Summary
Здесь мы подробно экспериментальные методы, используемые для оценки силы выступа, которые podosomes применить на совместимый фильм, от подготовки фильма для автоматизированного анализа топографических изображений.
Abstract
В многочисленных биологических контекстах животных клеток необходимо физически взаимодействовать с окружающей их средой путем разработки механических сил. Среди них тяговой силы были хорошо изученных, но существует нехватка технологий, позволяя измерения силы выступ, оказываемое клетки ортогонально к их основанию. Мы разработали экспериментальной установки для измерения силы выступ, оказываемое адэрентных клеток на их поверхности. Клетки, покрытие на листе совместимый Formvar деформируют этот субстрат и результате топографии сопоставляется с атомно-силовой микроскопии (АСМ) в нанометровом масштабе. Затем значения извлекаются из анализ деформации профиля на основе геометрии выступающем клеточных структур. Таким образом силы, оказываемое отдельных выступающих единиц живой клетки может быть измерена с течением времени. Этот метод даст возможность изучения формирования сил и его регулирования во многих клеточных процессах, связанных с выступа. Здесь мы описываем его применение для измерения выступающем силы, порожденные podosomes, образованного человека макрофагов.
Introduction
Животных клеток физически взаимодействовать с матрицы и другие клетки, которые составляют их окружающей среды1. Это требуется для их переноса, усваивать органы, приобретать внешней информации или дифференцировать. В таких процессах, ячейка должна генерировать механических сил и, как показывают многочисленные исследования за последние годы, способность ячейки для создания сил и зонд окружающей среды влияет на его биологического поведения, например направляя распространения или дифференциация2,3. В свою очередь измерение сотовой сил является основной помощи изучить правила формирования сил и понять ее последствия в клетки тканей и поведение судьба4,5.
Последние годы стали свидетелями многочисленных методов для измерения силы, которые ячейки может оказать на ее окружающей среде6. Большинство из них играют важную роль в раскрытии что тяговых сил, что клетки оказывают как они тянут на мобильных зондов или деформируемые субстрата. Однако механических сил, участвующих в выступ в внеклеточной окружающую среду страдают от отсутствия методов измерения и являются на сегодняшний день не характерны.
Чтобы преодолеть это ограничение, мы представляем метод измерения силы оказываемого ортогонально к подложке. Он состоит в покрытие живых клеток на листе тонкой упругой, могут деформироваться в ортогональных направлении, что делает его возможным для измерения деформации подложки клеток и вывести силы, участвующие. Субстрат топографии измеряется с наночастицами резолюции с помощью атомно-силовой микроскопии и оценки сил от деформации опирается на знание геометрии выступающем клеточных структур7,8, 9.
Здесь мы описываем установку и его применение для измерения силы, порожденные podosomes, выступающем адгезии структуры, образованные макрофаги их мезенхимальных миграции в трехмерных средах10,11, 12,13,14,,1516,17. Мы считаем, что этот метод будет заранее понимание формирования сил и его регулирования во многих клеточных процессах, связанных с выступа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Formvar покрытием сетки
- Очистить сетки электронной микроскопии с чистым ацетоном и высушите их на фильтровальной бумаге. Затем очистить микроскопа с чистого этанола, протрите объектив бумаги и удалите пыль с вентилятором.
- Место очистке этанола стеклянное скольжение по вертикали в воронку фильм литья устройства, содержащего раствор Formvar в нижней части. Крышка в верхней части воронки.
- Насос 100 мл Formvar раствора (0,5% в дихлорэтана) с лампой атомайзера до тех пор, пока уровень достигнет двух третей слайда.
- Сохранить слайд в решении за 1 мин.
- Откройте клапан устройства для слива раствора Formvar в устойчивый поток. Скорость потока от 10 до 15 мл/сек даст Formvar фильм 30-80 Нм. Толщина пленки определяется концентрация раствора Formvar и скорость дренажа.
Примечание: Уровень дренаж может управляться вентиляции давления через клапан воздуха выход, медленно открытия клапана. Чем быстрее дренаж, тем толще фильм. На практике, потому что это трудно предсказать, толщина пленки от Formvar скорость потока, мы готовим несколько партий Formvar фильмов и контролировать их толщину AFM (см. шаг 2). - Удалить слайд из камеры и высушить его тонко на фильтровальной бумаге, чтобы удалить любые жидкости Formvar.
- Вырежьте прямоугольник 20 x 50 мм из Formvar фильма с лезвием бритвы.
- Заполнить стакан с чистой дистиллированной водой и медленно окунуться слайд вертикально в воду плавать от фильма: фильм следует плавают на поверхности воды.
- Место сухой очищены ацетон сетки на пленке, блестящие лицом вверх.
- Поместите круглые стекло coverslip (Ø 12 мм) на несколько сеток. Этот coverslip будет служить для измерения толщины пленки (см. шаг 2).
- Обложка микроскопа с белой наклейкой подогнан к размеру его. Погрузите слайд вертикально на границе плавающей Formvar фильма до тех пор, пока весь фильм придерживается к слайду. Удалите лишнюю воду из слайда с фильтровальной бумаги и дайте высохнуть на ночь при комнатной температуре.
2. Измерение толщины пленки
- Вырежьте Formvar вокруг coverslip с помощью пинцета, чтобы отсоединить его от слайда.
- Марк расположение сетки под coverslip с ручкой.
- Вырежьте Formvar вокруг отмеченные сетки, чтобы отсоединить его от coverslip. Поэтому будет отверстие в оставшихся Formvar лист, который позволит измерить толщины пленки. Обложка coverslip с PBS и поместите его на слайде стекло микроскопа.
- Смонтируйте консольные нитрида кремния на AFM стеклянный блок, убедившись, что золотой полосой не охватывается кончик пружины.
Примечание: Чувствительность и весной константа кантилевера должны ранее был откалиброван в PBS. - Смонтировать блок стекла на AFM модуль, а затем поместите модуль на Микроскоп.
- Место coverslip Formvar покрытием на камеры наблюдения и покрыть ее с 500 мкл PBS.
- Проверьте границы отверстия в Formvar листа с помощью AFM в режим контакта и набор силы 0.5 nN.
- Использовать coverslip поверхности стекла в качестве ссылки для измерения высоты и оценить толщину Formvar как высота сечения (выполнить по крайней мере 10 измерений в пакете Formvar).
3. Заполнение ячеек сетки
- Под капотом стерильные Положите полосы (12 мм x 3 мм)-двухсторонней клейкой ленты на coverslip.
- Вырезать из Formvar покрытием сетки с помощью пинцета и положить ее вверх вниз на клейкой лентой (только край сетки должен прилагаться к ленте). Formvar фильм должен противостоять coverslip.
- Хорошо положите устройство в культуре.
- Место 10 мкл капли RPMI без FCS, содержащие 104 макрофагов отличается от человека моноциты16.
Примечание: Убедитесь, чтобы не задеть сетки с кончиком пипетки для предотвращения повреждения покрытия Formvar. - Инкубируйте 30 мин (37 ° C, 5% CO2), чтобы позволить придерживаться клетки.
- Заполните вверх наилучшим образом с 2 мл RPMI, содержащие 10% FCS.
- Инкубируйте устройство для 2 ч при 37 ° C и 5% CO2 чтобы клетки присоединиться до AFM наблюдения.
4. топография измерений индуцированных Podosome деформаций
- Палка две полоски удвоилось сторонний Скотч на дно стеклянной чашке Петри.
Примечание: Расстояние между двумя полосками должно быть меньше, чем диаметр сетки. - Аккуратно отсоедините сетки покрытые макрофагов с клейкой лентой.
- Переверните сетке для того чтобы иметь клетки, сталкивается с стекла и придерживаться сетки между двумя клейкие полоски.
- Исправление, сетки с двумя новые полосы удвоилось сторонняя клея: сетки таким образом быть зажатой между двумя клейкие полоски, оставляя доступным для AFM кончик центральной области сетки.
Примечание: Убедитесь, что сетка хорошо фиксируется и не перекручены; в противном случае AFM консольные может быть не смогли подойти на Formvar поверхность. - Заполните чашку Петри с 2 мл питательной среды подогретую 37 ° C (RPMI с 10% FCS) дополнены 10 мм HEPES (рН 7,4).
- Место культуры блюдо на подогреватель блюдо 37 ° C.
- Установите обогреватель блюдо на сцене AFM.
- Пусть система стабилизации при 37 ° C.
- В режим контакта с силой 0.5 nN сделать первый глобальный образ для обнаружения podosomes и затем проверять Formvar рельеф на 3 Гц с приблизительно 20 Нм большой пиксель.
Примечание: Избегайте, сканирование по краям сетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Вышеупомянутый Протокол описывается подготовка экспериментальной установки для количественного определения силы выступ, применяемые макрофагов podosomes на подложке Formvar. Это достигается с помощью АСМ и проиллюстрирована на рисунке 1.
При анализе топографические изображения выпуклости под podosomes, используя программное обеспечение обработки данных JPK, третьей степени многочлена подходят должны быть вычтены из каждой строки самостоятельно. Максимальная высота podosome индуцированной шишки могут оцениваться путем добавления цветовой шкале z на стороне изображение. После экспорта в формат TIFF, топографические изображения далее анализируется с использованием выделенного домашний ImageJ макросов доступны онлайн8. Этот макрос находит выпуклины на исправленные высота изображения и дает силу карте (рис. 2) соответствии с заданными параметрами: Formvar пленка толщиной и podosome кольцо радиус. Кроме того макрос также создает текстовый файл с координат, высоты и значение вычисляемого силы для каждого обнаруженного выпуклость на поверхности Formvar.
Этот процесс также применяется в случае промежуток времени приобретения. Макрос затем отслеживает каждый выпуклость из точки среднего времени вперед и назад, с просьбой проверки пользователя в случае возникновения любых сомнений.
Рисунок 1 : Экспериментальная установка
Схематическая иллюстрация экспериментальной установки. Клетки являются семенами на сетке электронной микроскопии, покрытые пленкой Formvar тонкий, совместимые и сетки помещается, клетки, лицевой стороной вниз, внутри чашку Петри. При присоединении к подложке, макрофаги образуют субмикронных высокодинамичные адгезии структуры под названием podosomes. Рельеф Formvar фильма под клетки затем образы, используя AFM. Podosome применить силы ортогональных к подложке, что привести к выпуклости на его поверхности.
Рисунок 2 : Субстрат деформации и силы оказываемого podosomes
Рельеф Formvar фильма на обратной стороне клеток, показ отклонения (левая панель) и высота (средняя группа, цветовые коды для высоты). Выпуклости, наблюдается на фильм соответствуют деформации на отдельных podosomes. Усилие каждой podosome оценивается модель (правая панель, каждое пятно соответствует одной podosome и силы значения цветом). Линейки: 5 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Свойства материала
Выбор материала для деформируемых мембраны, в нашем случае Formvar, необходимо выполнить несколько требований. Материал должен быть прозрачным для видимого света и выставку ограниченное auto флуоресценции позволяющие наблюдений в светлые области и микроскопии флуоресцирования. Шероховатости тонкой пленки должны быть значительно ниже 10 Нм избежать любой топографический эффект на клеточной адгезии и позволить четкое наблюдение клетки индуцированной выступов на АСМ изображения. Наконец жесткость мембраны, которая зависит от модуля Юнга и толщину материала, должна быть достаточно высокой, чтобы побудить формирования podosomes при сохранении некоторых наблюдаемых деформируемости для типичных напряжений в podosome сайты которые являются вокруг 10-100 кПа. Formvar материал, подготовленный в тонких пленках Нм 30-80 представляет собой хороший компромисс между все эти ограничения. Стоит отметить, что настройки толщину мембраны Formvar, ее жесткость может регулироваться для исследования свойств mechanosensing podosomes7.
Воспроизводимость и качество подготовки Formvar
Некоторые пакеты Formvar складки на сетке и поэтому непригодными: это может рассматриваться заранее на светлые области изображения. В нашем опыте, мы должны несколько сеток для одного состояния, потому что иногда монтаж сетки не является совершенным и сетка движется или получает витая. Толщина пленки Formvar необходимо адаптировать к ожидаемой силы. Чем толще фильм, жестче, но ниже деформации будет, затрудняя наблюдения. И наоборот чем тоньше фильм, более хрупким это и более трудно манипулировать не разрывая его.
Влияние усилие консольно на топографии измерений
Чтобы получить измерения деформации фильм без затрагивающих наномеханические активность podosome или деформируя фильм с АСМ зонд, важно для контроля силами во время АСМ изображения. Действительно применение чрезмерной силы во время обработки изображений может привести к завышению выступ высотой и, таким образом, силы выступ. Другими словами существует необходимость в ограничении этой силы намного ниже стойло сил выступающие сайта. Рекомендуется ограничить прикладной силы во время визуализации вокруг нескольких сотен Пико Ньютонов.
Модель для оценки силы выступ
Чтобы преобразовать AFM топографических измерений в силу значения, это необходимо для определения граничных условий и знать пространственной конфигурации приложения силы. В случае podosomes мы предложили модель на основе текущих знаний его молекулярной организации и проверено, что эта модель обеспечивает деформации профили в соответствии с топографические наблюдения8. Более точно мы моделируется плотной ядро полимеризовать вертикальных актина нитей, окруженный кольцом протеинов адгезии как Центральный модуль, нажав субстрата и периферийного модуля, потянув на нем. Субстрат деформации этих двух модулей действуя был определен с помощью моделирования методом конечных элементов, ведущих к сила деформация отношения. Благодаря такой численный подход мы охарактеризовал влияние каждого геометрического параметра на отношениях сила деформация, показываю что кольцо диаметром и подложки толщиной, необходимо измерить точно. Отношения между высота h балджа в субстрат и силы F применяется один из podosome может быть выражен как F = C0 E / (1-υ2) e3/r2 h, где E = 2.1 ГПД является Юнга Formvar и υ = 0,3 его коэффициент Пуассона7,0 C постоянная равна 2,7 и e и r соответственно обозначают фильм толщины и podosome радиуса8. Для каждого условия среднее значение r был получен от флуоресценции изображений podosomes.
Применение силовой микроскопии выступ
Выступ силовой микроскопии прибыльно использовался в макрофагах проверить значение специфических белков на podosome формирования сил, продемонстрировать механические роль podosome кольцо18 и выявить пространственно временных взаимосвязей силы поколение между ближайшими соседями в рамках сети podosomes8.
Клетки были найдены выступать в их среде в нескольких биологических процессах. Инвазивные опухоли клетки используют выступающем структуры, называемые invadopodia, которые необходимы для деградации внеклеточного матрикса19. Было показано, что лимфоциты выступают в эндотелиальных клеток во время их transcellular диапедез через эндотелий20. Некоторые экземпляры ячеек взаимодействия также полагаются на сотовых выступающих конструкций: это дело для антигены клеток T на эндотелиальных клеток21и для начала синтеза клеток, что приводит к многоядерные остеокласты или myotubes 22 , 23 , 24. Наконец, интернализации процессы такие как фагоцитоз использования сотовых актин основе структуры проекта вокруг цели тела25. Изучая силы, создаваемой выступающие структур безусловно поможет пролить свет на механизмы играют в этих процессах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Отсутствие конфликта интересов объявил.
Acknowledgments
Авторы благодарны Анна Labernadie, Гийом Шарьер и Патрик Delobelle за их первоначальный вклад в эту работу и Matthieu Санчес и Франсуаза Viala за их помощь с видео съемки и редактирования. Эта работа была поддержана l'Agence Nationale de la исследований (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche сообщала (FRM DEQ2016 0334894), INSERM план рака, рака Тулуза Fondation и человека пограничной науки программы (RGP0035/2016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Paszek, M. J., et al. Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Gilbert, P. M., Weaver, V. M. Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
- Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying Forces in Cell Biology. Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).
- Labernadie, A., et al. Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes. Nature Communications. 5, 5343 (2014).
- Proag, A., et al. Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors. ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).
- Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking. Methods. 94, 75-84 (2016).
- Cougoule, C., et al. Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis. Blood. 115, 1444-1452 (2010).
- Cougoule, C., et al. Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments. European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).
- Guiet, R., et al. Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A. Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).
- Maridonneau-Parini, I. Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration. Immunology Review. 262, 216-231 (2014).
- Park, H., et al. Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function. Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).
- Van Goethem, E., et al. Macrophage Podosomes Go 3d. European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).
- Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures. Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).
- Verollet, C., et al. Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages. Blood. 125, 1611-1622 (2015).
- Bouissou, A., et al. Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring. ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).
- Lizarraga, F., et al. Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells. Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).
- Carman, C. V., et al. Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes. Immunity. 26, 784-797 (2007).
- Sage, P. T., et al. Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells. Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).
- Sens, K. L., et al. An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion. Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).
- Takito, J., et al. The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts. Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).
- Shilagardi, K., et al. Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion. Science. 340, 359-363 (2013).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
