Summary
在这里, 我们详细介绍了用于评估 podosomes 在兼容薄膜上应用的突出力的实验技术, 从薄膜的制备到地形图像的自动分析。
Abstract
在许多生物学环境中, 动物细胞需要通过培养机械力来与环境相互作用。其中, 牵引力具有良好的特征, 但缺乏技术允许测量正交细胞所施加的凸出力。我们设计了一个实验装置来测量附着细胞在基板上施加的凸出力。在兼容的 Formvar 板上镀的细胞变形了这种基底, 由此产生的地形被原子力显微镜 (AFM) 在纳米尺度上映射。然后从基于突出细胞结构几何的变形剖面分析中提取力值。因此, 一个活细胞的个别凸出单位施加的作用力可以随着时间的推移而测量。这一技术将使研究的力量产生和它的调节, 在许多细胞过程涉及突出。在这里, 我们描述了它的应用, 以测量由人巨噬细胞形成的 podosomes 产生的突出力。
Introduction
动物细胞与基质和构成其环境的其他细胞在物理上相互作用1。这是需要他们迁移, 内化机构, 获取外部信息, 或区分。在这种过程中, 细胞必须产生机械力, 正如近年来许多研究表明的那样, 细胞产生力量和探测其环境的能力会影响其生物学行为, 例如扩散或分化2,3。反过来, 细胞力的测量是研究力量生成规律的主要辅助因素, 并了解它在细胞行为和组织命运4,5中的意义。
最近几年目睹了许多技术的发展, 以测量细胞在其环境中所能发挥的力量6。大多数这些都有助于揭示细胞在移动探针或变形基板上施加的牵引力。然而, 在细胞外环境中所涉及的机械力缺乏测量技术, 至今尚无良好的特征。
为了克服这一限制, 我们提出了一种测量施加正交到基体上的力的方法。它包括在一个薄的弹性薄板上的电镀活细胞, 可以在正交方向上变形, 使其能够测量基底变形的细胞和推断所涉及的力量。用原子力显微镜测量基片的形貌, 用纳米尺度的分辨率测定, 变形力的评估依赖于突出细胞结构的几何知识7,8,9。
在这里, 我们描述的设置和它的应用, 以测量 podosomes 产生的力量, 突出黏附结构形成的巨噬细胞为他们的间充质迁移在三维环境10,11, 12,13,14,15,16,17。我们相信, 这一技术将促进理解的力量产生和它的调节, 在许多细胞过程涉及突出。
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Protocol
1. Formvar 涂层网格的制备
- 清洁电子显微镜网格与纯丙酮和干燥他们在滤纸上。然后用纯乙醇清洁显微镜滑梯, 用透镜纸擦拭, 用鼓风机清除灰尘。
- 将乙醇清洗过的玻璃垂直放在薄膜浇铸装置的漏斗上, 其中含有下部 Formvar 的溶液。覆盖漏斗顶部。
- 将100毫升的 Formvar 溶液 (二氯化乙烯中的 0.5%) 与雾化灯泡泵浦, 直到水平达到滑动的两个以上。
- 在解决方案中保留幻灯片1分钟。
- 打开设备的阀门以在稳定的流中排出 Formvar 溶液。流速为10至15毫升/秒将产生一个 Formvar 膜 30-80 nm。薄膜的厚度是由 Formvar 溶液的浓度和排水速率决定的。
注: 通过将阀门慢慢打开, 通过排气阀排出压力, 可以控制排水速率。排水越快, 胶片越厚。在实践中, 由于难以预测薄膜厚度从 Formvar 流速, 我们准备了几批 Formvar 薄膜和控制其厚度的 AFM (见步骤 2)。 - 从腔室取出滑块, 并在滤纸上微妙地晾干, 以除去任何液体 Formvar。
- 用剃刀刀片从 Formvar 胶片上剪下一个20毫米 x 50 毫米的长方形。
- 用干净的蒸馏水填满烧杯, 慢慢地将幻灯片垂直地浸入水中漂浮在胶片上: 胶片应该漂浮在水面上。
- 将干丙酮清洗的网格放在胶片上, 面朝上发亮。
- 将圆形玻璃盖玻片 (直径12毫米) 放到几个网格上。此盖玻片将用于测量胶片厚度 (见步骤 2)。
- 覆盖一个显微镜幻灯片与一个白色的标签调整大小, 以适应它。将幻灯片垂直倾斜在浮动 Formvar 胶片的边框上, 直到整个胶片粘附在幻灯片上。用滤纸把多余的水从滑梯上取出, 让它在室温下一夜之间晾干。
2. 薄膜厚度的测量
- 用镊子把盖玻片周围的 Formvar, 从滑梯上分离出来。
- 用钢笔在盖玻片下标记网格的位置。
- 在标记的网格周围剪切 Formvar, 将其与盖玻片分离。因此, 在剩余的 Formvar 板上会有一个洞, 这将允许测量胶片的厚度。用 PBS 覆盖盖玻片, 并将其放在显微镜上的玻璃滑梯上。
- 在 AFM 玻璃块上安装氮化硅悬臂, 确保金色条纹不被弹簧的尖端覆盖。
注意: 悬臂的灵敏度和弹簧常数应该以前在 PBS 中校准过。 - 将玻璃块安装到 AFM 模块上, 然后将该模块放到显微镜上。
- 将 Formvar 涂层的盖玻片放在观察室上, 并盖上500µL PBS。
- 用 AFM 在接触模式和 0.5 nN 力设定点扫描 Formvar 板孔的边界。
- 使用玻璃盖玻片表面作为高度测量的参考, 并评估 Formvar 厚度为剖面的高度 (每 Formvar 批次至少执行10次测量)。
3. 在网格上播种细胞
- 在无菌罩下, 在盖玻片上放置一个带 (12 毫米 x 3 毫米) 的双面胶带。
- 用镊子剪掉一个 Formvar 的网格, 把它倒在胶条上 (只有网格的边缘需要附着在胶带上)。Formvar 电影需要面对盖玻片。
- 把这个设备放在一个文化中。
- 放置一个10µL 滴 RPMI 没有 FCS 含有 104巨噬细胞分化为人单核细胞16。
注意: 确保不要用吸管尖接触网格, 以防止损坏 Formvar 涂层。 - 孵育30分钟 (37 °c, 5% CO2) 让细胞坚持。
- 用2毫升的含10% 的 RPMI 填充井。
- 在37摄氏度和 5% CO2上孵化设备2小时, 让细胞在 AFM 观察之前坚持。
4. Podosome 诱发变形的地形测量
- 将两条双面胶带贴在玻璃底培养皿上。
注: 两条线之间的距离应小于网格直径。 - 小心地从胶带上分离出与巨噬细胞电镀的格子。
- 将网格倒置, 使单元格面对玻璃, 并将栅格粘在两条粘合带之间。
- 固定网格与两个新的双面胶条: 网格将因此被夹在两个胶条之间, 使网格的中心区域可进入 AFM 尖端。
注意: 确保网格是固定的, 而不是扭曲的;否则, AFM 悬臂可能无法接近 Formvar 表面。 - 用2毫升预加热的37°c 培养基 (RPMI 和 10% FCS) 填充培养皿, 辅以10毫米 HEPES (pH 7.4)。
- 将养殖盘放在37摄氏度的盘子加热器上。
- 在 AFM 阶段安装碟式加热器。
- 让系统稳定在37摄氏度。
- 在接触模式与 0.5 nN 力量, 使第一个全局图像定位 podosomes, 然后扫描 Formvar 地形在3赫兹与大约 20 nm 大像素。
注意: 避免在网格边缘附近进行扫描。
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Representative Results
上述协议描述了如何准备实验设置, 以量化在 Formvar 基板上应用巨噬细胞 podosomes 的突力。这是使用 AFM 实现的, 如图 1所示。
利用 JPK 数据处理软件对 podosomes 下凸起的地形图像进行分析时, 应独立地从每条扫描线中减去三度多项式拟合。可以通过在图像侧面添加 z 色刻度来评估 podosome 引起的颠簸的最大高度。在以 TIFF 格式导出后, 将使用专用的自制 ImageJ 宏在线8进一步分析地形图像。此宏位于校正高度图像上的凸起, 并根据给定的参数生成一个力图 (图 2): Formvar 膜厚度和 podosome 环半径。此外, 宏还会生成一个文本文件, 其坐标、高度和计算力值为 Formvar 表面上检测到的凸起。
这一过程也适用于时间推移收购的情况。然后, 宏从中间时间点开始和向后跟踪每个凸起, 如果出现疑问, 则请求用户验证。
图 1: 实验设置
实验装置示意图。细胞被播种在电子显微镜网格上, 涂上一层薄薄的 Formvar 膜, 网格被放置, 细胞朝下, 在培养皿内。当附着在基板上时, 巨噬细胞形成亚微米高度动态黏附结构叫 podosomes。在细胞下面的 Formvar 膜的地形, 然后用 AFM 成像。Podosome 在基体上施加力正交, 导致其表面凸起。
图 2: 基体变形和 podosomes 施加的力
地形的 Formvar 膜在背面的单元格显示偏转 (左面板) 和高度 (中间板, 颜色代码的高度)。在胶片上观察到的凸起对应于单个 podosomes 的变形。每个 podosome 应用的力由模型计算 (右面板, 每个点对应一个 podosome, 强制值是彩色编码的)。刻度条: 5 µm。
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Discussion
材料性能
可变形膜材料的选择, 在我们的案例中 Formvar, 需要满足一些要求。该材料必须是透明的可见光和展示有限的自动荧光, 以允许观察在明亮的领域和荧光显微镜。薄膜的粗糙度必须低于10纳米, 以避免任何地形对细胞黏附的影响, 并允许通过 AFM 成像清晰地观察细胞诱发的突起。最后, 根据杨氏模量和材料厚度的不同, 膜的刚度需要足够高, 以诱导 podosomes 的形成, 同时对 podosome 部位产生的典型应力保持一定的可变形性。大约10-100 帕。Formvar 材料, 用30-80 纳米薄膜制备, 是所有这些约束之间的一个很好的折衷。值得注意的是, 通过调整 Formvar 膜的厚度, 可以调整其刚度, 以研究 podosomes7的 mechanosensing 特性。
Formvar 制剂的重现性和质量
某些批次的 Formvar 目前在网格上折叠, 因此不可用: 这可能是预先看到的明亮的领域图像。在我们的经验中, 我们需要多个网格为一个条件, 因为有时安装的网格是不完美的, 网格移动或被扭曲。Formvar 薄膜的厚度需要适应预期的力。胶片越厚, 硬度越硬, 变形越低, 观察难度就越大。反之, 胶片越薄, 越易碎, 而不撕裂就越难操作。
悬臂梁受力对地形测量的影响
为了获得对薄膜变形的测量, 不影响 podosome 的纳米活动或用 afm 探针变形薄膜, 这对于在 afm 成像过程中施加的控制力至关重要。事实上, 在成像过程中施加过度的力可能会导致对凸出高度的高估, 从而引起凸出力的过高估计。换言之, 有必要限制这一力量远远低于突出的地点的失速力量。我们建议限制在成像过程中的应用力量, 以数以百计的微微牛顿。
凸出力评价模型
为了将 AFM 地形测量转换为力值, 需要定义边界条件, 并了解力应用的空间结构。在 podosomes 的情况下, 我们提出了一个模型的基础上, 目前的知识, 其分子组织, 并证实, 该模型提供变形剖面符合地形观测8。更确切地说, 我们建模了聚合垂直肌动蛋白花丝周围的致密核心, 围绕着一环的黏附蛋白作为一个中心模块推基板和外围模块拉动。用有限元模拟法确定了两个模块的基体变形, 从而产生了力-变形关系。由于这种数值方法, 我们对各几何参数对力-变形关系的影响进行了表征, 表明环形直径和衬底厚度需要精确测量。基体中凸起的高度h与一个 podosome 应用的力F之间的关系可以表示为f = C0 E/(1-节能2) e3/r2 h, 其中 E = 2.1 GPa 是杨氏模量 Formvar节能= 0.3 其泊松比7, C0为常数等于 2.7, e和r分别表示薄膜厚度和 podosome 半径8。对于每个条件, r的平均值是从 podosomes 的荧光图像中得到的。
凸力显微镜的应用
突力显微镜在巨噬细胞中有利可图地用于检测特定蛋白质对 podosome 力产生的重要性, 证明了 podosome 环18的力学作用, 揭示了力的时空相关性。在 podosomes8的网络中的近邻之间生成。
细胞被发现在几个生物过程中向它们的环境中凸出。侵袭性肿瘤细胞使用的突出结构称为 invadopodia, 这是必不可少的细胞外基质降解19。淋巴细胞通过内皮细胞20在 transcellular 渗出的过程中被显示为血管内皮。细胞相互作用的一些事例也依赖于细胞凸出的结构: 这是在内皮细胞上对 T 细胞进行抗原识别21, 以及引发细胞融合, 导致多核破骨蛋白或 myotubes22,23,24. 最后, 诸如吞噬功能在内的内部化过程使用基于细胞肌动蛋白的结构, 在目标体周围投射25。研究凸出结构产生的作用力, 一定有助于揭示这些过程中的机制。
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Disclosures
没有宣布利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢安娜 Labernadie, 纪尧姆 Charrière 和帕特里克 Delobelle 为这项工作的最初贡献, 并马修桑切斯和弗朗索瓦斯·汉普森 Viala 为他们的帮助, 视频拍摄和编辑。这项工作得到了研究所 (ANR14-CE11-0020-02)、la 基金会研究所 Médicale (FRM DEQ2016 0334894)、INSERM 计划癌症、图卢兹癌症和人类前沿科学计划 (RGP0035/2016) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
References
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