Summary
Her, detalje vi de eksperimentelle teknikker, der anvendes til at evaluere de fremspring kræfter, der podosomes anvendelse på en kompatibel film, fra forberedelse af filmen til den automatiserede analyse af topografiske billeder.
Abstract
I mange biologiske sammenhænge skal animalske celler interagere fysisk med deres miljø ved at udvikle mekaniske kræfter. Blandt disse, trækkraft styrker har været godt karakteriseret, men mangler teknikker tillader måling af fremspring styrker udøves af celler ortogonalt til deres substrat. Vi designede en eksperimentel setup at måle fremspring styrker udøves af vedhængende celler på deres substrat. Celler belagt på en kompatibel Formvar ark deformere dette substrat og den resulterende topografi er tilknyttet ved atomic force mikroskopi (AFM) på nanometer skala. Gældende værdier er derefter udvundet fra en analyse af den deformation profil baseret på geometrien af protrusive cellulære strukturer. Derfor kan de kræfter, der udøves af de enkelte fremspringende enheder af en levende celle måles over tid. Denne teknik gør det muligt studiet af styrkegenerering og dens regulering i de mange cellulære processer der involverer fremspring. Her beskriver vi dets anvendelse til at måle de protrusive styrker genereret af podosomes dannet af menneskelige makrofager.
Introduction
Animalske celler interagere fysisk med matrix og de andre celler, der udgør deres miljø1. Dette er nødvendigt for dem at migrere, internalisere organer, erhverve eksterne oplysninger, eller differentiere. I sådanne processer, cellen skal generere mekaniske kræfter og som talrige undersøgelser har vist i de seneste år, evne til en celle for at generere styrker og sonde omgivelserne påvirker dens biologiske opførsel, lede f.eks spredning eller differentiering2,3. Igen, er måling af cellulære styrker en stor støtte til at undersøge regulering af styrkegenerering og forstår dets konsekvenser i celle adfærd og væv skæbne4,5.
De seneste år har været vidne til udviklingen af mange teknikker til at måle de kræfter, som en celle kan øve på dens miljø6. Fleste af disse har været medvirkende til at afsløre trækkraften styrker at celler udøve som de trækker på mobile sonder eller en deformerbar substrat. Men de mekaniske kræfter involveret i fremspring i det ekstracellulære miljø lider af en mangel på standardiserede måleteknikker og er til dato ikke godt karakteriseret.
For at overvinde denne begrænsning, præsenterer vi en metode til at måle kræfter udøver ortogonalt til underlaget. Det består i plating levende celler på en tynd elastisk ark, som kan deformere i ortogonale retning, hvilket gør det muligt at måle substrat deformation af celler og udlede kræfter involveret. Substrat topografi er målt med nanoskala opløsning ved hjælp af atomic force mikroskopi og evalueringen af styrker fra deformation bygger på viden om geometri af protrusive cellestrukturer7,8, 9.
Her, beskrive vi setup og dens anvendelse til at måle de kræfter, der genereres af podosomes, protrusive vedhæftning strukturer dannet af makrofager for deres mesenchymale migration i tre-dimensionelle miljøer10,11, 12,13,14,15,16,17. Vi mener, at denne teknik vil fremme forståelsen af styrkegenerering og dens regulering i de mange cellulære processer der involverer fremspring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af Formvar-belagt gitre
- Ren elektronmikroskopi gitre med ren acetone og tør dem på filtrerpapir. Derefter rengøre et objektglas med ren ethanol, tørres af med en linse papir og fjerne støv med en blæser.
- Sted en ethanol-rengjort glas dias lodret i tragten af en film casting enhed indeholder en opløsning af Formvar i den nederste del. Dække toppen af tragten.
- Pumpe 100 mL Formvar opløsning (0,5% i ethylen dichloride) med forstøver pære, indtil niveauet når to tredjedele af diaset.
- Holde diasset i løsning for 1 min.
- Åbne ventilen på enheden til at dræne Formvar løsningen i en lind strøm. En væskehastighed på 10-15 mL/s vil give en Formvar film af 30-80 nm. Tykkelse af filmen bestemmes koncentrationen af Formvar løsning og dræning sats.
Bemærk: Dræning sats kan styres ved udluftning af trykket via luft-out ventil ved at åbne langsomt ventilen. Jo hurtigere dræning, jo tykkere film. I praksis, fordi det er vanskeligt at forudsige filmtykkelse fra strømningshastighed Formvar vi forberede flere partier af Formvar film og styre deres tykkelse af AFM (Se trin 2). - Fjern diasset fra salen og tørre det fint på filtrerpapir at fjerne enhver flydende Formvar.
- Skære en 20 mm x 50 mm rektangel fra Formvar filmen med et barberblad.
- Fyld et bægerglas med ren destilleret vand og langsomt styrte diaset lodret i vandet til at flyde ud af filmen: filmen skal flyde på vandoverfladen.
- Sted tør acetone-rengjort gitre på filmen, skinnende ansigt.
- Placere en runde glas coverslip (Ø 12 mm) på nogle af gitrene. Denne coverslip vil tjene til at måle filmtykkelse (Se trin 2).
- Dække et objektglas med et hvidt klistermærke skaleres for at passe den. Dyp dias lodret på grænsen af den flydende Formvar film, indtil hele filmen klæber til diaset. Fjern overskydende vand fra dias med filtrerpapir og lad det tørre ved rumtemperatur natten over.
2. måling af filmtykkelse
- Skær Formvar omkring coverslip med pincet til at løsrive det fra diaset.
- Mark placeringen af gitteret under coverslip med en pen.
- Skær Formvar omkring det markerede gitter for at frigøre det fra coverslip. Der vil derfor være et hul i den resterende Formvar ark, som vil gøre det muligt for at måle filmtykkelse. Dække coverslip med PBS og placere den på et glas dias på mikroskopet.
- Montere en silicon nitride cantilever på AFM glas block, og sørg for den gyldne stribe ikke er omfattet af spidsen af foråret.
Bemærk: Den følsomhed og foråret konstant af cantilever bør har tidligere været kalibreret i PBS. - Mount glas block på modulet AFM, og derefter placere modul på mikroskopet.
- Placer Formvar-belagte coverslip på observation kammer og dække det med 500 µL af PBS.
- Skan kanten af hullet i Formvar ark ved hjælp af AFM i kontakt tilstand og en 0,5 nN kraft sætpunktet.
- Bruge glas coverslip overflade som reference for højde målinger, og vurderer Formvar tykkelse som højden af tværsnit (udføre mindst 10 målinger pr. Formvar parti).
3. Seedning celler på gitre
- Under en steril hætte, sætte en strimmel (12 mm x 3 mm) af dobbeltsidet tape på en coverslip.
- Klip et Formvar-belagt gitter med pincet og sætte det op og ned på den selvklæbende strimmel (kun randen af gitteret skal være knyttet til båndet). Filmens Formvar behov til ansigt til coverslip.
- Sætte enheden i en kultur godt.
- Placere en 10 µL dråbe af RPMI uden FCS indeholdende 104 makrofager differentieret fra humane monocytter16.
Bemærk: Sørg for ikke at røre gitter med pipette tip til at forhindre skadelige Formvar belægning. - Inkuber i 30 minutter (37 ° C, 5% CO2) at lade celler overholde.
- Fyld godt med 2 mL af RPMI indeholdende 10% FCS.
- Inkuber enhed i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2 at lade celler overholde før AFM observation.
4. topografi målinger af Podosome-induceret deformationer
- Stick to strimler af fordoblet-sidet tape på glas bund petriskål.
Bemærk: Afstanden mellem de to strimler bør være mindre end gitter diameteren. - Forsigtigt frigøre gitteret belagt med makrofager fra selvklæbende tape.
- Vende nettet på hovedet for at få cellerne vender glasset og holde gitter mellem de to selvklæbende strimler.
- Fix gitter med to nye strimler af fordoblet-sidet lim.: gitteret vil således blive klemt inde mellem to selvklæbende strimler, forlader det centrale område af gitteret tilgængelige til AFM tip.
Bemærk: Sørg for, at nettet er godt fast og ikke snoet; ellers AFM cantilever muligvis ikke at nærme sig Formvar overfladen. - Fylde petriskål med 2 mL af næringssubstratet forvarmet 37 ° C (RPMI med 10% FCS) suppleret med 10 mM HEPES (pH 7,4).
- Placere kultur parabol på et 37 ° C parabol varmeapparat.
- Installere parabol varmelegeme på stadiet AFM.
- Lad systemet stabiliseres ved 37 ° C.
- Kontakt tilstand med en 0,5 nN kraft, gør et første globale billede til at finde podosomes og derefter scanne Formvar topografi på 3 Hz med en ca. 20 nm-store pixel.
Bemærk: Undgå scanning nær kanten af gitteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ovennævnte protokol beskriver hvordan du forbereder det eksperimentelle setup til at kvantificere fremspring kræfter af makrofag podosomes på en Formvar substrat. Dette er opnået ved hjælp af AFM og er illustreret i figur 1.
Når du analyserer en topografiske billede af buler under podosomes ved hjælp af KURIA databehandling software, skal et tredje grad polynomium passer trækkes fra hver scanning linje uafhængigt. Den maksimale højde for podosome-induceret bump kan vurderes ved at tilføje en z farveskalaen på den side af billedet. Efter at være eksporteret i TIFF-format, analyseres topografiske billedet yderligere ved hjælp af en dedikeret hjemmelavet ImageJ makro tilgængelig online8. Denne makro lokaliserer buler på korrigerede højde billedet og giver en kraft kort (figur 2) i henhold til betragtning parametre: Formvar film tykkelse og podosome ring radius. Derudover giver makroen også en tekstfil med de koordinater, højde og beregnede kraft værdi for hvert registrerede bule på Formvar overflade.
Denne proces gælder også for time-lapse erhvervelser. Makroen derefter spor hver bule fra det midterste gang punkt fremad og baglæns, anmoder om brugervalidering, hvis der opstår nogen tvivl.
Figur 1 : Eksperimentel opsætning
Skematisk illustration af opsætningen af eksperimenterende. Cellerne udsås på en elektron mikroskopi gitter overtrukket med en tynd, kompatibel Formvar film og gitteret er placeret, celler nedad, inde i en petriskål. Når tilslutte sig et substrat, danne makrofager submicron højdynamiske vedhæftning strukturer, der kaldes podosomes. Formvar film under cellerne topografi er derefter afbildet ved hjælp af AFM. Podosome anvende styrker ortogonale til underlaget, hvilket resultere i buler på dens overflade.
Figur 2 : Substrat deformation og kræfter udøver af podosomes
Topografi af filmens Formvar på bagsiden af cellerne viser afbøjning (venstre panel) og højde (midterste panel, farvekoder for højde). Buler observeret på filmen svarer til deformationen af individuelle podosomes. Den kraft, som hver podosome er evalueret af modellen (højre panel, hver plet svarer til en podosome og gældende værdier er farvekodede). Skalalinjen: 5 µm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Materialeegenskaber
Valget af materiale til den deformerbare membran, i vores tilfælde Formvar, skal opfylde nogle krav. Materialet skal være transparent for synligt lys og udviser begrænset auto fluorescens for at tillade observationer i lysfelt og Fluorescens mikroskopi. Ruhed af den tynde film skal være et stykke under 10 nm til at undgå enhver topografiske effekt på celle vedhæftning og tillade klare observation af de celle-induceret fremspring af AFM billeddannelse. Endelig, stivhed af membranen, som afhænger af unge modulus og tykkelsen af materialet, skal være høj nok til at fremkalde dannelse af podosomes samtidig med at nogle observerbare deformability for de typiske understreger genereret på podosome sites der er omkring 10-100 kPa. Formvar materiale, forberedt i tynde film af 30-80 nm er et godt kompromis mellem alle disse begrænsninger. Det er værd at bemærke, at ved tuning af Formvar membran tykkelse, dens stivhed kan justeres for at studere Epitelcellers respons egenskaber af podosomes7.
Reproducerbarhed og kvaliteten af Formvar forberedelse
Nogle partier af Formvar præsentere folder på nettet og er derfor ubrugelige: Dette kan ses på forhånd på lysfelt billeder. Vores erfaring, vi har brug for flere gitre til én betingelse fordi undertiden montering af gitteret er ikke perfekt og gitteret bevæger sig eller bliver snoet. Tykkelsen af Formvar filmen skal tilpasses til den forventede kraft. Jo tykkere den film, den stivere itâ, men jo lavere deformationer vil være, at observation vanskeligere. Omvendt, jo tyndere filmen, de mere skrøbelige det og vanskeligere at manipulere uden at rive det.
Indflydelse af den kraft, som cantilever på topografi målinger
For at få en måling af film deformationen uden enten påvirker nanomechanical aktivitet af podosome eller deformere filmen med AFM probe, er det afgørende at kontrol styrker anvendes under AFM billeddannelse. Faktisk kan gælder overdreven kraft under imaging føre til en overvurdering af fremspring højden og dermed fremspring kraft. Med andre ord, er der behov for at begrænse denne kraft langt under stall kraft af webstedet fremspringende. Vi anbefaler, at begrænse de anvendte styrker under imaging rundt til et par hundrede af pico-Newton.
Model for fremspring kraft evaluering
For at konvertere AFM topografiske målinger i kraft værdier, er det nødvendigt at definere randbetingelser og kender den rumlige konfiguration af force application. I forbindelse med podosomes, vi har foreslået en model baseret på den nuværende viden om dens molekylære struktur og bekræftet, at denne model leveret deformation profiler overensstemmelse med topografiske observationer8. Mere præcist modelleret vi tætte kernen af polymeriserende lodrette actin filamenter omgivet af en ring af adhæsion proteiner som en central modul skubbe substratet og en perifer modul trækker på det. Substrat deformation af disse to moduler handler blev bestemt ved hjælp af finite element simuleringer, fører til et kraft-deformation forhold. Takket være denne numeriske tilgang karakteriseret vi hver geometriske parameter indflydelse på relationen kraft-deformation viser at ring diameter og substrat tykkelse skulle måles præcist. Forholdet mellem højde h om en bule i underlaget og kraft F anvendes af en podosome kan udtrykkes som F = C0 E / (1-υ2) e3/r2 h, hvor E = 2.1 GPa er de unge modulus af Formvar og υ = 0,3 sin Poisson forholdet7, C0 er en konstant svarende til 2,7 og e og r henholdsvis betegne film tykkelse og podosome radius8. For hver betingelse, blev den gennemsnitlige værdi af r fremstillet af fluorescens billeder af podosomes.
Anvendelser af fremspring Force mikroskopi
Fremspring force mikroskopi var rentabelt bruges i makrofager at teste betydningen af specifikke proteiner på podosome styrkegenerering, demonstrere podosome ring18 mekanisk rolle og afsløre spatio-temporale korrelationer i kraft generation mellem nære naboer inden for netværket af podosomes8.
Cellerne er blevet fundet for at rager ind i deres miljø i flere biologiske processer. Invasive tumorceller bruge protrusive strukturer, der kaldes invadopodia, som er afgørende for ekstracellulære matrix nedbrydning19. Lymfocytter har vist sig at rager ind i endothelial celler under deres transcellular diapedesis gennem endotelet20. Nogle tilfælde af celle-celle interaktion også afhængige cellulære fremspringende strukturer: Dette er tilfældet for antigen anerkendelse af T celler i endothelial celler21, og til at indlede celle sammensmeltning, der fører til multinucleated osteoklaster eller myotubes 22 , 23 , 24. Endelig internalisering processer såsom fagocytose brug cellulære actin-baserede strukturer projektet omkring målet body25. Studerer de kræfter, der er genereret af fremspringende strukturer vil helt sikkert hjælpe kaste lys over mekanismerne på spil i disse processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne er Anna Labernadie, Guillaume Charrière og Patrick Delobelle taknemmelig for deres indledende bidrag til dette arbejde og Matthieu Sanchez og Françoise Viala for deres hjælp med video filme og redigere. Dette arbejde er blevet støttet af l'Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM planlægger kræft, Fondation Toulouse kræft og Human Frontier Science Program (RGP0035/2016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Paszek, M. J., et al. Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Gilbert, P. M., Weaver, V. M. Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
- Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying Forces in Cell Biology. Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).
- Labernadie, A., et al. Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes. Nature Communications. 5, 5343 (2014).
- Proag, A., et al. Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors. ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).
- Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking. Methods. 94, 75-84 (2016).
- Cougoule, C., et al. Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis. Blood. 115, 1444-1452 (2010).
- Cougoule, C., et al. Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments. European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).
- Guiet, R., et al. Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A. Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).
- Maridonneau-Parini, I. Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration. Immunology Review. 262, 216-231 (2014).
- Park, H., et al. Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function. Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).
- Van Goethem, E., et al. Macrophage Podosomes Go 3d. European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).
- Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures. Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).
- Verollet, C., et al. Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages. Blood. 125, 1611-1622 (2015).
- Bouissou, A., et al. Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring. ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).
- Lizarraga, F., et al. Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells. Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).
- Carman, C. V., et al. Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes. Immunity. 26, 784-797 (2007).
- Sage, P. T., et al. Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells. Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).
- Sens, K. L., et al. An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion. Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).
- Takito, J., et al. The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts. Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).
- Shilagardi, K., et al. Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion. Science. 340, 359-363 (2013).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
