Summary
Qui, abbiamo dettaglio le tecniche sperimentali utilizzate per valutare le forze di protrusione che podosomes si applicano su una pellicola compatibile, dalla preparazione del film per l'analisi automatizzata delle immagini topografiche.
Abstract
In numerosi contesti biologici, cellule animali hanno bisogno di interagire fisicamente con il loro ambiente attraverso lo sviluppo di forze meccaniche. Tra questi, le forze di trazione sono stati ben caratterizzate, ma c'è una mancanza di tecniche che permettono la misurazione delle forze protrusione esercitata dalle cellule ortogonalmente al loro substrato. Abbiamo progettato un setup sperimentale per misurare le forze di protrusione esercitate dalle cellule aderenti il loro substrato. Cellule piastrate su un foglio di Formvar compatibile con questo substrato di deformazione e la topografia risultante è mappata per microscopia a forza atomica (AFM) su scala nanometrica. I valori di forza vengono quindi estratti da un'analisi del profilo deformazione basato sulla geometria delle strutture cellulari protrusive. Quindi, le forze esercitate dalle singole unità sporgente di una cellula vivente possono essere misurate nel tempo. Questa tecnica consentirà lo studio della generazione di forza e la sua regolamentazione in molti processi cellulari che coinvolgono la protrusione. Qui, descriviamo la sua applicazione per misurare le forze protrusive generate da podosomes formata dai macrofagi umani.
Introduction
Cellule animali interagiscono fisicamente con la matrice e le altre cellule che costituiscono il loro ambiente1. Ciò è necessario per loro di migrare, interiorizzare corpi, acquisire informazioni esterne o differenziare. In tali processi, la cella deve generare forze meccaniche e, come numerosi studi hanno dimostrato negli ultimi anni, la capacità di una cellula di generare forze e sonda ambiente influenza il comportamento biologico, dirigendo per esempio proliferazione o differenziazione2,3. A sua volta, la misurazione delle forze cellulare è un aiuto importante per studiare la regolazione della forza di generazione e capire la sua implicazione nella cella comportamento e tessuto destino4,5.
Ultimi anni hanno visto lo sviluppo di numerose tecniche per misurare le forze che una cella può esercitare sul suo ambiente6. La maggior parte di questi è stati strumentale nel rivelare che la trazione delle forze che cellule esercitano come si tirano su sonde mobili o un substrato deformabile. Tuttavia, le forze meccaniche coinvolte in protrusione nell'ambiente extracellulare soffrono di una mancanza di tecniche di misurazione e sono fino ad oggi non è ben caratterizzato.
Per ovviare a questa limitazione, presentiamo un metodo per misurare forze esercitate ortogonalmente al substrato. Essa consiste nella placcatura cellule viventi in un sottile foglio elastico che può deformare in direzione ortogonale, che permette di misurare la deformazione di substrato dalle cellule e dedurre le forze coinvolte. Topografia di substrato è misurata con risoluzione nanometrica mediante microscopia a forza atomica e la valutazione delle forze di deformazione si basa sulla conoscenza della geometria delle strutture cellulari protrusiva7,8, 9.
Qui, descriviamo l'installazione e la sua applicazione per misurare le forze generate dal podosomes, strutture di adesione protrusiva formate dai macrofagi per la loro migrazione mesenchimale in ambienti tridimensionali10,11, 12,13,14,15,16,17. Noi crediamo che questa tecnica avanzerà la comprensione della creazione delle forze e la sua regolamentazione in molti processi cellulari che coinvolgono la protrusione.
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Protocol
1. preparazione di griglie rivestite con Formvar
- Pulire le griglie di microscopia elettronica con acetone puro e farle asciugare su carta da filtro. Quindi pulire un vetrino da microscopio con etanolo puro, pulire con una carta per lenti e rimuovere la polvere con un soffietto.
- Posto un vetrino pulito etanolo verticalmente nell'imbuto di un dispositivo di fusione pellicola contenente una soluzione di Formvar nella parte inferiore. Coprire la parte superiore dell'imbuto.
- Con la lampadina atomizzatore pompa 100 mL di soluzione di Formvar (0,5%, dicloruro di etilene) fino a quando il livello raggiunge due terzi della diapositiva.
- Mantenere il vetrino nella soluzione per 1 min.
- Aprire la valvola del dispositivo per drenare la soluzione di Formvar in un flusso costante. Una portata di 10 a 15 mL/s produrrà un film Formvar di 30-80 nm. Lo spessore del film è determinato dalla concentrazione della soluzione Formvar e per il tasso di drenaggio.
Nota: Il tasso di drenaggio può essere controllata scaricando la pressione tramite la valvola aria aprendo lentamente la valvola. Il più veloce il drenaggio, il più spesso il film. In pratica, perché è difficile da predire lo spessore del film dalla portata Formvar, prepariamo diversi lotti di Formvar film e controllare il loro spessore di AFM (vedi passo 2). - Rimuovere il vetrino dalla camera e asciugarlo delicatamente su carta da filtro per rimuovere qualsiasi liquido Formvar.
- Tagliare un rettangolo di 20 x 50 mm dal film Formvar con una lama di rasoio.
- Riempire un bicchiere con acqua distillata e immergersi lentamente la diapositiva verticalmente in acqua per galleggiare fuori la pellicola: il film deve galleggiare sulla superficie dell'acqua.
- Luogo asciutto pulito acetone griglie sulla pellicola, splendente verso l'alto.
- Posizionare un coprioggetto in vetro tondo (Ø 12 mm) su alcune delle griglie. Questo vetrino coprioggetti servirà a misurare lo spessore del film (vedi passo 2).
- Coprire un vetrino da microscopio con un adesivo bianco ridimensionato per adattarlo. Immergere la diapositiva verticalmente al bordo del film Formvar galleggiante fino a quando l'intero film aderisce alla diapositiva. Rimuovere l'acqua in eccesso dal vetrino con carta da filtro e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente per una notte.
2. misurazione dello spessore del Film
- Tagliare il Formvar intorno il coprioggetto con pinzette per staccarlo dalla diapositiva.
- Segnare la posizione della griglia sotto il vetrino coprioggetto con una penna.
- Tagliare il Formvar intorno alla griglia contrassegnata per staccarla dal vetrino coprioggetti. Pertanto non vi sarà un buco nello strato Formvar rimanente, che verranno permetterà di misurare lo spessore del film. Coprire il vetrino coprioggetto con PBS e collocarla su un vetrino sul microscopio.
- Montare un cantilever di nitruro di silicio sul mattone di vetro AFM, assicurandosi che la striscia dorata non è coperto dalla punta della molla.
Nota: La sensibilità e la costante elastica del cantilever dovrebbe avere precedentemente stati calibrati in PBS. - Montare il blocco di vetro sul modulo del AFM e quindi posizionare il modulo sul microscopio.
- Collocare il vetrino coprioggetto rivestite con Formvar sulla camera di osservazione e coprirlo con 500 µ l di PBS.
- Il bordo del foro nel foglio Formvar utilizzando AFM in modalità di contatto e un punto di regolazione forza di 0,5 nN la scansione.
- Utilizzare la superficie del vetrino coprioggetti di vetro come il riferimento per misure di altezza e valutare lo spessore di Formvar come l'altezza della sezione trasversale (eseguire almeno 10 misurazioni per ogni batch di Formvar).
3. cellule su griglie di semina
- Sotto una cappa sterile, mettere una striscia (12 x 3 mm) del nastro bi adesivo su un vetrino coprioggetti.
- Tagliare una griglia Formvar-rivestito con pinzette e metterlo a testa in giù sulla striscia adesiva (solo il bordo della griglia deve essere attaccata al nastro). Il film di Formvar deve affrontare il vetrino coprioggetti.
- Mettere il dispositivo in una cultura ben.
- Mettere una goccia di 10 µ l di RPMI senza FCS contenente 104 macrofagi differenziati da monociti umani16.
Nota: Assicurarsi di non toccare la griglia con la punta della pipetta per evitare di danneggiare il rivestimento di Formvar. - Incubare per 30 min (37 ° C, 5% CO2) che le cellule aderiscono.
- Riempire il pozzo con 2 mL di RPMI contenente 10% FCS.
- Incubare il dispositivo per 2 ore a 37 ° C e 5% di CO2 di lasciare le cellule aderiscono prima osservazione AFM.
4. topografia misure delle deformazioni indotte da Podosome
- Attaccare due strisce di raddoppiato-nastro biadesivo su un fondo di vetro capsula di Petri.
Nota: La distanza tra le due strisce dovrebbe essere inferiore al diametro di griglia. - Staccare con cura la griglia placcata con macrofagi dal nastro adesivo.
- Capovolgere la griglia al fine di avere le cellule rivolto verso il vetro e la griglia tra le due strisce adesive di bastone.
- Correzione della griglia con due nuove strisce di adesivo raddoppiato: la griglia sarà così essere intramezzata fra due strisce adesive, lasciando l'area centrale della griglia accessibile a punta dell'AFM.
Nota: Assicurarsi che la griglia è ben fissata e non attorcigliata; altrimenti il cantilever AFM potrebbe non essere in grado di avvicinarsi alla superficie di Formvar. - Riempire la capsula di Petri con 2 mL di terreno di coltura pre-riscaldata 37 ° C (RPMI con 10% FCS) completati con 10 mM HEPES (pH 7.4).
- Posizionare la piastra di coltura su un riscaldatore di piatto di 37 ° C.
- Installare il riscaldatore di piatto sul palco AFM.
- Lasciare che il sistema si stabilizza a 37 ° C.
- In modalità a contatto con una forza di 0,5 nN, fare una prima immagine globale per individuare podosomes e poi la scansione la topografia di Formvar a 3 Hz con un circa 20 nm-grande pixel.
Nota: Evitare l'analisi vicino ai bordi della griglia.
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Representative Results
Il protocollo di cui sopra viene descritto come preparare la messa a punto sperimentale di quantificare le forze di protrusione applicate dal macrofago podosomes su un substrato di Formvar. Questa operazione viene eseguita mediante AFM ed è illustrata nella Figura 1.
Quando si analizza un'immagine topografica di rigonfiamenti sotto podosomes utilizzando il software di elaborazione dati JPK, un polinomio di terzo grado in forma dovrebbe essere sottratto in modo indipendente da ogni linea di scansione. L'altezza massima di urti podosome-indotto può essere valutato mediante l'aggiunta di una scala di colore z sul lato dell'immagine. Dopo essere esportati in formato TIFF, l'immagine topografica è ulteriormente analizzato utilizzando un dedicato casalingo ImageJ macro disponibili online8. Questa macro individua rigonfiamenti sull'immagine corretta altezza e produce una forza mappa (Figura 2) secondo determinati parametri: raggio di pellicola spessore e podosome di anello di Formvar. Inoltre, la macro rende anche un file di testo con le coordinate, altezza e valore della forza calcolata per ogni rigonfiamento rilevato sulla superficie Formvar.
Questo processo si applica anche nel caso di acquisizioni di time-lapse. La macro quindi tracce ogni rigonfiamento dal punto medio tempo in avanti e all'indietro, richiesta di convalida dell'utente in caso di qualsiasi dubbio.
Figura 1 : Messa a punto sperimentale
Illustrazione schematica dell'apparato sperimentale. Le cellule sono seminate su una griglia di microscopia elettronica rivestita con una sottile pellicola Formvar conforme e la griglia viene inserita, cellule rivolto verso il basso, all'interno di una capsula di Petri. Quando aderendo ad un substrato, macrofagi formano strutture di adesione altamente dinamico di submicron chiamate podosomes. La topografia del film Formvar sotto le cellule è quindi Imaging utilizzando AFM. Podosome applicare forze ortogonali al substrato, che provocare rigonfiamenti sulla sua superficie.
Figura 2 : Deformazione di substrato e le forze esercitate dal podosomes
Topografia del film Formvar sul lato opposto delle cellule risultati deflessione (pannello di sinistra) e altezza (pannello centrale, codici colore per altezza). I rigonfiamenti osservati sulla pellicola corrispondono alla deformazione di podosomes individuali. La forza applicata da ogni podosome viene valutata dal modello (pannello di destra, ogni punto corrisponde a un podosome e i valori di forza sono color-coded). Barra della scala: 5 µm.
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Discussion
Proprietà del materiale
La scelta del materiale per la membrana deformabile, nel nostro caso Formvar, deve soddisfare alcuni requisiti. Il materiale deve essere trasparente alla luce visibile e presentano fluorescenza auto limitato per consentire osservazioni in campo chiaro e microscopia a fluorescenza. La rugosità del film sottile deve essere ben di sotto di 10 nm per evitare qualsiasi effetto topografica su adesione delle cellule e per consentire la chiara osservazione delle sporgenze indotta da cellula da formazione immagine AFM. Infine, la rigidità della membrana, che dipende dal modulo di Young e lo spessore del materiale, deve essere sufficiente per indurre la formazione di podosomes mantenendo alcuni deformabilità osservabile per lo stress tipico generato in siti podosome che sono intorno a 10-100 kPa. Formvar materiale, preparato in pellicole sottili di 30-80 nm è un buon compromesso tra tutti questi vincoli. Vale la pena notare che regolando lo spessore della membrana Formvar, sua rigidità può essere regolata per studiare le proprietà di mechanosensing di podosomes7.
Riproducibilità e qualità della preparazione di Formvar
Alcune partite di Formvar presentare pieghe sulla griglia di partenza e pertanto sono inutilizzabili: questo può essere visto in anticipo su immagini luminose del campo. Nella nostra esperienza, abbiamo bisogno di più griglie per una condizione perché a volte il montaggio della griglia non è perfetto e la griglia si muove o viene ritorto. Lo spessore del film Formvar deve essere adattato alla forza prevista. Lo spessore del film, il più rigido è, ma più basso le deformazioni sarà, rendendo più difficile osservazione. Al contrario, il più sottile il film, il più fragile è e più difficile da manipolare senza strapparla.
Influenza della forza applicata dal cantilever su misurazioni di topografia
Per ottenere una misura della deformazione pellicola senza che interessano l'attività nanomeccaniche del podosome o deformare il film con la sonda AFM, è fondamentale per le forze di controllo applicate durante la formazione immagine AFM. Infatti, l'applicazione di una forza eccessiva durante la formazione immagine può portare a una sovrastima dell'altezza della protrusione e quindi della forza di protrusione. In altre parole, c'è la necessità di limitare questa forza lontano sotto la forza di stallo del sito sporgente. Si consiglia di limitare le forze applicate durante la formazione immagine intorno ad alcune centinaia di pico-Newton.
Modello per la valutazione della forza di protrusione
Per convertire misure topografiche AFM in valori di forza, è necessario definire le condizioni al contorno e di conoscere la configurazione spaziale di applicazione della forza. Nel caso di podosomes, abbiamo proposto un modello basato sulla conoscenza attuale della sua organizzazione molecolare e verificato che questo modello fornito profili di deformazione coerenti con osservazioni topografiche8. Più precisamente, abbiamo modellato il nucleo denso di polimerizzazione filamenti di actina verticale circondati da un anello di proteine di adesione come un modulo centrale spingendo il substrato ed uno periferico tirando su di esso. Deformazione di substrato di questi due moduli che agisce è stata determinata utilizzando simulazioni agli elementi finiti, che conduce ad un rapporto di forza-deformazione. Grazie a questo approccio numerico, abbiamo caratterizzato l'influenza di ciascun parametro geometrico sul rapporto forza-deformazione, mostrando quello spessore di diametro e substrato anello dovuto essere misurata precisamente. Il rapporto tra l'altezza h di un rigonfiamento nel substrato e la forza F applicata da un podosome può essere espressa come F = C0 E / (1-υ2) e3/r2 h, dove E = 2.1 GPa è il modulo di Young di Formvar e υ = 0.3 suo Poisson ratio7, C0 è una costante pari a 2.7 ed e e r rispettivamente denotano film spessore e podosome raggio8. Per ogni condizione, il valore medio di r è stato ottenuto da immagini di fluorescenza di podosomes.
Applicazioni di microscopia a forza protrusione
Microscopia a forza protrusione è stato proficuamente utilizzata in macrofagi per testare l'importanza delle proteine specifiche sulla creazione delle forze podosome, dimostrano il ruolo meccanico del podosome anello18 e rivelare correlazioni spazio-temporali della forza generazione tra vicini all'interno della rete di podosomes8.
Le cellule sono state trovate per sporgere nel loro ambiente in diversi processi biologici. Le cellule del tumore invasivo utilizzano protrusive strutture chiamate Invadopodi, che sono essenziali alla matrice extracellulare degradazione19. I linfociti sono stati indicati per sporgere in cellule endoteliali durante il loro processo di diapedesi transcellulare attraverso l' endotelio20. Alcune istanze di interazione cellula-cellula si basano anche su cellulare sporgenti strutture: questo è il caso per il riconoscimento dell'antigene delle cellule di T su cellule endoteliali21e per l'avvio della fusione cellulare che conduce a multinucleated osteoclasti o a miotubi 22 , 23 , 24. Infine, processi di internalizzazione cellulare uso fagocitosi basati su actina strutture quel progetto attorno al bersaglio come corpo25. Studiando le forze generate da sporgenti strutture aiuterà certamente a far luce sui meccanismi in gioco in questi processi.
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Disclosures
Conflitti di interesse non dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori sono grati ad Anna Labernadie, Guillaume Charrière e Patrick Delobelle per il loro contributo iniziale di questo lavoro e di Matthieu Sanchez e Françoise Viala per il loro aiuto con riprese video e montaggio. Quest'opera è stata sostenuta dall'Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM piano cancro, Fondation Tolosa e Human Frontier Science Program (RGP0035/2016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
References
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