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自然の環境で各電極の設置場所の調査。
- 溶存酸素 (DO) プローブを用いた酸素濃度を決定します。
- サイトでの深さを確認します。
注: 陽極の望ましい環境条件、一貫した水和と無酸素状態であった。必要な場合は、光からアノードをシールドで酸素の光合成の影響を削除します。陰極の配置のための理想的な条件が一貫して水和し、表面近傍の水好気します。必要に応じて、陰極の表面の接触を維持するためにフロートを取り付けます。
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燃料電池型 2 電極培養システムの構築
- 2 本の線をねじることによって (1 つの陽極と 1 つのプラチナ メッキの陰極) 電極から所望の長さの絶縁電線・ チタン線のリードを接続します。耐水性ワックスとの接続をカバーし、マリン グレード熱収縮チューブを使用してさらに保護します。
- 知られている抵抗の抵抗によって、カソードとアノード 2 本のワイヤを接続します。
注: 生物学的システムの低い抵抗器 (10 に 1,000 Ω) はより一貫性のある生物学的活性の結果します。必要な場合、高抵抗はネガティブ コントロールとしての生物学的活性を防ぐ。抵抗とリード線との間の任意の接続の腐食を防ぐためには、熱収縮チューブを保護します。
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測定電圧と時間の経過とともに温度ログです。
- 燃料電池反応から現在の生産を推定するため抵抗の両端間の電圧を確認してください。
- (製造元のプロトコルを見なさい) アノードとカソードにつながる適切に接続されたデータ ログ出力電圧計を使用して時間をかけて電圧差を測定します。
注: 同時温度データロギング オプション、ですが、この情報は現在ではなく、非生物的に生物学的変動の変化に関連を助けることができます。
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データロガーとの電気的接続の保護
- ロガーおよびすべての電気接続を雨から保護するために静止したおよび/またはプラスチック製の袋を使用します。
- ビニール袋や強風から守るためにしっかりとケーブルを修正します。図 1に例を示します。
3. 自然環境から電極サンプル集
- アノード サンプルの品質の酸素混入による破壊を防止するには、嫌気性条件下で電極を収集します。
- 電極のサンプルを収集する前に、少なくとも 30 分は、嫌気性の場所にテスト チューブを置きます。たとえば、試験管と入れて蓋別々 に内嫌気性ボトルに池の下部に。
- ワイヤー カッターを持つ電極からチタン鉛を削減、穏やかに、試験管に電極のサンプルを収集し、嫌気性ゾーンのシールします。サンプルを新鮮に保つために、サンプルのコレクションの直後に 4 ° C でサンプルを保存します。
注: また、電極が直接メディアに転送無酸素 (N2パージ)。(鈴木らによって記述された杉媒体を用いてください。11) には微生物の発育に十分な栄養素を提供するために水溶液の地球化学のサイトで測定され、改正から設計されました。このメディアは、異なる実験のため変更されました。
4. 現在の生産および DNA 分析のため実験室の確認
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電極にアタッチする微生物コンソーシアの現在の生産能力の電気化学的確認。
- サンプリングされた電極、白金線、Ag/agcl (飽和 KCl) と電気化学リアクター14,15を構築電極と、我々 は、CE、嫌気性チャンバーで、それぞれ。杉中可溶性炭水化物電子ドナーを含む電気化学リアクターを入力します。
- 0.2 で身のこなしは電極電位 V vs. Ag/agcl と現在の生産量。
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微生物の DNA を用いた電極サンプルからの DNA 抽出キット (材料の表を参照してください)。
- 70% のエタノールの嫌気グローブ ボックスの内側をきれいにしアルミ箔上に滅菌皿を置きます。
注: 嫌気性チャンバーはパラジウム触媒存在下で酸素を清掃する 〜 2-3% 程度の水素雰囲気を維持することによって 1 ppm 未満の酸素濃度を維持します。 - グローブ ボックス内電気化学リアクターを開き、皿、試料電極を入れて、DNA キットで使用される管にフィットするサイズにカットします。製造元のプロトコルを続行します。
- 70% のエタノールの嫌気グローブ ボックスの内側をきれいにしアルミ箔上に滅菌皿を置きます。
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Representative Results
現在の生産は、図 3に示すように、電圧データロガーを使用して約 3ヶ月間正常に測定しました。今回は、春に影響を与える強力な秋の雨のため、春の長い安定した潜伏期間だったので選ばれました。短い期間は、長い期間は、バイオマスのより強力な濃縮を提供することが、十分な可能性があります。電気化学的培養後 2 電極システムの接続を確認し、システムの腐食の証拠は認められなかった.高い現在生産は 100 kΩ 耐陰性対照と比較して低抵抗 (1,000 Ω) 2 電極システムで観察されました。最初の月で徐々 に現在生産増加は、成長、蓄積または次の別の 2 ヶ月間安定した現在の生産電極の表面に微生物の宿泊施設に提案するかもしれない。興味深いことに、現在の生産に電解濃縮の全期間を通じて約 24 h サイクルように発振。
微生物フローラの制御電極に付着することの現在の生産能力を確認するため 3 電極電気化学リアクターを用いた研究室で収集した陽極とクロノアンペロメトリーを行った。我々 は 0.4 V で電極の電位を構え様々 な炭水化物電子ドナーの存在下で対.標準的な水素の電極 (彼女)。毎日の振動は、もはや研究室で培養したときの陽極観察されました。これは、環境要因は微生物の現在の生産に影響し、観測振動した場合に発生を示唆しています。
群集の添付と浮遊電極非社会と豊かな電極の観察を比較すると、(図 4) のアーチの構造の明確な違いを見ました。電極の微生物コミュニティ高未培養系統として細菌のFirmicute系統から運用分類単位 (OTUs) で豊かになりました。プロテオ バクテリアの組成のシフトもみられています。具体的には、 Betaproteobacteria (主にSerpentinamonas の sp) 支配環境方解石と浮遊性サンプルとGammaproteobacteria電極試料10を支配しました。環境と電極試料間微生物系統の差動の濃縮は、走行観測実験微生物の活動をサポートします。これは杉の木9濃縮Firmictutes OTUs から電気化学的活性のひずみの究極の分離によりさらにサポートされていました。
図 1: 電気化学系。EET できる細菌環境を豊かにするオンサイト電気化学システムの (、) 回路図のイメージです。カーボン フェルトのアノードは微生物から呼吸の電子を受け取り、Pt めっきカーボン フェルトのカソード触媒の酸素還元。現在の生産は、春と陰極水表面近傍の下部に陽極をかけた杉春のセットアップ例 r. (b) 抵抗の両端と並列に V 接続データロガーによって監視されました。(c) データ ・ ロガーとプラスチックで抵抗器の保護袋と岩。陽極のサイズは、図 2に示すものと同じです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: カーボン チタン線に接続された電極を感じた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 現在の生産は、3 ヵ月の潜伏期間の 2 電極システムで観察された。100 kΩ と 1,000 Ω の抵抗を使用してシステムのデータは、(、) に表示されます。現在の背景を差し引いてゼロの最初の現在値。(B) パネルは、パネル () の広場に対応します。毎日電流振動パネル (a) に示す実験で観察されました。
図 4:キャンプ サイトの微生物群集シーケンス分布ばねをします。抽出した DNA フィルター水 (CampsiteSpring 浮遊性) または 1 g (CampsiteSpring 方解石添付) プールの下から撮影した方解石の比べると感じたカーボン電極 (電極接続) から抽出した DNA や DNA を細胞からの流体の相、電気化学リアクター (電極浮遊性)。シーケンスの指定は、支配的な門フィルミクテス門やプロテオ バクテリア門レベルまたはクラス レベルの id に基づいています。元素は、パーセントの合計読み込みに基づいています。点線でProteobacterial系統の変更のとおりです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
記述研究で微生物共同体、現在の生産現場の連動の濃縮を示す.現在サポート微生物活動のこのシステムの短期および長期の時間をかけて観測されたパターンをスケーリングします。機能 2 電極 (燃料電池型) システム構築のための重要なステップは識別して安定した水位と場所と環境中の酸素濃度を利用しました。陽極は嫌気性の条件の下で保管され、電極電位差 EET できる細菌の嫌気性の呼吸を促進する間、陰極は気液界面での酸素にさらされます。
研究所の原子炉ではなく環境の電気化学的システムで毎日電流振動を観測しました。この電流変動が認められたため、夜明けと夕暮れ - 日光の効果の認められた時間最大と最小の電流、昼間の間におよび/または温度が微生物の現在の生産の変化を説明できます。温度、日光および/またはその他の環境変数展開が可能さらにコントロールの理解と微生物の電子流のドライバー環境システム。また、追加の日光をブロック要素が削除または電極上の酸素の光合成および/または潜在的な光反応の影響を軽減するために助けることができるは、EET の最適の条件をより刺激するために役立つことができます。ただし、他の環境要因の測定より EET できる微生物は、潜在的な群集の相互作用、微生物と環境との関係などで生態学的なコンテキストを解明できます。
2 電極システムは潜在的陽極 respiring 細菌だけでなく電子吸収からエネルギーを収穫も酸素還元細菌を濃縮しました。陰極のコミュニティ分析行なっていません、微生物電子吸収能力は否定的酸素存在下で収集したカソード電極を投げかけて研究室 3 電極反応でテスト。陽極に陰極から電子アクセプターの安定した濃度勾配は、理論的に陰極 respiring 細菌も豊かにする私たちのメソッドを有効にします。陰極 respiring 細菌の代替濃縮法として固体電子ドナー5Fe(0) 粒子またはクーポンの使用であります。水素生産することができます表面で発生するも、電極から電子を直接抽出することができます細菌の分離を成功させるは報告された5,16をされています。
結論として、本手法は正常に EET 対応コンソーシアム低バイオマス環境で自立電気化学システムの使用を濃縮しました。いくつかの従来の栽培成功しなかった、つながった敷地内濃縮方式を開発します。我々 のシステムで電流出力微生物の活動を反映し、このシステムの微生物生態についてさらに仮説につながった。EET、メカニズムの私達の理解だけでなく、環境微生物学における電子輸送の役割を高める EET できる微生物の分離と同様、環境の多様性を拡大します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
私たちに、杉の木へのアクセスを許可しての長期潜伏場所のコンサルティングのロジャー ・ Raiche、デビッド ・ マクロリーを認識したいと思います。2013-2014 シーズン中にまた杉フィールド クルーに感謝: 志野鈴木、石井俊一、グレッグ ウェンジャー、グレイソン ・ チャドウィック、ボニータ ラム、マシュー シェクター。志野鈴木と洞察力に富んだ研究、サポートを培養するためのハイス ・ キューネンのおかげで追加します。この作品は、若手 A と B の科学振興費助成会から 17 H 04969 と 26810085 をそれぞれ番号と日本代理店の補助金を通じて医療研究開発 (17gm6010002h0002) のため賄われていた。米国の資金、暗いエネルギー生物調査 (C-デビ) (OCE0939564)、NASA 宇宙生物学研究所は-生命地下 (ない LU) (NNA13AA92A) 米国の世界的な海軍研究局 (N62909-17-1-2038)、センターによって提供されます。この作品の一部を日本社会の一員として科学振興のため行った: アネット ・ ロウ (PE15019) 東京大学橋本和仁研究室でポスドク研究員短期プログラム。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon felt sheet | n/a | n/a | Used for anode and cathode |
| Titanium wire | The Nilaco Cooporation | TI-451485 | Used to construct fuel cell system |
| Graphite epoxy | Electrolytica lnc. | n/a | Used to connect the electrodes and Ti wire |
| Drying oven | Yamato | DY300 | bake the electrode to solidify conductive graphite epoxy |
| Digital multi meter | Fluke | 616-1454 | to check the ohmic value of resistance |
| Dissolved oxygen probe | Sper Science | # 850045 | to check the oxygen concentration in the environments |
| Resistor | Sodial | Used to construct fuel cell system |
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| Conducting wire | Pico | 81141s | Used to construct fuel cell system |
| Voltmeter and Data logger | T&D corporation | VR-71 | Used for data recording |
| Hydrogen Hexachloroplatinate(IV) Hexahydrate | wako | 18497-13-7 | Used for electropolation |
| Citric acid | Wako | 038-06925 | Used for electropolation |
| Sulfuric acid | Wako | 192-04696 | Used for electropolation |
| HCl | Wako | 083-01095 | Used for electrode washing |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for The Cedars Media (CMS) |
| CaCO3 | Wako | 030-00385 | Used for CMS |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for CMS |
| MgCl2 • 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for CMS |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Used for CMS |
| Na2SO4 | Wako | 194-03355 | Used for CMS |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | Used for CMS |
| CABS | SANTA CRUZ | SC-285279 | Used for CMS |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
| Anaerobic Chamber | COY | TypeB (Vinyl) | TO conduct experiments under anaerobic condition |
| Ultraclean DNA Extraction kit | MoBio |
References
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